KR100741375B1 - 기질확장형 β-락타마제의 신속분류를 위한 멀티플렉스ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 - Google Patents

기질확장형 β-락타마제의 신속분류를 위한 멀티플렉스ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기질확장형 β-락타마제(ESBL)의 신속분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 5종의 PCR 프라이머세트의 개발 및 이들 프라이머들을 동시에 적용하여 정확하고 신속하게 5종의 기질확장형 β-락타마제(ESBL)를 검출 및 분류할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법에 관한 것이다.
기질확장형 β-락타마제, PCR, 멀티플렉스, ESBL

Description

기질확장형 β-락타마제의 신속분류를 위한 멀티플렉스 ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머{Multiplex PCR method for rapid classification of ESBL and PCR primer for PCR method}
도 1은 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법을 수행하여 5종의 기질확장형 β-락타마제(Extended Spectrum β-lactamases; 이하, ESBL라고 함) 유형을 확인한 결과를 보인 전기영동사진.
도 2 내지 도 8은 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법을 5개 균종 총82주에 적용한 결과를 보인 전기영동사진.
도 9는 종래의 ESBL 유형 분류법과 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법을 이용한 ESBL 유형 분류법을 비교한 도표.
본 발명은 기질확장형 β-락타마제(ESBL)의 신속분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 5종의 PCR 프라이머세트의 개발 및 이들 프라이머들을 동시에 적용하여 정확하고 신속하게 다수의 기질확장형 β-락타마제(ESBL)를 검출 및 분류할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법에 관한 것이다.
β-락탐(β-lactam)계 항균제는 세균의 세포벽 합성을 방해하여 항균력을 나타내게 되는데, β-락타마제(β-lactamase)는 β-락탐계 항균제의 β-락탐환을 가수 분해하여 항균력을 제거하는 효소로 세균이 이 효소를 생산하는 능력을 갖게 되면 β-락탐계 항균제에 대한 내성을 갖게 된다.
β-락타마제는 앰블러(Ambler)식 분류법(Livermore, 1995)에 따라 크게 Class A, B, C 및 D로 나눌 수 있으며 Class A는 페니실린(penicillin) 계열의 항균제에 활성이 높은 것으로 기질확장형 β-락타마제 (ESBL)가 속해 있는 분류군으로 이 효소를 암호화하는 내성 유전자가 주로 플라스미드(plasmid)에 위치하고 있기 때문에 균 사이의 서로 전이가 가능하며 ESBL은 3세대 세팔로스포린(cephalosporin)을 분해하는 β-락타마제를 의미한다.
Class B　β-락타마제는 효소의 활성에 아연을 필요로 하는 금속함유효소(metaloenzyme) 이고, Class C 효소는 세팔로스포린(cephalosporin)을 분해하는 Amp C라 불리는 효소군으로 이것에 유래되는 것으로 추정되는 플라스미드(plasmid) 매개 β-락타마제 CMY-1, MOX-1 및 FOX-1 생산 균주는 2세대 세팔로스포린(cephalosporin)에 내성을 보이고 3세대 세팔로스포린(cephalosporin)에 낮은 정도의 중등도 내성을 보이므로 광범위한 의미의 ESBL로 볼 수 있다. Class D는 옥살실린(oxalcillin) 분해능이 뛰어나다.
1980년대 초부터 사용한 3세대 세팔로스포린계 항균제를 이용한 감염병 치료는 다량의 Class A, D ESBL, Class C 효소 생성 균주를 출현시켰다. ESBL은 TEM을 비롯해 SHV, OXA, CTX 등 다양한 유형이 보고되고 있고 이것은 세계 전역에 퍼져있으며 국내외에서 현재 주요 병원체별로 ESBL 보유현황에 대한 조사(survey)는 거의 완료되었다.
ESBL은 그 유형에 따라 항균제 내성 경향에서 차이를 보이고 있고, 이들을 암호화하는 유전자들은 대부분 접합을 이용한 전달 능력이 있어 항균제 내성이 없는 다른 균주로 쉽게 항균제 내성의 원인이 되는 ESBL 생산능력을 전달할 수 있기 때문에 ESBL을 생산하는 균주 감염질환에 대한 효과적인 치료를 위해서는 신속한 ESBL 유형의 분류가 필요하다.
