KR101606528B1 - β-락탐 항생제 내성 균주의 검출 방법 - Google Patents

β-락탐 항생제 내성 균주의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자들을 증폭시켜 β-락탐 항생제 내성 균주를 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 β-락타마아제 타겟 유전자(구체적으로는, ESBL 유전자, AmpC β-락타마아제 유전자 또는 카바페네마아제 유전자)-특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 β-락탐 항생제 내성 균주를 매우 높은 효율로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 β-락탐 항생제 내성 균주들의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.

Description

β-락탐 항생제 내성 균주의 검출 방법{Methods for Detecting Bacteria Having Resistance to β-lactam Antibiotics}
본 발명은 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출 방법에 관한 것이다.
그람음성균의 β-락탐 항균제 내성은 여러 종류의 β-락타마아제 유전자를 획득할 수 있는 플라스미드의 전이로 흔히 발현된다. 여기에 세균 내부로 항생제를 흡수하는 포린(porin) 기능의 저하나 유출의 증가 등이 복합적으로 작용하여 더 강력한 다제내성을 유발한다. 현재 그람음성균에는 1,000종 이상의 β-락타마아제가 존재한다. ESBL(extended-spectrum β-lactamase), AmpC β-락타마아제, 카바페네마아제(carbapenemase)가 임상적으로 중요하다.
ESBL 생성균주는 1990년대부터 증가하기 시작하였다. 대부분 장내세균에서 검출되나 Pseudomonas spp.와 Acinetobacter baumannii에서도 검출된다. 1990년대에는 TEM형과 SHV형 ESBL 생성균주가, 2000년대에는 CTX-M형 ESBL 생성균주가 널리 전파되었다. 이외에도 PER 형 ESBL생성균주, VEB형 ESBL 생성균주들이 분리되고 있다.
플라스미드 매개성 AmpC β-락타마아제 유전자는 1989년 이후로 알려지게 되었다. 현재 CMY 유전자는 111 종류, ACC 유전자는 5 종류, ACT 유전자는 28 종류, DHA 유전자는 12 종류, FOX 유전자는 11 종류, MIR 유전자와 MOX 유전자는 각각 8 종류, LAT 유전자와 CFE 유전자는 각각 1종류가 밝혀져 있다 (http://www.lahey.org/studies/other.asp).
카바페넴(carbapenem)제에 내성을 일으키는 카바페네마아제는 분자구조에 따라 클라스 A, B, D로 분류된다. 클라스 A 카바페네마아제는 다섯 종류로 염색체성인 NMC, IMI, SME와 플라스미드 매개성인 KPC, GES가 있다. 클라스 A에서 KPC가 가장 흔하며 1996년 미국 동부에서 처음 발견된 이후 전세계적으로 전파되었다. 클라스 B는 현재까지 전 세계적으로 10종의 플라스미드 매개성 카바페네마아제: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, NDM, DIM 가 분리되었다. 대부분 VIM과 IMP이며 최근에는 NDM이 급속히 증가하고 있다. 클라스 D에 속하는 카바페네마아제는 OXA-23, OXA-24, OXA-58, OXA-48 그룹이 있으며 대부분 Acinetobacter sp.에서 분리된다.
β-락탐 항균제에 내성을 갖는 다제내성 그람음성균에 의한 감염이 최근에 증가하는 추세이다. 이러한 감염은 사망률과 이환율을 높이고 치료기간이 길어져 의료비 상승의 원인이 되며, 병원감염관리에 어려움을 주고 있다. 그래서 감염병의 예방, 관리 및 적절한 치료를 위해서는 다제내성균을 신속하게 검출하여야 한다. 항생제감수성검사는 다제내성균을 검출하는 기본검사이다. 이 검사는 균의 배양에 일정한 시간이 소요되며 β-락타마아제 유전자의 발현정도가 다양하고 특이적인 억제제가 없어 내성기전을 정확하게 파악하기 어렵다. 이와 달리 분자생물학적인 방법으로 β-락타마아제 유전자를 검출하는 검사는 신속하고 정확하게 내성기전을 밝힐 수 있어 병원감염관리와 내성균의 역학적 연구에 유용된다.
