KR20130107881A

KR20130107881A - 클라미디아 및 임균 유래의 표적 유전자를 동시에 증폭하고 검출하기 위한 멀티 플렉스 키트 및 이를 이용한 진단 방법

Info

Publication number: KR20130107881A
Application number: KR1020120030028A
Authority: KR
Inventors: 김민환; 이주희
Original assignee: 삼성테크윈 주식회사
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2013-10-02

Abstract

본 발명은 복수개의 외부 프라이머 세트, 복수개의 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 복수개의 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 이용하여 복수개의 표적핵산과 복수개의 신호 프로브를 동시에 증폭하고, 복수개의 표적핵산을 신속하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 종래 방법인 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 신속·정확하게 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 신호 프로브를동시에 증폭할 수 있어, 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환에 대한 감수성 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다.

Description

클라미디아 및 임균 유래의 표적 유전자를 동시에 증폭하고 검출하기 위한 멀티 플렉스 키트 및 이를 이용한 진단 방법{A multiplex kit for simultaneously amplifying and detecting target sequence from CT and NG and A method for determining using the same}

본 발명은 핵산과 신호 프로브의 등온 증폭방법 및 증폭된 신호 프로브를 이용한 핵산의 동시 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 두개 이상의 외부 프라이머 세트, 두개 이상의 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 두개 이상의 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 이용해서 두개 이상의 표적핵산과 신호 프로브를 동시에 증폭하여 표적핵산을 신속하게 검출하는 방법에 관한 것이다.

핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 데 있어서 매우 유용한 기술이다. 표적핵산에 대한 핵산 증폭기술의 높은 민감성은 감염성 질환 및 유전성 질환의 진단과 분석을 위한 유전자의 분리 기술 및 법의학적 측면에서 특정 핵산을 검출하는 기술에 발전을 가져왔다. 이러한 핵산 검출 방법을 기초로 매우 민감한 진단분석을 수행할 수 있는 방법들이 개발되어 왔다. 핵산의 검출은 DNA 가닥의 상보성과 in vitro에서 단일 가닥 핵산이 이중 가닥의 혼성화 분자를 형성하는 능력에 기인한 것으로, 상기 능력에 의하여 시료에서 특정 핵산을 검출할 수 있다.

핵산 검출에 사용되는 프로브는 핵산 시료에 존재하는 표적서열과 혼성화 될 수 있는 특정 서열로 구성된다. 상기 프로브는 화학물질, 면역-화학물질, 형광 또는 방사선 동위원소에 의해 판독된다. 대체로, 프로브는 표적핵산에 대한 상보적 서열을 가지는 짧은 단편의 핵산과 DNA 혼성화를 판독할 수 있는 형광물질이나, 비오틴 및 딕옥시제닌과 같은 표지 또는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.

그러나 상기와 같은 핵산 검출방법에 의해서는, 특히 염색체 DNA 상의 짧은 서열을 검출할 수 없으며, 카피 수가 낮고 야생형 유전자에 대한 변형된 대립유전자의 제한된 카피수를 해결하는데 한계가 있다. 핵산 검출방법의 다른 문제점으로는 표적서열, 화학물질, 또는 프로브와 다른 분자 또는 구조와의 물리적 상호작용을 제한하는 in vitro 또는 in situ의 환경조건과 관련이 있다.

표적핵산을 검출하기 위한 방법은 몇 가지 카테고리로 나뉠 수 있으며, 표적핵산을 증폭시키는 방법인 목표 서열의 증폭, 프로브 분자 자체를 증폭시키는 프로브 증폭, 각 프로브가 나타내는 신호를 복합 프로브 또는 연결 프로브 기술에 의해 증가시키는 신호 증폭이 있다.