일반적으로 ESBL 진단 및 유형 분류 방법은 예를 들어 1) 클라불란산(clavulanic acid: CVA)의 존재 및 부재하에서 CTX, CAZ, AZT에 대한 MIC(최소 억제 농도)를 측정하는 방법, 2) 두 종류의 디스크를 사용하는 이중-디스크 시너지 방법, 3) 생산이 의심되는 병원체의 등전점을 측정한 후 추정되는 유형을 대상으로 개개의 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 유형을 확인하는 등전점 측정 및 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유형을 확인하는 방법 등이 행해지고 있다.
그러나 이들 방법은 박테리아 분리 및 배양을 위해 장시간이 소요되어 신속한 검출에 어려움이 있고, 다수의 병원체의 동시 진단에도 어려움이 있다. 특히, 등전점 측정 및 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법은 약 3일 정도의 시간이 소요되며 등전점으로 미루어 추측되는 유형만을 확인하므로 실제 보유 유전자중에 일부만이 확인될 가능성이 있는 문제점이 있다(도 9 참조).
따라서 ESBL 생산여부 확인 및 유형분류 시간을 단축시킴으로써 항균제 내성 보유 병원체의 전파를 조기에 차단할 수 있는 정확하고 신속한 ESBL 진단 및 유형 분류 방법에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점 및 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하여 신속하게 진단과 동시에 그 유형을 분류할 수 있어 정확하고 신속하게 기질확장형 β-락타마제(ESBL)를 검출, 분류할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 기질확장형 β-락타마제의 신속분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 PCR 프라이머들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 PCR 프라이머들을 포함하는 ESBL 검출 및 분류 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 ESBL 중 광범위하게 전파되는 병원체에서 최근 유행하고 있는 주 유형들인 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV형들 각각에 대한 PCR용 프라이머를 개발하고자 예의 연구하여 왔으며, 나아가 한번의 PCR 반응을 동시에 적용할 수 있도록 공통의 반응조건을 갖는 프라이머의 개발에 주력하여 왔다. 그 결과 5종의 ESBL 각각의 PCR용 프라이머를 합성하였으며, 개발된 5세트의 프라이머 모두를 PCR 반응에 동시에 적용하여 1회의 PCR 수행으로 5종의 ESBL을 동시에 검출 및 분류할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법에 있어서, ESBL 중 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV 유전자의 2이상의 표적서열을 다음 프라이머세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2이상의 PCR 프라이머세트를 사용함을 특징으로 하는 ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법을 제공한다.
본 발명에 의한 PCR용 프라이머세트 그룹은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CTX-M 검출을 위한 PCR용 프라이머세트, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 TEM 검출을 위한 PCR용 프라이머세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 OXA 검출을 위한 PCR용 프라이머세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 SHV 검출을 위한 PCR용 프라이머세트, 그리고 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 CMY 검출을 위한 PCR용 프라이머세트인 것을 특징으로 한다.
나아가 본 발명은 상기 프라이머세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2이상의 PCR 프라이머세트를 포함하는 ESBL 진단 및 분류 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 ESBL 중 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV형 각각에 대해 특이적인 프라이머세트는 각 이 유형을 생산하는 blaTEM, blaCMY, blaCTX -M, blaOXA 및 blaSHV 유전자들의 염기서열을 기초하여 합성된 것이다.
ESBL 중 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV형을 생산하는 유전자 검출을 위한 PCR 기법은 한 세트의 프라이머 -Forward 프라이머와 Revere 프라이머-를 이용하게 되는데, 이들 프리이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따 르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2 +의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
또한 본 발명에서와 같이 5종의 ESBL에 대한 PCR 프라이머를 혼합하여 동시에 한번에 PCR을 수행함으로써 분리한 각 병원체의 유전자를 1회에 확인하는 멀티플렉스 PCR 반응에서는, 프라이머 설계시 단독 PCR의 경우와 같은 조건이 더욱 엄격하게 요구되며, 또한 반응완료 후 겔상에서 증폭되는 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따른다. 반응조건의 설정에 있어서도 5세트의 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로, 단독 PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.
본 발명에 의해 제공되는 ESBL 검출 및 분류를 위한 5종의 프라이머세트는 이러한 멀티플렉스 PCR 기법에 적합하도록 개발된 것으로서, 1회의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있어 1회의 PCR 수행으로 5종의 ESBL을 동시에 고감도로 검출할 수 있다. 본 발명에서 개발된 5종의 ESBL에 대한 PCR용 프라이머세트 및 이들에 의한 PCR 증폭산물의 크기는 다음과 같다.