현재, 다중중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 검사법이 임상적으로 중요한 여러 β-락타마아제 유전자를 동시에 검출하는데 널리 사용되고 있다. 이러한 고식적인 PCR법을 이용한 검사는 증폭반응이 끝나면 전기영동을 하여 산물을 확인하여야 하므로 업무 부담이 있다. 그래서 본 발명자들은 다중 실시간-중합효소연쇄반응(multiplex real-time PCR)을 이용한 검사법을 개발하게 되었다. 실시간-중합효소연쇄반응법은 증폭산물을 실시간에 확인할 수 있어 반응 후 전기영동이 필요치 않아 병원검사실에 더 적합한 방법이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 β-락탐 항생제에 대해 내성을 갖는 균주를 간편하고 효율적으로 검출함으로써 다제내성균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트, AmpC β-락타마아제 검출 세트 및 카바페네마아제(carbapenemase) 검출세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 β-락타마아제 유전자를 갖는 β-락탐 항생제 내성 균주를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법을 제공한다:
(a) 시료를 준비하는 단계;
(b) (i) ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트, (ⅱ) AmpC β-락타마아제 검출 세트 및 (ⅲ) 카바페네마아제(carbapenemase) 검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트, (ⅱ) AmpC β-락타마아제 검출 세트 및 (ⅲ) 카바페네마아제(carbapenemase) 검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출 세트를 포함하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 β-락탐 항생제에 대해 내성을 갖는 균주를 간편하고 효율적으로 검출함으로써 다제내성균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트, AmpC β-락타마아제 검출 세트 및 카바페네마아제(carbapenemase) 검출세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 β-락타마아제 유전자를 갖는 β-락탐 항생제 내성 균주를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 방법은 시료 내에서 β-락탐 항생제 내성 균주를 단일 튜브 내에서 매우 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현 예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR; 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences; 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법이 프라이머를 이용하여 실시되는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 임상검체-유래된 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 시료는 임상검체-유래된 시료로, 상기 임상검체는 객담, 타액, 혈액 및 소변을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 타겟 유전자(예를 들어, ESBL 유전자, AmpC β-락타마아제 및 카바페네마아제 유전자 등)를 적합한 방법으로 분석하여 β-락탐 항생제에 대해 내성을 갖는 다양한 균주를 특이적으로 검출하는 것이다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에 있어서 (i) ESBL 유전자, AmpC β-락타마아제 유전자 및 카바페네마아제 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 형광을 통해 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 다양한 β-락탐 항생제 내성 균주를 동시에 효과적이고 간편하게 검출 또는 정량할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 다양한 β-락탐 항생제 내성 균주를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출 세트는 ESBL 검출 세트, AmpC β-락타마아제 검출 세트 및 카바페네마아제 검출 세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 ESBL 검출 세트는 (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 이루어진 제1검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제2검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제3검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 제5검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 제6검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 제7검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 제8검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 제9검출 세트; 및 (ⅹ) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 제10검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 AmpC β-락타마아제 검출 세트는 (i) 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 제11검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 제12검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 제13검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 제14검출 세트; 및 (ⅴ) 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 제15검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 카바페네마아제 검출세트는 (i) 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제49서열의 프로브로 이루어진 제16검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제50서열 및 서열목록 제51서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제52서열의 프로브로 이루어진 제17검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제55서열 및 서열목록 제56서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브로 이루어진 제18검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제57서열 및 서열목록 제58서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제59서열의 프로브로 이루어진 제19검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제60서열 및 서열목록 제61서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제62서열의 프로브로 이루어진 제20검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제63서열 및 서열목록 제64서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제65서열의 프로브로 이루어진 제21검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제66서열 및 서열목록 제67서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제68서열의 프로브로 이루어진 제22검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제69서열 및 서열목록 제70서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제71서열의 프로브로 이루어진 제23검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제72서열 및 서열목록 제73서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제74서열의 프로브로 이루어진 제24검출 세트; (ⅹ) 서열목록 제75서열 및 서열목록 제76서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제77서열의 프로브로 이루어진 제25검출 세트; (ⅹⅰ) 서열목록 제78서열 및 서열목록 제79서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제80서열의 프로브로 이루어진 제26검출 세트; (ⅹⅱ) 서열목록 제81서열 및 서열목록 제82서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제83서열의 프로브로 이루어진 제27검출 세트; (ⅹⅲ) 서열목록 제84서열 및 서열목록 제85서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제86서열의 프로브로 이루어진 제28검출 세트; 및 (ⅹⅳ) 서열목록 제87서열 및 서열목록 제88서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제89서열의 프로브로 이루어진 제29검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 서열목록 제90서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제91서열 및 서열목록 제92서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제93서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 추가적으로 포함한다.
실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C t 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C t 값이 산출된다.
실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).
C t (cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C t 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C t 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C t 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C t 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5’-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3’-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = For fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 구체적으로는, TaqMan 프로브는 본원발명의 타겟 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5’to 3’ 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5’-말단은 상기 연장 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 Cy5, ROX, HEX, FAM, BHQ-1, BHQ-2 또는 Cy5.5-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5’-말단은 Cy5, ROX, HEX, FAM 및 Cy5.5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3’-말단은 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 구체적으로는 cDNA이다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산은 임상검체로부터 유래된 핵산 시료를 포함한다. 타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’to 3’ 뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5’to 3’ 뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.
주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 “주형-의존성 연장반응”은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자들을 증폭시켜 β-락탐 항생제 내성 균주를 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법은 β-락타마아제 타겟 유전자(구체적으로는, ESBL 유전자, AmpC β-락타마아제 유전자 또는 카바페네마아제 유전자)-특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 β-락탐 항생제 내성 균주를 매우 높은 효율로 검출할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 β-락탐 항생제 내성 균주들의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.