In vitro 핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출 및 분석하는데 강력한 방법으로 사용되어 왔다. 그 중에서도 PCR(polymerase chain reaction)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 핵산의 증폭방법으로, 상보적 서열의 각 나선(strand)을 주형으로 사용하여, 프라이머에 의하여 핵산의 합성이 반복적으로 진행됨으로써, 상보적 서열의 각 나선의 복제본이 합성되는 것이다. PCR 과정을 수행하기 위해서는 미리 프로그램된 열 순환 장비(thermalcycling instrument)가 필요하다. 그러나 이 방법은 비용이 많이 들고, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 결과를 재현하기 위해서는 수행단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다.

그뿐 아니라, PCR 등의 열순환 과정을 사용하는 증폭방법은 각 사이클의 "표적" 온도에 도달하기 위해 열순환 블록을 필요로 하고, 열블럭이 표적온도에 도달하기 까지 지연 시간이 필요하므로 증폭반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하다는 단점이 있다.

또 다른 핵산증폭방법인 LCR(ligase chain reaction)은 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드가 표적핵산과 혼성화되고, 리가아제(ligase)에 의해 라이게이션된다. 이를 통하여 형성된 프로브(probe)는 상보적인 뉴클레오티드와 함께 온도-사이클링(temperature cycling)에 의해 증폭된다. 상기 LCR은 지금까지 개발된 핵산 증폭 기술 중에서 가장 높은 특이성을 가지며, 모든 식별 기작이 최적화되어 있기 때문에 가장 손쉽게 수행할 수 있는 방법이지만, 반응속도가 가장 느리고, 많은 수의 변형 프로브를 필요로 하는 단점이 있다.

또한, 상기 LCR 이외의 현재까지 제시된 다른 등온 표적핵산 증폭방법은 일정한 온도에서 핵산 증폭이 이루어지기 때문에 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 쉬운 장점이 있다. 그러나, 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되거나, 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다.

성병은 매일 50만 명 또는 20명당 1명꼴로 새로이 환자가 발생하며, 매년 전 세계적으로 1억 5천만 명 정도의 새로운 환자가 발생하는 것으로 추정되고 있다. 이 중 클라미디아(CT)와 임균(NG)에 의한 요로생식기 감염은 성병 중 가장 흔히 보고되는 질환들이며, 10대 후반에서 20대 초반에 호발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 적절한 치료 및 관리를 하지 않은 클라미디아와 임균에 의한 감염은 심각한 후유증을 유발할 수 있다. 그러므로 효율적인 예방을 위해서는 증상이 있는 감염자 뿐 아니라, 무증상 감염자들에 대한 클라미디아와 임균 감염의 선별 검사는 감염에 의한 합병증 및 후유증 방지와 계속적인 성접촉에 의한 전파 방지를 위해 중요하다.

무엇보다도 성병의 원인균은 그 종류가 다양하므로, 대량의 샘플을 효율적으로 스크리닝하기 위하여는 한번에 여러개의 원인균을 검출하는 방법이 필요하다. 따라서, 현재 검출 방법의 문제점을 극복하고 대량 스크리닝에 효율적인 방법을 연구하던 중 등온에서 여러개의 표적 핵산의 증폭이 가능하고, 여러개의 프로브 신호를 동시에 증폭할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

KR10-2009-41323A 초록 및 청구항 KR10-2009-57703A 초록 및 청구항

일 구체예는 (i) 제1 표적 DNA, (ii) 상기 제1 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 제1 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제1 반응혼합물, 및 (iv) 제2 표적 DNA, (v) 상기 제2 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (vi) 상기 제2 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제2 반응혼합물을 변성시키는 단계; 상기 단계에서 변성된 제1 반응혼합물 및 제2 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소, 상기 제1 외부 프라이머 세트와 제1 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제1 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브 및 제2 외부 프라이머 세트와 제2 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제2 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계; 및 상기 단계에서 증폭된 신호를 검출하여 표적 DNA의 존재여부 및 함량을 결정하는 단계를 포함하는 동시 검출방법을 제공한다.