명칭( Name ) 서열( Sequence ) 표적유전자 크기 ( size )
CTX-M 6F GACAAAGAGAGTGCAACGGATG (서열번호 1) blaCTX -M 501 bp
CTX-M 506R TCAGTGCGATCCAGACGAAA (서열번호 2)
TEM 578F AGTGCTGCCATAACCATGAGTG (서열번호 3) blaTEM 431 bp
TEM 1009R CTGACTCCCC GTCGTGTAGATA (서열번호 4)
OXA 60F ATTATCTACAGCAGCGCCAGTG (서열번호 5) blaOXA 296 bp
OXA 355R TGCATCCACGTCTTTGGTG (서열번호 6)
SHV 175F GATGAACGCTTTCCCATGATG (서열번호 7) blaSHv 214 bp
SHV 388R CGCTGTTATCGCTCATGGTAA (서열번호 8)
CMY 52F ATTATCTACAGCAGCGCCAGTG (서열번호 9) blaCMY 116 bp
CMY 167R GCAATTTCAGCGTTTGTGGA (서열번호 10)
본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법은 1회의 PCR을 수행함으로써 ESBL 중 광범위하게 전파되는 병원체에서 최근 유행하고 있는 주 유형들인 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV형들을 신속 정확하게 진단과 동시에 그 유형을 분류할 수 있고 비용면에서 매우 경제적이다. 특히 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR 기법은 약 4시간 만에 진단과 분류가 가능하여, 기존 실험법으로 3일 이상 소요되던 ESBL 생산여부 확인 및 유형분류 시간을 단축시킴으로써 항균제 내성 보유 병원체의 전파를 조기에 차단할 수 있는 기반 형성에 기여할 것으로 기대된다(도 9 참조).
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ESBL 표준균주의 준비
1993년부터 2005년까지 임상에서 분리된 균주 가운데 ESBL 생산과 유형이 확인된 Enterobacer cloacea 3주, Escherichia coli 12주, Salmonella spp. 9주, Shigella spp. 21주 및 Klepsiella pneumoniae 37주를 대상으로 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법을 수행하였다.
실시예 2: ESBL 유형 확인을 위한 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법의 확립
진단 대상이 되는 유전자는 현재 ESBL로 가장 많이 문제시되는 TEM, CMY, CTX-M, OXA 및 SHV 유형을 생산하는 blaTEM, blaCMY, blaCTX -M, blaOXA 및 blaSHV 유전자들을 대상으로 하였고, 이 유형을 표적으로 한 특이적인 프라이머(primer)를 제작(표 1 참조)하여 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)법으로 유형을 확인하였다.
반응 혼합액은 10X PCR 완충용액 2.5㎕, dNTP 4㎕, 19pM/㎕의 각 유형의 표적용 프라이머 5세트를 0.5㎕씩, Ex Taq 중합효소 0.5㎕ 넣은 후 최종 반응액 25㎕을 구성하였다. 반응과정은 94℃에서 5분간 변성시킨 후 반응은 94℃ 1분, 61℃ 1분, 72℃ 1분을 한 주기로 30 사이클(cycle) 조건으로 증폭시켰다.
반응 종료 후 PCR 증폭산물을 2 % 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이 각 유형의 ESBL 암호화 유전자를 가지고 있는 것으로 이미 확인된 S. sonnei 와 K. pneumoniae ATCC700603을 대상으로 표 1에서와 같이 blaCTX -M 501bp , blaTEM 431bp, blaOXA 296bp, blaCMY 214bp, 및 blaSHV 116bp 유전자 크기의 양성 밴드(band)를 확인할 수 있었다.
도 1에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 1레인은 CTX, TEM (S. sonnei 99-292), 2레인은 TEM (S. sonnei 99-511), 3레인은 SHV (K. pneumoniae ATCC700603), 4레인은 TEM, OXA, CMY (S. sonnei 99-1505), 5레인은 음성 대조를 나타낸다.