도 1a-1e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 ESBL과 AmpC β-락타마아제의 형광 결과이다(튜브 1). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 1a 내지 1e는 각각 진홍채널(CTX-M9 그룹 검출), 빨강채널(CTX-M1 그룹 검출), 주황채널(내재적 대조군 검출), 노랑채널(CTX-M2 그룹 검출) 및 녹색채널(CTX-M8/25 그룹 검출)을 보여주는 결과이다.
도 2a-2e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 ESBL과 AmpC β-락타마아제의 형광 결과이다(튜브 2). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 2a 내지 2e는 각각 진홍채널(SHV 검출), 빨강채널(TEM 검출), 주황채널(OXA ESBL 검출), 노랑채널(VEB 검출) 및 녹색채널(PER 검출)을 보여주는 결과이다.
도 3a-3e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 ESBL과 AmpC β-락타마아제의 형광 결과이다(튜브 3). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 3a 내지 3e는 각각 진홍채널(CMY-2 그룹 검출), 빨강채널(MOX_CMY 그룹 검출), 주황채널(ACT_MIR 검출), 노랑채널(ACC 검출) 및 녹색채널(DHA 검출)을 보여주는 결과이다.
도 4a-4e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 카바페네마아제의 형광 결과이다(튜브 1). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 4a 내지 4e는 각각 진홍채널(KPC 검출), 빨강채널(VIM 검출), 주황채널(내재적 대조군 검출), 노랑채널(IMP 검출) 및 녹색채널(NDM 검출)을 보여주는 결과이다.
도 5a-5e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 카바페네마아제의 형광 결과이다(튜브 2). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 5a 내지 5e는 각각 진홍채널(OXA-48 그룹 검출), 빨강채널(GES 검출), 주황채널(OXA-23 그룹 검출), 노랑채널(SIM 검출) 및 녹색채널(SPM 검출)을 보여주는 결과이다.
도 6a-6e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 카바페네마아제의 형광 결과이다(튜브 3). Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 6a 내지 6e는 각각 진홍채널(OXA-24 그룹 검출), 빨강채널(IMI 검출), 주황채널(GIM 검출), 노랑채널(SME 검출) 및 녹색채널(OXA-58 그룹 검출)을 보여주는 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험예: 검사법의 특징
본 검사는 ESBL(Extended-spectrum ß-lactamase)과 AmpC β-락타마아제 유전자를 검출하는 검사법과 카바페네마아제 유전자를 검출하는 검사법으로 구성된다. 두 검사법 모두 각각 3개의 반응튜브로 구성되며 1번 반응튜브에는 그람음성균의 16S rRNA을 대상으로 하는 내부 대조군(internal control) 있어 핵산추출 효율과 PCR 저해물질 존재 유무를 판단할 수 있다.
ESBL과 AmpC β-락타마아제 유전자 검출 검사
튜브 내용물
반응 튜브 1 : ESBL-1 CTX-M1 그룹, CTX-M2 그룹, CTX-M9 그룹, CTX-M8/25 그룹, 내부 대조군
반응 튜브 2 : ESBL-2 EM, SHV, VEB, PER, OXA ESBL(OXA-10 그룹, OXA-2 그룹)
반응 튜브 3 : AmpC ACT_MIR, CMY-2 그룹(LAT-1과 CFE-1 포함), MOX_CMY 그룹(FOX포함), ACC, DHA
카바페네마아제 유전자 검출 검사
튜브 내용물
반응 튜브 1 : Carb-1 KPC, VIM, IMP, NDM, 내부 대조군
반응 튜브 2 : Carb-2 XA-48, GES, SIM, SPM, OXA-23
반응 튜브 3 : Carb-3 XA-24, IMI(NMC-A 포함), SME, OXA-58, GIM
실시예 1: 프라이머 및 프로브 디자인
여러 β-락타마아제 유전자의 변이 정보는 http://www.lahey.org/studies를 참조하여 NCBI(National center for Biotechnology Information)의 데이터베이스에서 필요한 염기서열 자료를 얻었다. NCBI의 데이터베이스에서 얻은 β-락타마아제 유전자의 염기서열 자료를 Sequencher 5.1로 얼라인먼트 분석을 하였다. 분석에 사용된 각종 β-락타마아제 유전자의 변이 수는 다음과 같다.
ESBL 유전자 : TEM 217종류 , SHV 184종류, CTX-M 150종류, PER 7종류, VEB 9종류, OXA-10 그룹 11종류, OXA-2 그룹 7종류
AmpC β-락타마아제 유전자 : CMY 111종류, ACC 5종류, ACT 28종류, DHA 12종류, FOX 11종류, MIR 8종류, MOX 8 종류, LAT 1종류, CFE 1종류
카바페네마아제 유전자 : KPC 17종류, GES 24종류, NDM 10종류, VIM 40종류, IMP 47종류, IMI 4종류, SME 5종류, GIM 1종류, SPM 1종류, NMC-A 1종류, OXA-23 그룹 15종류, OXA-24 그룹 13종류, OXA-48 그룹 11 종류, OXA-58 그룹 4종류
각각의 β-락타마아제 변이유전자 염기서열의 얼라인먼트 분석 자료에서 모든 β-락타마아제 변이 유전자를 검출할 수 있는 부위를 사용하여 프라이머와 프로브를 디자인하였다.