또 다른 구체예는 서열번호 1 내지 4의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 외부 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트, 및 서열번호 9 및 10의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 포함하는 성병 진단용 멀티플렉스 증폭 키트를 제공한다.

일 양상은 다음의 단계를 포함하는 표적 DNA의 동시 검출방법을 제공하는 것으로서, (i) 제1 표적 DNA, (ii) 상기 제1 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 제1 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제1 반응혼합물, 및 (iv) 제2 표적 DNA, (v) 상기 제2 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (vi) 상기 제2 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제2 반응혼합물을 변성시키는 단계; 상기 단계에서 변성된 제1 반응혼합물 및 제2 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소, 상기 제1 외부 프라이머 세트와 제1 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제1 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브 및 제2 외부 프라이머 세트와 제2 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제2 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계; 및 상기 단계에서 증폭된 신호를 검출하여 표적 DNA의 존재여부 및 함량을 결정하는 단계를 제공한다.

상기 표적 DNA의 동시 검출방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, (i) 제1 표적 DNA, (ii) 상기 제1 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 제1 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제1 반응혼합물, 및 (iv) 제2 표적 DNA, (v) 상기 제2 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (vi) 상기 제2 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제2 반응혼합물을 변성시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 표적 DNA는 시료는 개체 또는 질병의 감염여부를 진단하기 위한 개체로부터 채취될 수 있으며, 또한 특정 신체 부위에서 직접 채취될 수 있다. 개체로부터 직접 수득된 DNA 일 수도 있으나, 시료에서 RNA를 수득하여, 역전사 효소로 증폭하여 얻은 cDNA로 제공되는 DNA 일 수 있다.

용어, "프라이머(primer)"는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 혼용될 수 있다. 상기 프라이머는 등온증폭 반응에서 DNA 합성을 시작하기 위한 시작점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이며, 상기 표적 DNA의 상보적인 영역과 혼성화된다.

또한, 상기 제1 또는 제2 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 외부 프라이머세트는 혼성 프라이머 세트보다 표적 DNA의 양 말단쪽에 가까운 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 5' 말단 DNA-RNA 부분이 표적 DNA 서열과 비상보적인 염기서열을 가지고, 3' 말단 DNA 부분이 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 32~66 염기로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 혼성 프라이머에서 DNA 부분의 길이가 각각 15~30 염기로 이루어지고, RNA 부분은 길이가 2~6 염기로 이루어질 수 있다.

상기 혼성 프라이머 세트는 외부 프라이머보다 표적 DNA의 중심에 가까운 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 상기 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있고, 표적핵산 서열에 상보적(complementary)이며, 15~30 염기를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 외부 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열은 혼성 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열과 인접한 서열(1~60 bp 차이)인 것이 바람직하며, 외부 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열은 혼성 프라이머와 상보적인 DNA 서열보다 표적 DNA 서열의 3' 말단쪽에 가까운 서열인 것이 바람직하다.

용어, "프로브(probe)"는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화 되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 30개의 뉴클레오티드 범위이다.

상기에서 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 상기 외부 프라이머 또는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머에 의해 증폭되는 핵산 증폭산물과 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하며, DNA-RNA-DNA혼성 신호 프로브의 5' 말단과 3' 말단은 올리고 DNA로 구성되고, 중간 부분은 올리고 RNA로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 18~38 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 5' 말단 및 3’말단의 DNA 부분은 각각 8~16 염기로 구성되는 것이 바람직하며, 중간에 위치한 RNA 부분은 2~6 염기로 구성되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표지 물질은

Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532,Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 딕옥시제닌(digoxygenin), 2,4-디니트로페닐(2,4-dinitrophenyl), FAM, Oregon Green 488, Oregon Green 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, HEX, QSY 7, QSY33, DABSYL, BODIPY FL, 디알킬아미노코우마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, 및 Cy3를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 바람직하게는 FAM, HEX, Cy5, DABSYL 또는 Iowa Black RQ이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다,

