CN105593377A - 检测β-内酰胺抗生素抗性的细菌的诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用<i>blaCTX</i><i>-M</i>特异性寡核苷酸探针确定生物样品中的β-内酰胺抗性细菌的存在的方法。提供了此类探针以及适于扩增编码CTX-M的DNA的引物。
Description
发明领域
本发明涉及分子诊断、特别是用于确定生物样品中的β-内酰胺抗性细菌的存在的领域。
发明背景
细菌对抗微生物药诸如抗生素的抗性在全世界是严重且正在发展的健康问题。在革兰氏阴性细菌间,抗药性的最突出原因是β-内酰胺酶的出现,所述β-内酰胺酶破坏β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环。超广谱β-内酰胺酶(ESBL)(β-内酰胺酶的重要亚群)能够赋予对机构和门诊护理中使用的最常见的β-内酰胺抗生素(诸如青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类)的抗性。ESBL也可以赋予对非β-内酰胺抗生素诸如喹诺酮类、氨基糖苷类和甲氧苄氨嘧啶的多药抗药性,缩小了治疗选项。
产生ESBL的细菌最初在1980年代早期发现于住院患者间,特别是重症监护病房中的最脆弱的患者,但现在也在基于社区的患者间传播。ESBL相关感染症状主要包括尿路感染,其次包括腹腔内感染。逃至血流后,产生ESBL的细菌可导致败血症或其他严重到足以需要住院治疗的感染。
迄今在世界上已经鉴定了超过十种不同类型的ESBL。到目前为止,TEM和SHV酶已经形成最常见的ESBL类型,但从21世纪开始,已经越来越清楚的是,ESBL类型的流行率的变化正在发生。CTX-M酶已经在很大程度上代替且在数量上超过其他类型的ESBL,且现在被认为是临床上最重要亚类的ESBL。
据推测,编码CTX-M的blaCTX-M基因源自克吕沃尔氏属种(Kluyvera spp)的染色体编码的酶,但如今作为具有在不同的细菌种群之间移动的能力的质粒缀合基因存在。blaCTX-M的初始载体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis),但进一步携带blaCTX-M的细菌菌株越来越出现。迄今已经报道了超过124种不同的CTX-M类型。对于CTX-M类型的精确分类没有一致意见,但根据D'Andrea (Int.J.Med., 2013. 印刷前电子出版),主要的CTX-M组群是CTX-M-1、-2、-8、-9、-25和KLUC。各亚组内的氨基酸变化小于5%,而组群间的变化为至少10%。
ESBL产生者的检测和鉴定是至关重要的,不仅因为受感染患者的延迟识别和不适治疗已经与增加的死亡率相关,而且还限制这些多药抗性微生物的传播。广泛使用的灵敏性测试诸如纸片扩散和稀释抗微生物敏感性测试以及验证测试(大多基于克拉维酸和头孢菌素之间的协同作用)便宜,且相对容易使用。然而,此类测试是费时的,且受困于有限的灵敏度。
在基因水平测定ESBL代表用于鉴定和分型blaCTX-M基因的替代方法。为此,已经开发了许多基于PCR的测定法。此类测定法是精确和灵敏的,但其中许多需要一连串的扩增子特异性测序引物以及PCR产物的劳动密集且耗时的分析,例如通过DNA测序。可以,至少部分地,通过通用的简并CTX-M引物或通过采用如Birkett等人于J. Med. Microbiol., 2007,56:52-55中所公开的基于实时PCR的方法(其允许PCR产物的同时扩增和分析)来避免这些缺点。
与在核苷酸水平鉴定blaCTX-M基因型的方法相关的一个进一步缺点是伴随检测高度同源的非blaCTX-M基因序列,特别是产酸克雷伯氏菌的染色体K1基因,引起假阳性结果,因此,有必要使用验证测试。
专利公开US 2009/0163382公开了用于基于许多不同的抗生素抗性基因检测抗生素抗性的细菌物种的基于微阵列的方法的引物和探针。然而,通过该方法仅检测到124种不同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。
此外,Fu等人(J. Microbiol. Methods, 2012, 89:110-118)公开了抗药基因检测的DNA微阵列。该阵列含有来自17类抗药基因的总共115种探针。然而,通过该方法仅检测到124种不同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。
为了确保患者安全性、ESBL的最佳治疗和扩散控制,本领域需要用于确定生物样品中的ESBL的存在的高度灵敏和特异的宽范围测定法。
发明概述
在一个方面,本发明涉及确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法。所述方法包括以下步骤:
a) 提供怀疑含有产生CTX-M的细菌的生物样品;