한편, 도 1에 나타난 바와 같이 각 유형의 ESBL에 해당하는 양성 밴드 이외의 비특이적 밴드가 나타나지 않고 있어 각 유형에 특이하게 반응하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법의 적용시험
본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법을 5개 균종 총 82주에 적용해 보았다. 이때 PCR 반응 조건은 실시예 2와 동일하였다. 반응 종료 후 PCR 증폭산물을 2 % 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 도 2 내지 도 8에 나타내었다. 도 2에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 1 레인은 E. coli 01-003, 2 레인은 E. coli 01-004, 3 레인은 K. pneumoniae 01-013, 4 레인은 E. coli 01-018, 5 레인은 E. coli 01-035, 6 레인은 K. pneumoniae 01-038, 7 레인은 K. pneumoniae 01-120, 8 레인은 K. pneumoniae 01-122, 9 레인은 K. pneumoniae 01-123, 10 레인은 E. coli 01-132, 11 레인은 K. pneumoniae 01-162, 12 레인은 K. pneumoniae 01-1171, 13 레인은 K. pneumoniae 01-197, 14 레인은 K. pneumoniae 01-221, 15 레인은 K. pneumoniae 01-250을 나타낸다.
도 3에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 16 레인은 E. coli 01-245, 17 레인은 K. pneumoniae 02-065, 18 레인은 K. pneumoniae 02-199, 19 레인은 E. coli 02-211, 20 레인은 K. pneumoniae 02-219, 21 레인은 K. pneumoniae 02-475, 22 레인은 K. pneumoniae 02-514, 23 레인은 E. coli 02-542, 24 레인은 K. pneumoniae 02-581, 25 레인은 K. pneumoniae 02-696, 26 레인은 K. pneumoniae 03-028, 27 레인은 E. coli 03-034 , 28 레인은 E. coli 03-038, 29 레인은 K. pneumoniae 03-063, 30 레인은 K. pneumoniae 03-094을 나타낸다.
도 4에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 31 레인은 K. pneumoniae 03-127, 32 레인은 K. pneumoniae 03-137, 33 레인은 K. pneumoniae 03-147, 34 레인은 K. pneumoniae 03-167, 35 레인은 K. pneumoniae 03-186, 36 레인은 K. pneumoniae 03-189, 37 레인은 K. pneumoniae 03-222, 38 레인은 K. pneumoniae 03-241, 39 레인은 E. coli 03-252, 40 레인은 K. pneumoniae 04-030, 41 레인은 K. pneumoniae 04-074, 42 레인은 K. pneumoniae 04-083, 43 레인은 K. pneumoniae 04-105, 44 레인은 E. coli 04-128, 45 레인은 E. cloacea 04-163 을 나타낸다.
도 5에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 46 레인은 K. pneumoniae 05-048, 47 레인은 K. pneumoniae 05-075, 48 레인은 K. pneumoniae 05-089, 49 레인은 K. pneumoniae 05-093, 50 레인은 E. cloacea 04-172, 51 레인은 E. cloacea 04-199, 52 레인은 K. pneumoniae 05-224 을 나타낸다.
도 6에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 1 레인은 S. Senftenberg 93-337, 2 레인은 S. Senftenberg 93-338, 3 레인은 S. Enteritidis 97-299, 4 레인은 S. Enteritidis 97-333, 5 레인은 S. Montevideo 01-1792, 6 레인은 S. Montevideo 01-2182, 7 레인은 S. Enteritidis 02-2072, 8 레인은 S. Suberu 04-14304, 9 레인은 S. Enteritidis 04-17563을 나타낸다.
도 7에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 1 레인은 S. sonnei 99-845, 2 레인은 S. sonnei 99-1497, 3 레인은 S. sonnei 99-1503, 4 레인은 S. sonnei 99-2495, 5 레인은 S. sonnei 99-2496, 6 레인은 S. sonnei 99-2497, 7 레인은 S. sonnei 99-2696, 8 레인은 S. sonnei 99-2733, 9 레인은 S. sonnei 99-3087 을 나타낸다.
도 8에서 M 레인은 100bp 표준 마커(marker), 10 레인은 S. sonnei 99-3093, 11 레인은 S. sonnei 99-3095, 12 레인은 S. sonnei 99-4263, 13 레인은 S. sonnei 99-6087, 14 레인은 S. sonnei 00-207, 15 레인은 S. sonnei 00-1989, 16 레인은 S. sonnei 00-2028, 17 레인은 S. sonnei 00-2852, 18레인은 S. sonnei 01-2833을 나타낸다.