상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소일 수 있다. 용어, "내열성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들어, 55℃ 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 싸이클에 따라 생물학적 활성을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 상기 내열성 DNA 중합효소는 vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소 및 파이 29 DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 용어, "RNase"는 RNA를 특이적으로 절단하는 효소를 의미한다. 이때 RNA는 이중가닥을 형성하는 RNA일 수 있으며, 이러한 이중가닥은 RNA와 DNA가 결합한 혼성 이중가닥일 수 있다. 상기 RNA 분해효소는 RNase HII일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이후, 변성된 제1 반응혼합물 및 제2 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소, 상기 제1 외부 프라이머 세트와 제1 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제1 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브 및 제2 외부 프라이머 세트와 제2 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제2 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.

혼성 프라이머는 외부 프라이머 보다 DNA 사슬 신장 방향의 앞쪽에 어닐링된다. 어닐링된 외부 프라이머와 혼성 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며 외부 프라이머가 표적 DNA를 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 혼성 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 표적 DNA에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 혼성 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 이중나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다.

상기 증폭산물인 단일나선 DNA를 주형으로 외부 프라이머와 혼성 프라이머가 어닐링된다. 어닐링된 외부 프라이머와 혼성 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며, 외부 프라이머가 단일나선 DNA를 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 혼성 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 단일나선 DNA에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 혼성 프라이머에서 신장된 새로운 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 이중나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다. 외부 프라이머가 신장되어 이중나선 DNA가 형성되고, 신장된 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 사슬치환에 의해 단일나선 DNA가 분리된다. 상기 증폭된 단일나선 DNA를 주형으로 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머가 어닐링되고 신장되어 RNA를 포함하는 이중나선 DNA 증폭산물이 얻어진다. 이중나선 DNA의 RNA부분은 RNase H에 의해 분해되고 신장, 사슬치환에 의해 단일나선 DNA가 생성된다. 상기의 단일나선 DNA를 주형으로 프라이머의 어닐링, 신장, 사슬치환, RNA 절단의 과정이 반복되면서 표적 DNA가 증폭된다(도 1 참조).

상기 클라미디아 및 임균의 DNA의 등온증폭을 통하여 증폭된 DNA가 DNA-RNA-DNA 혼성 형광신호 프로브와 어닐링되어 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되면, RNase H의 활성에 의해 DNA-RNA-DNA 혼성 형광신호 프로브의 RNA 부분이 절단되고, 절단된 형광신호 프로브는 증폭된 DNA로부터 분리되어 떨어지고, 새로운 DNA-RNA-DNA 혼성 형광신호 프로브가 결합되고, RNase H에 의해 절단, 분리되는 싸이클이 반복되면서, 형광신호 프로브가 증폭되게 된다(도 2 참조).

상기 등온증폭은 본 발명의 프라이머와 주형 DNA가 어닐링될 수 있고, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 온도는 바람직하게는 30~75 ℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 37~70 ℃가 바람직하며, 50~65 ℃인 것이 가장 바람직하다.

이후, 상기 단계에서 증폭된 신호를 검출하여 표적 DNA의 존재여부 및 함량을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

등온 증폭이 됨에 따라 표적 DNA도 함께 증폭되고, 이에 상보적으로 결합하는 혼성 프로부의 결합량도 많아지게 되므로, 표적 DNA의 존재여부 뿐 아니라, 함량 또한 결정할 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 외부 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트, 및 서열번호 9 및 10의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 포함하는 성병 진단용 멀티플렉스 증폭 키트를 제공한다.

상기 성병은 클라미디아 또는 임질이다. 또한, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있다.