프라이머 및 프로브 서열
No. 그룹 정방향 프라이머(5’-3’) 역방향(5’-3’) 프로브(5’-3’)
1 CTX-M9 그룹 CGTTGCAGTACAGCGACAAT CAGTGCGATCCAGACGAAA Cy5.5-AAATTGATTGCCCAGCTCG-BHQ2
2 CTX-M1 그룹 GACGTTAAACACCGCCATTC AATGCTTTACCCAGCGTCAG Cy5-ATCCGCGTGATACCACTTCA-BHQ2
3 CTX-M2 그룹 TGGGTAGTGGGCGATAAAAC TGCTCCGGTTGGGTAAARTA HEX-TTATGGCACCACCAACGATAT-BHQ1
4 CTX-M8/25 그룹 GGCGCTACAGTACAGCGAYA GAACGTGTCATCSCCAATC FAM-CCATGAAYAAGCTGATTGCCC-BHQ1
5 SHV GATGAACGCTTTCCCATGAT GCGAGTAGTCCACCAGATCC Cy5.5-AACAGCTGGAGCGAAAGATCC-BHQ2
6 TEM ACGAGTGGGTTACATCGARCTG TACCGCACCACATAGCAGAA Cy5-CTCAACAGCGGTAAGATCCTTG-BHQ2
7 VEB CGATGCAAAGCGTTATGAAA GCAAAAGGTCTTGAGGGGTA HEX-CGATTGCTTTAGCCGTTTTG-BHQ1
8 PER TCAAAACTGGACSTCGATGA CTSTGGTCCTGTGGTGGTTT FAM-TGTCTGAAACCTCGCAGGC-BHQ1
9 OXA-10 그룹 CGAAGCCGTCAATGGTGT TGCGYTGGGGATCTTAAATG ROX-CTTAGCTCGTGCATCAAAGGAA-BHQ2
10 OXA-2 그룹 CCCTTTCGGGTAGAACATCA GTCTTTGCACGCAGTATCCA ROX-CGCTTGGTCAAGGATCTCAT-BHQ2
11 CMY-2 그룹 (LAT-1, CFE-1 포함) GTTCAGGAGAAAACGCTCCA CGGCCAGTTCAGCATCTC Cy5.5-ACTGGCGTATTGGYGATATGTAC-BHQ2
12 MOX_CMY 그룹 (FOX 포함) ATGGCAAGGCCCACTAYTT GGTCTTGCTCACGGAWCCTA Cy5-TCAGCGAGCAGACCSTGTT-BHQ2
TTGCTGACCGAGCCAATCT
13 ACC CTGCCATATCCGGTWTCTCT GTAGCCACGCTTTTCGTCAT HEX-CTCACCGGTAACGATATGGC-BHQ1
14 DHA GTGAAATCCGCCTCAAAAGA ACATTGCCATTTCCAGATCC FAM-ATGAATATGGAGCCGTCACG-BHQ1
15 ACT_MIR CCTCTCTGCTGCGCTTYTA TGGCGTTGGCRTAAAGAC ROX-CARAACTGGCAGCCGCA-BHQ2
16 KPC CGGAACCATTCGCTAAACTC GTATCCATCGCGTACACACC Cy5.5-AACAGGACTTTGGCGGCT-BHQ2
17 VIM AGGTCCGRCTTTACCAGATT GAGACCATTGGACGGGTASA Cy5-TGGTGTTTGGTCGCATATCG-BHQ2
18 IMP GCGCGGCTATAAAATMAAAGG GCATACGTGGGGATAGATYGA HEX-ATTTCCATAGCGACAGCACG-BHQ1
HEX-CATTTtCATAGCGACAGCACG-BHQ1
19 NDM CCTGATCAAGGACAGCAAGG TAGTGCTCAGTGTCGGCATC FAM-CAAGTCGCTCGGCAATCT-BHQ1
20 OXA-48 그룹 GGAATGAGAATAAGCAGCAAGG GCGATCAAGCTATTGGGAAT Cy5.5-CAAGCATTTTTACCCGCATC-BHQ2
21 GES GAGAAGCTAGAGCGCGAAAA GATCTCTCCTTGGGGATCG Cy5-AGATCGGTGTTGCGATCGT-BHQ2
22 SIM CAACACATTTCCACGACGAC GCATATGTGGGGATGGACTT HEX-CTGCTGGGATAGAGTGGCTT-BHQ1
23 SPM TTTTGTTTGTTGCTCGTTGC CTTGGTCGCCGTTAGATTGT FAM-CTGCAAAAAGTTCGGATCATG-BHQ1
24 OXA-23 그룹 GATCGGATTGGAGAACCAGA TTTCCCAAGCGGTAAATGAC ROX-TAAATGGAAGGGCGAGAAAA-BHQ2
25 OXA-24 그룹 CAAGACGGACTGGCCTAGA GGGGCCAACTAACCAAAART Cy5.5-TGCAGAAAGAAGTAAAGCGGG-BHQ2
26 IMI (NMC-A 포함) AGCCTGAAAACCCTTGCTCT CACCGGTTGTGTTACCCTTT Cy5-TGAGCGTGAAAAGGAAACCT-BHQ2
27 SME GTTAGATCGCTGGGAACTGG AGCTTTTGGCGTTGAAGTGT HEX-ACACTGCAATCCCAGGAGAT-BHQ1
28 OXA-58 그룹 TGGGTTGGTATGTGGGTTTT TCACCAGCTTTCATTTGCAT FAM-CAAGTGGTGGCATTTGCTTT-BHQ1
29 GIM GCCGGTTCCTACCCACTACT ATCCTCTGTATGCCCAGCAC ROX-AATTCACACTGGGAAATGGG-BHQ2
30 대조군 AGTCCGGATTGGRGTCTGC AAGGCCCGGGAACGTATT ROX- TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG-BHQ2
ACAAGACCCGGGAACGTATT
실시예 2: 다중 실시간-중합효소연쇄반응 검사
2-1. 핵산의 분리
임상검체에서 분리된 그람음성균 222주와 표 4의 β-락타마아제 유전자형이 확인된 표준균주 22주의 DNA를 추출하여 분석하였다.