PCR 증폭 산물 확인 결과 모두 기존 유형과 같은 결과를 보였고 이 가운데 29주에서는 기존의 실험을 통해 밝혀진 유형 외에도 1에서 3개까지의 ESBL 암호화 유전자를 추가로 탐색 분류할 수 있었다 (표 2, 3, 4, 5, 6 참조). 표 2는 Enetrobacter cloacea 균주의 ESBL　유형 확인 결과를 나타내고, 표 3은 Escherichia coli 균주의 ESBL　유형 확인 결과를 나타내고, 표 4는 Salmonella spp. 균주의 ESBL　유형 확인 결과를 나타내고, 표 5는 Shigella spp. 균주의 ESBL　유형 확인 결과이며, 표 6은 Klepsiella pneumoniae 균주의 ESBL　유형 확인 결과를 나타낸다. 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법은 실험 시간도 약 4시간만이 소요되어, 기존의 진단 및 분류 방법보다 시간적, 경제적으로 훨씬 우수한 방법으로 확인되었다.
연도(Year) 번호(No.) 계통(Strain) 기존 확인 유형 Multiplex PCR을 이용한 유형 확인
2004 04-163 E. cloacea SHV
2005 05-172 E. cloacea SHV SHV
2005 05-199 E. cloacea SHV
연도(Year) 번호(No.) 계통(Strain) 기존 확인 유형 Multiplex PCR을 이용한 유형 확인
2001 01-003 E. coli TEM TEM
2001 01-004 E. coli TEM TEM
2001 01-018 E. coli TEM TEM, OXA
2001 01-035 E. coli TEM TEM
2001 01-132 E. coli CTX, TEM CTX, TEM
2001 01-245 E. coli CTX, TEM CTX, TEM
2002 02-211 E. coli CTX, SHV, TEM CTX, SHV, TEM
2002 02-542 E. coli CMY CMY, CTX , OXA , TEM
2003 03-034 E. coli SHV SHV
2003 03-038 E. coli SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-252 E. coli SHV, TEM SHV, TEM
2004 04-128 E. coli CTX CTX, OXA , CMY
연도(Year) 번호(No.) 계통(Strain) 기존 확인 유형 Multiplex PCR을 이용한 유형 확인
1993 93-337 S. Senftenberg OXA OXA, CMY
1993 93-338 S. Senftenberg OXA OXA, CMY
1997 97-299 S. Enteritidis TEM TEM
1997 97-333 S. Enteritidis TEM TEM
2001 01-1792 S. Montevideo TEM TEM
2001 01-2182 S. Montevideo TEM TEM
2002 02-2072 S. Enteritidis TEM TEM
2004 04-14304 S. Suberu TEM TEM
2004 04-17563 S. Enteritidis TEM, OXA, SHV TEM, OXA, SHV, CMY
연도(Year) 번호(No.) 계통(Strain) 기존 확인 유형 Multiplex PCR을 이용한 유형 확인
1999 99-292 S. sonnei CTX, TEM CTX, TEM
1999 99-511 S. sonnei TEM TEM
1999 99-845 S. sonnei TEM TEM
1999 99-1497 S. sonnei TEM TEM
1999 99-1503 S. sonnei TEM TEM
1999 99-1505 S. sonnei TEM TEM, OXA , CMY
1999 99-2495 S. sonnei TEM TEM
1999 99-2496 S. sonnei TEM TEM
1999 99-2497 S. sonnei TEM TEM
1999 99-2696 S. sonnei TEM TEM
1999 99-2733 S. sonnei TEM TEM
1999 99-3087 S. sonnei TEM TEM
1999 99-3093 S. sonnei TEM TEM
1999 99-3095 S. sonnei TEM TEM
1999 99-4263 S. sonnei TEM TEM
1999 99-6087 S. sonnei CMY CMY
2000 00-207 S. sonnei TEM TEM
2000 00-1989 S. sonnei CTX, TEM CTX, TEM
2000 00-2028 S. sonnei CTX CTX, TEM
2000 00-2852 S. sonnei TEM TEM, CTX
2001 01-2833 S. sonnei TEM TEM
연도(Year) 번호(No.) 계통(Strain) ESBL Type Multiplex PCR을 이용한 유형 확인
2001 01-013 K. pneumoniae TEM
2001 01-038 K. pneumoniae TEM TEM, OXA , SHV , CMY
2001 01-120 K. pneumoniae TEM TEM, SHV
2001 01-122 K. pneumoniae TEM TEM
2001 01-123 K. pneumoniae CMY, TEM CMY, TEM, SHV
2001 01-162 K. pneumoniae SHV, CMY SHV, CMY, OXA
2001 01-171 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2001 01-197 K. pneumoniae CTX, TEM CTX, TEM, SHV
2001 01-221 K. pneumoniae SHV SHV
2001 01-250 K. pneumoniae SHV SHV
2002 02-065 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2002 02-199 K. pneumoniae CTX, TEM CTX, TEM, SHV
2002 02-219 K. pneumoniae CTX, TEM CTX, TEM, SHV
2002 02-475 K. pneumoniae SHV, CMY SHV, CMY, OXA
2002 02-514 K. pneumoniae CTX, TEM CTX, TEM, SHV
2002 02-581 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM, CTX
2002 02-696 K. pneumoniae TEM TEM、SHV , CTX
2003 03-028 K. pneumoniae SHV SHV
2003 03-063 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-094 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-127 K. pneumoniae TEM TEM, SHV