또한, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 RNA 분해효소를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소일 수 있다. 용어, 효소에 적용되는 "내열성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들어, 55℃ 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 싸이클에 따라 생물학적 활성을 유지하는 효소를 의미한다. 상기 내열성 DNA 중합효소는 vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소 및 파이 29 DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 또한, 상기 RNA 분해효소는 RNase HII일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트는 하나 이상의 반응 시약을 갖는 포장단위를 포함하는 키트 형태를 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 함께 혼합된 반응 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 반응 시약 용기들은 바람직하게는 상기 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 생략할 수 있도록 단위 수량의 반응 시약을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키트 시약은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA 또는 RNA을 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 또한, 키트 시약은 역전사 효소-PCR 분석에 적용하기 위한 시약을 포함할 수 있다.

본 발명은 표적핵산을 등온에서 신속하고 정확하게 증폭하는 방법 및 등온에서 표적핵산의 증폭 및 신호 프로브의 증폭을 동시에 수행하는 핵산의 검출방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 종래 방법인 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속·정확하게 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 여러가지의 표적 DNA를 동시에 증폭할 수 있어, 그에 따른 신호 프로브를 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다.

도 1은 일 구체예에 따른 표적 DNA의 등온증폭 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 일 구체예에 따른 표적 DNA와 신호 프로브의 등온증폭 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 일 구체예에 따른 혼성 프로브의 신호 검출 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 농도의 클라미디아(CT) DNA에 따른 증폭 결과를 나타낸다.
도 5는 다양한 농도의 임균(NG) DNA에 따른 증폭 결과를 나타낸다.
도 6은 다양한 농도의 내부 양성 컨트롤(Internal positive control, IAC)의 증폭 결과를 나타낸다. 이는 증폭 실험 결과에 대한 적절성을 확인하기 위한 것으로, 증폭 타겟의 농도에 반비례하여 증폭 결과가 나타난다. 따라서, 증폭 시간에 대한 결과에 반대되는 결과가 나타난다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : DNA의 등온 증폭

중폭반응에 필요한 CT (strain Trachoma type K strain UW-31/Cx, Original Source human cervix, cervicitis, Seatle, WA) ATCC 에서 구입하였으며, NG (Source Human with gonorrhea ) 균주는 질병관리본부에서 구입하였으며 이들의 genomic DNA를 표적DNA로 사용하였다. Genomic DNA 를 추출하기 위해 G-spin^TMGenomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후 증폭반응을 실시하였다. Genomic DNA 추출은 균 현탁액 500 ul를 15000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 500ul PBS (pH 7.2)를 섞어서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNase A, Proteinase K가 첨가된 G-buffer 용액 300 ul 를 첨가하여 세포 펠릿을 현탁시키고, 65 ℃에서 15분간 정치시켰다. 다음으로 Binding buffer 250ul를 넣고 잘 혼합한 후, 스핀 컬럼에 DNA를 결합시켰다. 500 ㎕의 세척 버퍼 A를 첨가한 후, 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 제거하고, washing buffer B 500ul를 첨가하여 원심분리 하였다. 1.5 ml microcentrifuge tube 에 column을 옮겨 30 ul의 elution buffer를 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하여 genomin DNA 를 얻어, PicoGreen quantification kit (invitrogen P7589)으로 정량하여 이것을 일정량 희석하여 증폭반응의 주형으로 사용하였다.

외부 프라이머 (서열번호 1, 2, 3 및 4)는 chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA 와 Neisseria gonorrhoeae genomic DNA 에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였다.

서열번호 1: 5'-TAA ACA TGA AAA CTC GTT CCG-3'

서열번호 2: 5'-AGT CTA CAG TTA TAG GTA ATC C-3'

서열번호 3: 5'-GTT TCC GTG CGT TAC GAT TC-3'

서열번호 4: 5'-GAA CTG GTT TCA TCT GAT TAC TTT CCA-3'

DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 (서열번호 5, 6, 7 및 8)은 5'말단 올리고 DNA-RNA 부분은 chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA와 Neisseria gonorrhoeae genomic DNA에 비상보적인 서열을 가지고, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA 와 Neisseria gonorrhoeae genomic DNA에 상보적인 서열을 가지도록 설계하였다(올리고 RNA 부분은 소문자 r로 표시).