Strains and source 관련 유전자
CCARM 274 TEM 15-1
CCARM 275 TEM 15-2
CCARM 276 TEM 52-1
CCARM 277 TEM 52-2
CCARM 278 PSE 1-1
CCARM 279 PSE 1-2
CCARM 280 CMY 1
CCARM 281 SHV 12
CCARM 282 SHV 2a
CCARM 283 CTX-M 14
CCARM 284 OXA-10
NCCP 14570 VIM-2
NCCP 14573 IMP-6
NCCP 15675 NDM-1
NCCP 15676 KPC-2
NCCP 14571 IMP-1
NCCP 14572 IMP-6
NCCP 15782 NDM-1
NCCP DNA 1 GES-5
NCCP DNA 2 OXA-232
NCCP DNA 3 KPC-4
NCCP DNA 4 KPC-4
CCARM : Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes
NCCP : National Culture Collection for Pathogen
2-2. 프라이머-프로브 믹스
각 검사마다 3 종류의 프라이머-프로브 믹스 튜브를 제조하였다. 각각의 튜브에는 해당 β-락타마아제 유전자에 특이한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 동일한 양으로 들어 있다.
ESBL과 AmpC β-락타마아제 유전자 검출 검사
튜브 내용물 양
튜브 1 : ESBL-1 CTX-M9 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
CTX-M9 그룹 프로브 2 pmole/㎕
CTX-M1 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
CTX-M1 그룹 프로브 2 pmole/㎕
CTX-M2 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
CTX-M2 그룹 프로브 2 pmole/㎕
CTX-M8/25 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
CTX-M8/25 그룹 프로브 2 pmole/㎕
대조군 프라이머 5 pmole/㎕
대조군 프로브 2 pmole/㎕
튜브 2 : ESBL-2 SHV 프라이머 5 pmole/㎕
SHV 프로브 2 pmole/㎕
TEM 프라이머 5 pmole/㎕
TEM 프로브 2 pmole/㎕
VEB 프라이머 5 pmole/㎕
VEB 프로브 2 pmole/㎕
PER 프라이머 5 pmole/㎕
PER 프로브 2 pmole/㎕
OXA-10 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-10 그룹 프로브 2 pmole/㎕
OXA-2 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-2 그룹 프로브 2 pmole/㎕
튜브 3 : AmpC CMY-2 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
CMY-2 그룹 프로브 2 pmole/㎕
MOX_CMY 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
MOX_CMY 그룹 프로브 2 pmole/㎕
ACC 프라이머 5 pmole/㎕
ACC 프로브 2 pmole/㎕
DHA 프라이머 5 pmole/㎕
DHA 프로브 2 pmole/㎕
ACT_MIR 프라이머 5 pmole/㎕
ACT_MIR 프로브 2 pmole/㎕
카바페네마아제(Carbapenemase) 유전자 검출 검사
튜브 내용물 양
튜브 1 : Carb-1 KPC 프라이머 5 pmole/㎕
KPC 프로브 2 pmole/㎕
VIM 프라이머 5 pmole/㎕
VIM 프로브 2 pmole/㎕
IMP 프라이머 5 pmole/㎕
IMP 프로브 2 pmole/㎕
NDM 프라이머 5 pmole/㎕
NDM 프로브 2 pmole/㎕
대조군 프라이머 5 pmole/㎕
대조군 프로브 2 pmole/㎕
튜브 2 : Carb-2 OXA-48 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-48 그룹 프로브 2 pmole/㎕
GES 프라이머 5 pmole/㎕
GES 프로브 2 pmole/㎕
SIM 프라이머 5 pmole/㎕
SIM 프로브 2 pmole/㎕
SPM 프라이머 5 pmole/㎕
SPM 프로브 2 pmole/㎕
OXA-23 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-23 그룹 프로브 2 pmole/㎕
튜브 3 OXA-24 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-24 그룹 프로브 2 pmole/㎕
IMI 프라이머 5 pmole/㎕
IMI 프로브 2 pmole/㎕
SME 프라이머 5 pmole/㎕
SME 프로브 2 pmole/㎕
OXA-58 그룹 프라이머 5 pmole/㎕
OXA-58 그룹 2 pmole/㎕
GIM 프라이머 5 pmole/㎕
GIM 프로브 2 pmole/㎕
2-3. 다중 실시간 중합효소연쇄반응
Rotor-Gene multiplex PCR Kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 다중 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., 미국)를 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 15초 간 변성, 약 60℃에서 약 15초 간 어닐링 및 연장 공정을 1 싸이클로 하여, 40 싸이클을 수행하였다. 이 때, 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 7과 같다. 각각의 프라이머-프로브 믹스에는 해당 β-락타마아제 유전자를 검출하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 각각 동일한 량(5 pmole/㎕)으로 들어 있고 프로브는 2 pmole/㎕이 있었다. 따라서 반응에 사용되는 프라이머-프로브 믹스 2.5 ㎕에는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 12.5 pmole이 되고 프로브는 5 pmole이 들어 있게 된다. 따라서 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 총 부피가 25 ㎕이므로 해당 β-락타마아제 유전자를 검출하는 프라이머의 농도는 0.5 μM (12.5 pmoles/25 ㎕), 프로브는 0.2 μM(5 pmole/25 ㎕)가 사용되었다.
성분 부피(㎕) 농도
2X Rotor-Gene Multiplex PCR Master Mix 12.5 1X
프라이머-프로브 믹스 프라이머(5 pmole/㎕)-프로브(2 pmole/㎕) 2.5 0.5 μM - 0.2 μM
누클레아제 결핍 물 5 -
샘플 DNA 주형 5 -
전체 25 -
다중 실시간 중합효소연쇄반응 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., 미국)에서 측정한다. 상기 다중 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실시간 모니터 상에서 FAMTM 이 발색되는 경우 녹색채널(510±5 nm), HexTM가 발색되는 경우 노랑채널(555±5 nm), ROXTM이 발색하는 경우 주황채널(610±5 nm ), Cy5TM이 발색되는 경우 빨강채널(660±10 nm), Cy5.5TM이 발색되는 경우 진홍채널(712 log pass)에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널(green channel), 노랑채널(yellow channel), 주황채널(orange channel), 빨강채널(red channel), 진홍채널(crimson channel)에서 형광을 관찰하였다.
2-4. 결과
각 튜브에서 모든 채널의 한계점(threshold) 값은 0.02로 지정한 뒤 Ct값을 확인한다. Ct값이 <36에서 피크가 관찰되면 양성으로 판독한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Hyunil-bio Co. <120> PN <130> PN140045 <160> 93 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M9 group Forward primer <400> 1 cgttgcagta cagcgacaat 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M9 group Reverse primer <400> 2 cagtgcgatc cagacgaaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M9 group Probe <400> 3 aaattgattg cccagctcg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M1 group Forward primer <400> 4 gacgttaaac accgccattc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M1 group Reverse primer <400> 5 aatgctttac ccagcgtcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M1 group Probe <400> 6 atccgcgtga taccacttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M2 group Forward primer <400> 7 tgggtagtgg gcgataaaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M2 group Reverse primer <400> 8 tgctccggtt gggtaaarta 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M2 group Probe <400> 9 ttatggcacc accaacgata t 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M8/25 group Forward primer <400> 10 ggcgctacag tacagcgaya 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M8/25 group Reverse primer <400> 11 gaacgtgtca