CN106755386A - 一种畜禽源大肠杆菌β‑内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种畜禽大肠杆菌对β‑内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒,该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的三对PCR引物、模板制备试剂和细菌耐药基因多重PCR扩增试剂。较传统药敏试验,该多重方法将检测时间从数天缩短至1天内完成。病原菌经常含有多种β‑内酰胺酶基因,而该技术满足了同时检测多种基因的需求,提高了检测效率、准确性和特异性。
Description
发明领域
本发明涉及大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术,属于医学分子生物学领域,具体是关于畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术方法及其在畜禽大肠杆菌耐药性检测中的应用。
背景技术
β-内酰胺类药物是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类药物,包括青霉素、头孢菌素、头霉素、单环β-内酰胺类、β-内酰胺酶阻滞剂以及碳青霉烯类药物。各种β-内酰胺类抗生素的作用机制均相似,都能抑制胞壁粘肽合成酶,从而阻碍细胞壁粘肽合成,使细菌胞壁缺损,菌体膨胀裂解。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素,随着这类抗生素的广泛使用和致病菌的变迁,产生了细菌对这类抗生素的耐药性问题,细菌产生超广谱β-内酰胺酶是大部分细菌耐药的原因之一。
根据氨基酸序列的同源性,β-内酰胺酶可分为不同基因型。目前可分为TEM、SHV、CTX-M、OXA等基因型,其中以TEM和SHV两种基因型最多,呈世界性分布,不同地区的基因型有差异。例如:美国主要流行TEM和SHV型;阿根廷以CTX-M型为主;西班牙以CTX-M-10为主,其次是SHV-2和TEM-4;希腊以SHV-5为主,其次是CTX-M型;我国主要流行TEM、SHV、CTX-M型。本专利在以畜禽大肠杆菌分子流行病学调查的基础上,建立了TEM、SHV、CTX-M型β-内酰胺酶耐药基因多重PCR检测方法。
传统的细菌耐药性检测方法主要有常规药敏试验、抗性蛋白检测方法和耐药性分子检测方法等。这些方法的特点是易操作、成本低,药物可灵活选择,缺点是操作繁琐、经验依赖性强、报告结果慢。因为抗菌药物的广泛使用及耐药基因的多样性、复杂性,单一临床病原菌经常含有多个耐药基因,为了提高检测的准确性和特异性,需要对多种耐药基因进行检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于,提供一种快速检测畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的三重PCR检测试剂盒及其特异性引物、使用方法,能显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性的检测灵敏度和检测效率,降低检测成本,以克服现有技术存在的成本高、耗时长等诸多不足。
本发明的技术内容:一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒,含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂,所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL~50mL和处理液2.5mL~5.0mL组成,所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCR MasterMix 650μL~1300μL,耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL~800μL,灭菌双蒸水1mL~2mL和阴性对照100μL~200μL、阳性对照100μL~200μL。
所述耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下:
CTX-M:For:5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3;
Rev-1:5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3;
TEM:For:5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3;
Rev-2:5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3;
SHV:For:5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3;
Rev-3:5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。
本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤:
PCR模板的制备方法:
(1)普通培养基摇瓶培养增菌;
(2)取1mL经3-6h培养的菌液于无菌1.5mL EP管中,8000r/min离心3分钟,弃上清,再加入1mLPCR模板制备试剂洗涤液,重复离心一次,弃上清,最后加入100μLPCR模板制备试剂样品处理液,震荡混匀后备用。
畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成:
(1)取2xTaqPCR MasterMix 25μL、耐药基因引物2.9μL于无菌PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好模板2μL,用灭菌双蒸水补至50μL即可;
PCR扩增参数为:
(1)95℃预变性5min;
(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s,共35个循环,
(3)72℃延伸7min,取出至4℃保存备用;
耐药基因检测结果判定:取8μLPCR产物,于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,100V电压,电泳30min,于凝胶成像仪下拍照判定结果,其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。
本发明有益效果:本发明将显著提高畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因的检测效率;本发明所建立试剂盒适用于检测畜禽源致病大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性,能实现临床病例和产品污染程度的快速评价,为该类疾病的防控提供技术支持与理论依据,并为动物性食品安全检测提供可靠技术。
本发明与现有技术相比,具有以下技术效果和特点:
(1)便捷性好:本发明以PCR为技术基础,相比传统病原分离鉴定、药物敏感试验,不仅能提高检测效率,还降低了检测成本,缩短了检测时间,该多重方法将检测时间从数天缩短至1天内完成。
(2)特异性好:本发明应用分子生物学技术,针对特定基因设计引物,保证检测结果的特异性。
(3)敏感性高:本发明基于PCR技术建立的PCR试剂盒,可检测病原核酸量最低至1.0×103copies/μL。
本发明所提供的多重PCR技术正满足了对多种耐药基因进行检测的需求,并具有敏感、特异、快速等优点,可以对微量目的基因进行检测,具有灵敏高效的特点。本发明设计了3对特异性引物,构建多重PCR反应体系,以达到快速检测β-内酰胺类耐药基因的目的,多重PCR技术最有研究前景和应用价值。
附图说明
图1为本发明畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的制备流程图。
具体实施方式