b) 如果有的话,扩增所述样品中的编码CTX-M的DNA;和
c) 使用至少一个探针检测扩增的DNA,所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交,所述区域对应于CTX-M-15中的SEQ ID NO:23的核苷酸397-617的区域,且所述探针包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸;
其中步骤b)和c)可以单独或同时进行。
在本方法的一些实施方案中,所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交,所述区域对应于CTX-M-15中的SEQ ID NO:23的核苷酸503-539的区域。本领域技术人员可以容易识别其他CTX-M变体中的对应blaCTX-M区域。换言之,本实施方案不限于与blaCTX-M-15杂交的探针,但涵盖与任何blaCTX-M变体杂交的探针。
在本方法的一些其他实施方案中,所述探针可以二分为5'-探针和3'-探针。在一些又进一步实施方案中,所述5'-探针包含SEQ ID NO:34、35、或63中记载的核酸序列,和/或所述3'-探针包含SEQ ID NO:44、45、或70中记载的核酸序列。所述探针也可以与本文公开的序列具有至少80%的序列同一性,只要它们保留它们在正常杂交条件下与blaCTX-M基因杂交的能力。
在本方法的一些其他实施方案中,用包含SEQ ID NO:1、2、或61中记载的核酸序列的正向引物和包含SEQ ID NO:11 或12中记载的核酸序列的反向引物进行扩增步骤。
所述引物也可以与本文公开的序列具有至少80%的序列同一性,只要它们保留它们在正常PCR引物杂交条件下扩增blaCTX-M基因的能力。
在进一步方面,本发明提供分别能够扩增和杂交blaCTX-M的寡核苷酸引物和探针。所述探针可以包含与SEQ ID NO:34、35、44、45、63、或70中任一者中记载的序列或与SEQ IDNO:24 或SEQ ID NO:72的至少10个连续核苷酸具有至少80%序列同一性的核酸序列,只要它们保留它们在正常杂交条件下与blaCTX-M基因杂交的能力。在一些实施方案中,还提供包含至少三种不同的寡核苷酸分子的寡核苷酸探针混合物,所述寡核苷酸分子彼此独立地各自包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中包含的核酸序列的至少10个连续核苷酸。在一些实施方案中,衍生自SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72的探针可以作为二分的双探针存在。所述引物,进而,可以包含与SEQ ID NO:1、2、11、12、或61中记载的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列,只要它们保留它们在正常PCR引物杂交条件下扩增blaCTX-M基因的能力。
值得注意的是,关于本方法所公开的任何特征适用于本引物和探针,反之亦然,如果适用的话。
在以下附图、详述、实例、附表和从属权利要求中记载了本发明的其他方面、具体实施方案、目标、细节和优点。
附图概述
以下,将借助参考附图的优选实施方案更详细地描述本发明,其中
图1是说明基于螯合物互补的检测方法的原理的示意图(Karhunen等人, Anal.Chem., 2010, 82:751-754)。在图1A中,不存在目标寡核苷酸,因此,没有发生螯合物互补。在图1B中,存在目标寡核苷酸,且在镧系元素-离子-载体-螯合物-缀合的探针和天线-缀合的探针紧密接近结合至目标寡核苷酸之后能够螯合物互补。图2说明本引物在基于SYBR®Green I的PCR中的表现。在本实验中,分别使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12 (正方形)、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11 (圆形)、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:12 (三角形)和SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:11 (菱形)的正向和反向引物混合物扩增初始10000个基因组拷贝的CTX-M-9-组群-阳性(空心符号)或CTX-M-阴性(实心符号)大肠杆菌。无模板DNA的对照用上面解释的符号显示于虚线中。显示用三个平行反应获得的平均结果。RFU,相对荧光单位。
图3说明K1扩增与blaCTX-M扩增的区别。图3A显示用0(圆形)、1000(三角形)或10000(正方形)个基因组拷贝的CTX-M-1-组群-阳性的大肠杆菌或10000个基因组拷贝的产酸克雷伯氏菌(叉形)的代表性反应的PCR扩增图。图3B显示对应的扩增产物的解链曲线。叠加用初始1000或10000个基因组拷贝的CTX-M阳性大肠杆菌的扩增产物的曲线。RFU,相对荧光单位。