tcsccaatc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTX-M8/25 group Probe <400> 12 ccatgaayaa gctgattgcc c 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHV Forward primer <400> 13 gatgaacgct ttcccatgat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHV Reverse primer <400> 14 gcgagtagtc caccagatcc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHV Probe <400> 15 aacagctgga gcgaaagatc c 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM Forward primer <400> 16 acgagtgggt tacatcgarc tg 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM Reverse primer <400> 17 taccgcacca catagcagaa 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEM Probe <400> 18 ctcaacagcg gtaagatcct tg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEB Forward primer <400> 19 cgatgcaaag cgttatgaaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEB Reverse primer <400> 20 gcaaaaggtc ttgaggggta 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEB Probe <400> 21 cgattgcttt agccgttttg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PER Forward primer <400> 22 tcaaaactgg acstcgatga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PER Reverse primer <400> 23 ctstggtcct gtggtggttt 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PER Probe <400> 24 tgtctgaaac ctcgcaggc 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-10 group Forward primer <400> 25 cgaagccgtc aatggtgt 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-10 group Reverse primer <400> 26 tgcgytgggg atcttaaatg 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-10 group Primer <400> 27 cttagctcgt gcatcaaagg aa 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-2 group Forward primer <400> 28 ccctttcggg tagaacatca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-2 group Reverse primer <400> 29 gtctttgcac gcagtatcca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-2 group Probe <400> 30 cgcttggtca aggatctcat 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMY-2 group(included LAT-1, CFE-1) Forward primer <400> 31 gttcaggaga aaacgctcca 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMY-2 group(included LAT-1, CFE-1) Reverse primer <400> 32 cggccagttc agcatctc 18 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMY-2 group(included LAT-1, CFE-1) Probe <400> 33 actggcgtat tggygatatg tac 23 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MOX_CMY group(included FOX) Forward primer <400> 34 atggcaaggc ccactaytt 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MOX_CMY group(included FOX) Reverse primer1 <400> 35 ggtcttgctc acggawccta 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MOX_CMY group(included FOX) Reverse primer2 <400> 36 ttgctgaccg agccaatct 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MOX_CMY group(included FOX) Probe <400> 37 tcagcgagca gaccstgtt 19 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC Forward primer <400> 38 ctgccatatc cggtwtctct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC Reverse primer <400> 39 ctgccatatc cggtwtctct 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC Probe <400> 40 ctcaccggta acgatatggc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHA Forward primer <400> 41 gtgaaatccg cctcaaaaga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHA Reverse primer <400> 42 acattgccat ttccagatcc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DHA Probe <400> 43 atgaatatgg agccgtcacg 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT-MIR Forward primer <400> 44 cctctctgct gcgcttyta 19 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT-MIR Reverse primer <400> 45 tggcgttggc rtaaagac 18 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACT-MIR Probe <400> 46 caraactggc agccgca 17 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC Forward primer <400> 47 cggaaccatt cgctaaactc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC Reverse primer <400> 48 gtatccatcg cgtacacacc 20 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC Probe <400> 49 aacaggactt tggcggct 18 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM Forward primer <400> 50 aggtccgrct ttaccagatt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM Reverse primer <400> 51 gagaccattg gacgggtasa 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM Probe <400> 52 tggtgtttgg tcgcatatcg 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP Forward primer <400> 53 gcgcggctat aaaatmaaag g 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP Reverse primer <400> 54 gcatacgtgg ggatagatyg a 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP Probe1 <400> 55 atttccatag cgacagcacg 20 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP Probe2 <400> 56 cattttcata gcgacagcac g 21 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM Forward primer <400> 57 cctgatcaag gacagcaagg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM Reverse primer <400> 58 tagtgctcag tgtcggcatc 20 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM Probe <400> 59 caagtcgctc ggcaatct 18 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-48 group Forward primer <400> 60 ggaatgagaa taagcagcaa gg 22 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-48 group Reverse primer <400> 61 gcgatcaagc tattgggaat 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-48 