本发明所述畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂,其特征在于:所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL~50mL和处理液2.5mL~5.0mL组成,所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCR MasterMix 650μL~1300μL,耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL~800μL,灭菌双蒸水1mL~2mL和阴性对照100μL~200μL、阳性对照100μL~200μL。
所述三种耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下:
CTX-M:For:5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3
Rev-1:5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3
TEM:For:5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3
Rev-2:5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3
SHV:For:5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3
Rev-3:5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3
本发明所述试剂盒使用方法包括以下步骤:
PCR模板的制备方法:
(1)普通培养基摇瓶培养增菌;
(2)取1mL经3-6h培养的菌液于无菌1.5mL EP管中,8000r/min离心3分钟,弃上清,再加入1mLPCR模板制备试剂洗涤液,重复离心一次,弃上清,最后加入100μLPCR模板制备试剂样品处理液,震荡混匀后备用。
畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成:
(1)取2xTaqPCR MasterMix 25μL、耐药基因引物2.9μL于无菌PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好模板2μL,用灭菌双蒸水补至50μL即可。
PCR扩增参数为:
(1)95℃预变性5min;
(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s,共33个循环,
(3)72℃延伸7min,取出至4℃保存备用。
耐药基因检测结果判定:
取8μLPCR产物,于1.2%琼脂糖凝胶电泳中,100V电压,电泳30min,于凝胶成像仪下拍照判定结果,450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。
详细示例:
1、配制反应液
(1)配制引物混合液
A.设计并合成引物 针对大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因,用软件Primer Premier 5.0分别设计一对特异性引物,并合成引物。
B.制备引物混合液 将三对引物稀释至浓度10μmol/L后,各取100μL,混匀。
(2)多重PCR反应缓冲液
取适量Taq Polymerase、dNTP each、Tris-HCl(pH8.3)、KCl、MgCl2储备液溶于500μL双蒸水,使Taq Polymerase终浓度为0.1U/μl、dNTP each终浓度为500μmol/L、Tris-HCl(pH8.3)终浓度为20mmol/L、KCl终浓度为100mmol/L、MgCl2终浓度为3mmol/L。于-20℃备用。
2、制备阴/阳性对照
(1)制备阳性对照
取普通营养琼脂培养基中大肠杆菌β-内酰胺类药物3种耐药株单个菌落分别接种于普通营养液体培养基中培养24h的培养液1.5mL以4℃10000r/min离心1min,弃上清,提取3种大肠杆菌耐药菌株基因组DNA。
(2)制备阴性对照
以灭菌超纯水为阴性对照。
3、检测过程
(1)反应体系
取无菌PCR反应管,按表1所示依次加入所需试剂;
表1 试剂添加及用量
试剂及添加量 | 阳性对照 | 阴性对照 | 待检样本 |
反应缓冲液 | 25μL | 25μL | 25μL |
引物混合液 | 2.9μL | 2.9μL | 2.9μL |
阳性对照 | 3μL | 0 | 0 |
阴性对照 | 0 | 3μL | 0 |
待检样本 | 0 | 0 | 1μL~3μL |
灭菌超纯水 | 补足50μL | 补足50μL | 补足50μL |
(2)反应程序
将PCR反应管混匀瞬时离心后,加入20μL灭菌液体石蜡覆于液面上,并置PCR反应管于PCR扩增仪中,以95℃预变性5min;95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s,共35个循环;72℃延伸7min,取出至4℃保存备用。
(3)结果判定
取8μL扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果,结果判定:阳性对照应出现清晰的目的条带,阴性对照无任何条带出现;若待检扩增模板出现与阳性对照相同条带,则判定待检样本阳性,若无任何条带出现则判定待检样本阴性。根据耐药基因片段大小与所示阳性对照基因一致性,判定是存在哪种耐药基因。
Claims (3)
1.一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒,其特征在于:含有PCR模板制备试剂和耐药基因多重PCR扩增试剂,所述PCR模板制备试剂是由样品洗涤液25mL~50mL和处理液2.5mL~5.0mL组成,所述耐药基因多重PCR扩增试剂包括2×TaqPCRMasterMix 650μL~1300μL,耐药基因CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性引物400μL~800μL,灭菌双蒸水1mL~2mL和阴性对照100μL~200μL、阳性对照100μL~200μL。
2.根据权利要求1所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒,其特征在于:所述的耐药基因即CTX-M基因、TEM基因、SHV基因的特异性上下游引物序列如下:
CTX-M:For:5-AAGGCGTTTTGACAGACTATTCAT-3;
Rev:5-CCGTTTCCGCTATTACAAACC-3;
TEM:For:5-TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3;
Rev:5-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3;
SHV:For:5-TGACGGTCGGCGAACTCT-3;
Rev:5-GGGTATCCCGCAGATAAATCAC-3。
3.如权利要求1或2所述的一种畜禽源大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒的使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
PCR模板的制备方法:
(1)普通培养基摇瓶培养增菌;
(2)取经3-6h培养的菌液于无菌EP管中,离心,弃上清,再加入PCR模板制备试剂洗涤液,重复离心一次,弃上清,最后加入PCR模板制备试剂样品处理液,震荡混匀后备用;
畜禽大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测技术中试剂的组成:
(1)取2xTaqPCR MasterMix、耐药基因引物于无菌PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好模板,用灭菌双蒸水补至50μL即可;
PCR扩增参数为:
(1)95℃预变性5min;
(2)95℃变性55s、59℃退火50s、72℃延伸55s,共35个循环,
(3)72℃延伸7min,取出至4℃保存备用;
耐药基因检测结果判定:取PCR产物,于1.2%琼脂糖凝胶中电泳,100V电压,电泳30min,于凝胶成像仪下拍照判定结果,其中450bp、860bp、950bp的条带分别指示SHV基因、TEM基因、CTX-M基因。
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