서열번호 5: 5'-ACC GCA TCG AAT CGA TGT rArArA rATA GAA AAT CGC ATG CAAGAT A-3'

서열번호 6: 5'-CGA TTC CGC TCC AGA CTT rArArA rAAG CTG CCT CAG AAT ATA CTC AG-3'

서열번호 7: 5'-CCC TTA CAT ACC GTA GCrC rArUrG CCG GAT TTT CCG GTT TCA G-3'

서열번호 8: 5'-TCA GCC GTC CCT TGA TAC AGrA rArArA AAG TAG CAG GCG TAT AGG C-3'

신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브 (서열번호 9, 10 및 11)는 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, chlamydia trachomatis 은 5'말단에 팜(FAM)으로, 3' 말단은 뎁실(Dab)로 표지되어 있으며, Neisseria gonorrhoeae 는 5'말단에 싸이파이브(Cy5)로, 3'말단은 아이오아블랙알큐(IAbRQ)로 표지되어 있다. 또한 internal control의 신호프로브 5'말단은 핵스로, 3'말단은 아이오아블랙알큐로 표지되어 있다.

서열번호 9: 5'-/56-FAM/AGT ATG CGT TGT rUrArG rGrUrA AAG CTC TGA /3Dab/-3'

서열번호 10: 5'-/5Cy5/CAT TCrA rArUrU TGT TCC GAG TCrA rArArA CAG C/3IAbRQSp/-3'

서열번호 11: 5'-/5HEX/TCA GTG CGA TCrA rGrGrA rAAT CAA CCA GAT A/3IAbRQSp/-3'

상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트 및 표적 DNA 를 포함하는 반응혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 15 mM Tris-HCl(pH 8.5), 30 mM(NH₄)₂SO₄, 8 mM MgSO_4,40 mM KCl, 0.4 mM 각 dNTP, 6 mM DTT, 0.15 ug BSA, 225 nM 외부 프라이머 세트, 3.375 uM 내부프라이머세트 및 농도별 CT , NG genomic DNA 와 IAC 100 fg(femto gram)을 첨가하여 제조하였다. 상기 효소반응 혼합액의 성분은 다음과 같다: 6 유닛 RNase 억제제(필코리아), 0.05 u RNase HII (삼성테크윈), 3 유닛 Bst DNA polymerase(NEBM0275M), 신호 프로브 chlamydia trachomatis 100 nM , Neisseria gonorrhoeae 100nM, internal control 50 nM

ABI 7500 전용 tube에 증폭반응혼합물 5 ul , 효소반응혼합물 5 ul , 주형 DNA 와 내부 컨트롤 각각 5 ul씩 넣은 후 신속하게 spin-down 하여 ABI 7500 real-time PCR 장비에 넣어 61 ℃ 에서 90분간 반응시킨다.