group Probe <400> 62 caagcatttt tacccgcatc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES Forward primer <400> 63 gagaagctag agcgcgaaaa 20 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES Reverse primer <400> 64 gatctctcct tggggatcg 19 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES Probe <400> 65 agatcggtgt tgcgatcgt 19 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM Forward primer <400> 66 caacacattt ccacgacgac 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM Reverse primer <400> 67 gcatatgtgg ggatggactt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIM Probe <400> 68 ctgctgggat agagtggctt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPM Forward primer <400> 69 ttttgtttgt tgctcgttgc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPM Reverse primer <400> 70 cttggtcgcc gttagattgt 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPM Probe <400> 71 ctgcaaaaag ttcggatcat g 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-23 group Forward primer <400> 72 gatcggattg gagaaccaga 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-23 group Reverse primer <400> 73 tttcccaagc ggtaaatgac 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-23 group Probe <400> 74 taaatggaag ggcgagaaaa 20 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-24 group Forward primer <400> 75 caagacggac tggcctaga 19 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-24 group Reverse primer <400> 76 ggggccaact aaccaaaart 20 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-24 group Probe <400> 77 tgcagaaaga agtaaagcgg g 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMI(included NMC-A) Forward primer <400> 78 agcctgaaaa cccttgctct 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMI(included NMC-A) Reverse primer <400> 79 caccggttgt gttacccttt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMI(included NMC-A) Probe <400> 80 tgagcgtgaa aaggaaacct 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SME Forward primer <400> 81 gttagatcgc tgggaactgg 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SME Reverse primer <400> 82 agcttttggc gttgaagtgt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SME Probe <400> 83 acactgcaat cccaggagat 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-58 group Forward primer <400> 84 tgggttggta tgtgggtttt 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-58 group Reverse primer <400> 85 tcaccagctt tcatttgcat 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA-58 group Probe <400> 86 caagtggtgg catttgcttt 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIM Forward primer <400> 87 gccggttcct acccactact 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIM Reverse primer <400> 88 atcctctgta tgcccagcac 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GIM Probe <400> 89 aattcacact gggaaatggg 20 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control forward primer <400> 90 agtccggatt ggrgtctgc 19 <210> 91 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control reverse primer1 <400> 91 aaggcccggg aacgtatt 18 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control reverse primer2 <400> 92 acaagacccg ggaacgtatt 20 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control probe <400> 93 tgaagtcgga atcgctagta atcg 24

Claims (11)

  1. 다음의 단계를 포함하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법:
    (a) 시료를 준비하는 단계;
    (b) 카바페네마아제(carbapenemase) 검출세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계,
    상기 카바페네마아제 검출세트는 (i) 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제49서열의 프로브로 이루어진 제16검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제50서열 및 서열목록 제51서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제52서열의 프로브로 이루어진 제17검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제55서열 및 서열목록 제56서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브로 이루어진 제18검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제57서열 및 서열목록 제58서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제59서열의 프로브로 이루어진 제19검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제60서열 및 서열목록 제61서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제62서열의 프로브로 이루어진 제20검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제63서열 및 서열목록 제64서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제65서열의 프로브로 이루어진 제21검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제66서열 및 서열목록 제67서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제68서열의 프로브로 이루어진 제22검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제69서열 및 서열목록 제70서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제71서열의 프로브로 이루어진 제23검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제72서열 및 서열목록 제73서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제74서열의 프로브로 이루어진 제24검출 세트; (ⅹ) 서열목록 제75서열 및 서열목록 제76서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제77서열의 프로브로 이루어진 제25검출 세트; (ⅹⅰ) 서열목록 제78서열 및 서열목록 제79서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제80서열의 프로브로 이루어진 제26검출 세트; (ⅹⅱ) 서열목록 제81서열 및 서열목록 제82서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제83서열의 프로브로 이루어진 제27검출 세트; (ⅹⅲ) 서열목록 제84서열 및 서열목록 제85서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제86서열의 프로브로 이루어진 제28검출 세트; 및 (ⅹⅳ) 서열목록 제87서열 및 서열목록 제88서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제89서열의 프로브로 이루어진 제29검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트임.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 세트는 서열목록 제90서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제91서열 및 서열목록 제92서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제93서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주의 검출방법.