2003 03-137 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-147 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-167 K. pneumoniae TEM TEM, SHV
2003 03-186 K. pneumoniae SHV, CMY SHV, CMY, OXA , TEM
2003 03-189 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-222 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2003 03-241 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2004 04-030 K. pneumoniae SHV SHV
2004 04-074 K. pneumoniae SHV, TEM SHV, TEM
2004 04-083 K. pneumoniae TEM TEM, SHV
2004 04-105 K. pneumoniae SHV SHV
2005 05-048 K. pneumoniae SHV, DHA SHV
2005 05-075 K. pneumoniae SHV SHV
2005 05-089 K. pneumoniae SHV SHV
2005 05-093 K. pneumoniae TEM TEM
2005 05-224 K. pneumoniae TEM , SHV
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 5종의 프라이머세트들은 공통의 PCR 조건을 가지고 있어 1회의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것이 가능하여, 이들 5종의 프라이머세트들을 모두 동시에 이용하는 본 발명에 의한 멀티플렉스 PCR 기법은 1회의 PCR을 수행함으로써 분리된 5종의 ESBL를 정확하고 신속하게 진단하고 동시에 유형 분류할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.
따라서 본 발명은 항균제 내성 보유 병원체의 전파를 조기에 차단할 수 있고 신속하고 정확한 감염증 치료제 처방에 매우 유용한 발명이라 할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법에 있어서,
    ESBL 중 TEM, CMY, CTX-M, OXA, SHV 유전자의 2 이상의 표적서열을 다음 프라이머세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2 이상의 PCR 프라이머세트를 사용하여 검출 및 분류함을 특징으로 하는 ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법;
    (a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CTX-M 검출을 위한 PCR용 프라이머세트;
    (b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 TEM 검출을 위한 PCR용 프라이머세트;
    (c) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 OXA 검출을 위한 PCR용 프라이머세트;
    (d) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 SHV 검출을 위한 PCR용 프라이머세트; 및
    (e) 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 CMY 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  2. 제1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CTX-M 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  3. 제1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 TEM 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  4. 제1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 OXA 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  5. 제1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 SHV 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  6. 제1항에 기재된 멀티플렉스 PCR 기법에 사용되는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 CMY 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  7. 다음 프라이머세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2이상의 PCR 프라이머세트를 포함하는 ESBL 진단 및 분류 키트;
    (a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CTX-M 검출을 위한 PCR용 프라이머세트;
    (b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 TEM 검출을 위한 PCR용 프라이머세트;
    (c) 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 OXA 검출을 위한 PCR용 프 라이머세트;
    (d) 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 SHV 검출을 위한 PCR용 프라이머세트; 및
    (e) 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 CMY 검출을 위한 PCR용 프라이머세트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 기법은,
    10X PCR 완충용액 2.5㎕, dNTP 4㎕, 19pM/㎕의 각 유형의 표적용 프라이머 5세트를 0.5㎕씩, Ex Taq 중합효소 0.5㎕ 넣은 후 최종 반응액 25㎕을 구성하는 것을 특징으로 하는 ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 반응과정은 94℃에서 5분간 변성시킨 후 반응은 94℃ 1분, 61℃ 1분, 72℃ 1분을 한 주기로 30 사이클(cycle) 조건으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 ESBL 검출 및 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법.
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