<110> samsung techwin <120> A multiplex kit for simultaneously amplifying and detecting target sequence from CT and NG and A method for determining using the same <130> PN095381 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 for amplifying chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA <400> 1 taaacatgaa aactcgttcc g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 for amplifying chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA <400> 2 agtctacagt tataggtaat c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 for amplifying Neisseria gonorrhoeae genomic DNA <400> 3 gtttccgtgc gttacgattc 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 for amplifying Neisseria gonorrhoeae genomic DNA <400> 4 gaactggttt catctgatta ctttcca 27 <210> 5 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer 1 for amplifying chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA <220> <223> small r means RNA in the sequence of ACC GCA TCG AAT CGA TGT rArArA rATA GAA AAT CGC ATG CAAGAT A <400> 5 accgcatcga atcgatgtaa aatagaaaat cgcatgcaag ata 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer 2 for amplifying chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA <220> <223> small r means RNA in the sequence of CGA TTC CGC TCC AGA CTT rArArA rAAG CTG CCT CAG AAT ATA CTC AG <400> 6 cgattccgct ccagacttaa aaagctgcct cagaatatac tcag 44 <210> 7 <211> 41 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer 1 for amplifying Neisseria gonorrhoeae genomic DNA <220> <223> small r means RNA in the sequence of CCC TTA CAT ACC GTA GCrC rArUrG CCG GAT TTT CCG GTT TCA G <400> 7 cccttacata ccgtagccar ugccggattt tccggtttca g 41 <210> 8 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inner primer 2 for amplifying Neisseria gonorrhoeae genomic DNA <220> <223> small r means RNA in the sequence of TCA GCC GTC CCT TGA TAC AGrA rArArA AAG TAG CAG GCG TAT AGG C <400> 8 tcagccgtcc cttgatacag aaaaaagtag caggcgtata ggc 43 <210> 9 <211> 27 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-RNA-DNA hybrided probe1 <220> <223> small r means RNA in the sequence of AGT ATG CGT TGT rUrArG rGrUrA AAG CTC TGA <400> 9 agtatgcgtt gtuagguaaa gctctga 27 <210> 10 <211> 28 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-RNA-DNA hybrided probe2 <220> <223> small r means RNA in the sequence of CAT TCrA rArUrU TGT TCC GAG TCrA rArArA CAG C <400> 10 cattcaauut gttccgagtc aaaacagc 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA-RNA-DNA hybrided probe 3 <220> <223> small r means RNA in the sequence of TCA GTG CGA TCrA rGrGrA rAAT CAA CCA GAT A <400> 11 tcagtgcgat caggaaatca accagata 28

Claims

다음의 단계를 포함하는 표적 DNA의 동시 검출방법:
(a) (i) 제1 표적 DNA, (ii) 상기 제1 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 제1 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제1 반응혼합물, 및 (iv) 제2 표적 DNA, (v) 상기 제2 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 제1 외부 프라이머 세트, 및 (vi) 상기 제2 표적 DNA와 3' 말단 부분이 상보적이고 5' 말단 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트를 포함하는 제2 반응혼합물을 변성시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 변성된 제1 반응혼합물 및 제2 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소, 상기 제1 외부 프라이머 세트와 제1 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제1 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제1 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브 및 제2 외부 프라이머 세트와 제2 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 제2 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 신호를 검출하여 표적 DNA의 존재여부 및 함량을 결정하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 5' 말단 DNA-RNA 부분이 표적 DNA 서열과 비상보적인 염기서열을 가지고, 3' 말단 DNA 부분이 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소 및 파이 29 DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 RNA 분해효소는 RNase HII인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 32~66 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 DNA 부분의 길이가 각각 15~30 염기로 이루어지고, RNA 부분은 길이가 2~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 18~38 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 DNA 부분의 길이가 각각 8~16 염기로 이루어지고, RNA부분은 길이가 2~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는방법.
제11항에 있어서, 상기 표지 물질은 비오틴, 플루오레세인, 딕옥시제닌 및 2,4-디니트로페닐로 구성된 군에서선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 등온증폭은 30~75 ℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 표적 DNA는 클라미디아 유래의 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제1 외부 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 제1 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이고, 및 상기 제1 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 표적 DNA는 임균 유래의 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 제2 외부 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이고, 상기 제2 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이고, 및 상기 제2 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브는 서열번호 10의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1 내지 4의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 외부 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트, 및 서열번호 9 및 10의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 DNA-RNA-DNA 혼성신호 프로브를 포함하는 성병 진단용 멀티플렉스 증폭 키트.
제18항에 있어서, 상기 성병은 클라미디아 및 임질인 것을 특징으로 하는 성병 진단용 키트.
제18항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
제18항에 있어서, DNA 중합효소 및 RNA 분해효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.