  6. (i) 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제49서열의 프로브로 이루어진 제16검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제50서열 및 서열목록 제51서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제52서열의 프로브로 이루어진 제17검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제55서열 및 서열목록 제56서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브로 이루어진 제18검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제57서열 및 서열목록 제58서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제59서열의 프로브로 이루어진 제19검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제60서열 및 서열목록 제61서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제62서열의 프로브로 이루어진 제20검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제63서열 및 서열목록 제64서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제65서열의 프로브로 이루어진 제21검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제66서열 및 서열목록 제67서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제68서열의 프로브로 이루어진 제22검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제69서열 및 서열목록 제70서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제71서열의 프로브로 이루어진 제23검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제72서열 및 서열목록 제73서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제74서열의 프로브로 이루어진 제24검출 세트; (ⅹ) 서열목록 제75서열 및 서열목록 제76서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제77서열의 프로브로 이루어진 제25검출 세트; (ⅹⅰ) 서열목록 제78서열 및 서열목록 제79서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제80서열의 프로브로 이루어진 제26검출 세트; (ⅹⅱ) 서열목록 제81서열 및 서열목록 제82서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제83서열의 프로브로 이루어진 제27검출 세트; (ⅹⅲ) 서열목록 제84서열 및 서열목록 제85서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제86서열의 프로브로 이루어진 제28검출 세트; 및 (ⅹⅳ) 서열목록 제87서열 및 서열목록 제88서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제89서열의 프로브로 이루어진 제29검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 포함하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제90서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제91서열 및 서열목록 제92서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제93서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 검출방법은
    (a) ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트로서 (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 이루어진 제1검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제2검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제3검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 제5검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 제6검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 제7검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 제8검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 제9검출 세트; 및 (ⅹ) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 제10검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트; 및
    (b) AmpC β-락타마아제 검출세트로서 (i) 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 제11검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 제12검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 제13검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 제14검출 세트; 및 (ⅴ) 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 제15검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는
    (a) ESBL(extended-spectrum β-lactamase) 검출 세트로서 (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 이루어진 제1검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제2검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제3검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출 세트; (ⅴ) 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 제5검출 세트; (ⅵ) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 제6검출 세트; (ⅶ) 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 제7검출 세트; (ⅷ) 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 제8검출 세트; (ⅸ) 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 제9검출 세트; 및 (ⅹ) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 제10검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트; 및
    (b) AmpC β-락타마아제 검출세트로서 (i) 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 제11검출 세트; (ⅱ) 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머 및 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 제12검출 세트; (ⅲ) 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 제13검출 세트; (ⅳ) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 제14검출 세트; 및 (ⅴ) 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 제15검출 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 검출 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 β-락탐 항생제 내성 균주 검출용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20030219749A1 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Creighton University Multiplex PCR for the detection of ampC beta-lactamase genes
KR100741375B1 (ko) 2006-07-24 2007-07-27 대한민국 기질확장형 β-락타마제의 신속분류를 위한 멀티플렉스ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머

Patent Citations (2)

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Title
J. Antimicrob. Chemother., Vol. 68, Suppl. 1, i57-i65 (2013.05.)

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