图4显示当两个独立的CTX-M-1-组群(圆形)、CTX-M-2-组群(三角形)或CTX-M-9-组群-阳性(正方形)大肠杆菌样品、三个独立的产酸克雷伯氏菌样品(叉形)和一个CTX-M-阴性大肠杆菌样品(叉形)以10000个基因组拷贝/反应的量用作模板时作为三个平行反应的平均值的基于螯合物互补的PCR扩增图。在本实验中,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11的引物混合物与Eu-探针(SEQ ID NO:35)和天线-探针(SEQ ID NO:45)混合物(0.05 µM的各个别探针)一起使用。仅CTX-M-阳性样品提供与背景信号可区别的信号。
图5表明作为三个独立反应的平均值的本诊断的基于螯合物互补的PCR方法的分析灵敏度。来自CTX-M-1-组群-阳性(图5A)、CTX-M-2-组群-阳性(图5B)或CTX-M-9-组群-阳性(图5C)大肠杆菌样品的DNA以10000(圈形)、1000(三角形)、100(正方形)、10(菱形)、1(减号)、0.1(加号)、0.01(无符号的线)或0(叉形)个基因组拷贝/PCR反应用作模板。阈值循环是其中反应信号超过阈值水平(信号背景比1.5)的PCR循环。
图6呈现作为三个独立反应的平均值的用SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物和SEQID NO:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于螯合物互补的PCR的分析特异性的结果。三十个CTX-M-阳性样品(叉形)以100个基因组拷贝/反应的量用作模板。二十五个CTX-M-阴性样品(三角形)以100 000个基因组拷贝/反应的量用作模板。仅CTX-M-阳性样品产生与背景信号可区别的信号。
图7说明作为三个独立反应的平均值的用SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物和SEQID NO:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于螯合物互补的PCR的分析灵敏度。来自CTX-M-2-组群-阳性样品的DNA以100 000(无符号的线)、10000(圈形)、1000(三角形)、100(正方形)、10(菱形)、1(减号)、0.1(加号)或0(叉形)个基因组拷贝/PCR反应用作模板。用CTX-M-1-组群、CTX-M-8-组群、CTX-M-9-组群或CTX-M-25-组群-阳性样品获得了类似的结果。
图8表明使用CTX-M-2-阳性细胞作为模板用细菌细胞的用SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物和SEQ ID NO:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于螯合物互补的PCR的表现。该图的数据点代表三个独立反应的平均值。在分析之前不从细菌细胞分离DNA,但将细胞以300 000(无符号的线)、30000(圈形)、3 000(三角形)、300(正方形)、30(菱形)、3(减号)、0.3(加号)或0(叉形)个菌落形成单位/PCR反应完整地作为模板添加至PCR反应。
发明详述
本发明涉及用于确定生物样品中的产生β-内酰胺酶、尤其是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的细菌的存在的方法和装置。更具体地,产生ESBL的细菌是产生CTX-M的细菌。
如本文所使用,术语“超广谱β-内酰胺酶”或“ESBL”是指能够通过降解所有β-内酰胺抗生素共有的β-内酰胺环结构提供对β-内酰胺抗生素诸如青霉素类、头孢菌素类(例如,头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟和氧基亚氨基-单酰胺氨曲南)和单环内酰胺的抗菌特性的抗性或使β-内酰胺抗生素诸如青霉素类、头孢菌素类(例如,头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟和氧基亚氨基-单酰胺氨曲南)和单环内酰胺的抗菌特性失活的任何酶。
如本文所使用,术语“CTX-M”是指ESBL的亚组的任何成员,即比其他氧基亚氨基头孢菌素具有显著更大的针对头孢噻肟的活性的质粒编码的酶。本领域技术人员理解,术语“CTX-M”不仅涵盖至今鉴定的至少124种不同的blaCTX-M编码的酶,而且涵盖在未来发现的任何CTX-M种类。因此,不管已经基于氨基酸序列比对将CTX-M种类分类于其中的亚组,所有CTX-M种类均涵盖于术语“CTX-M”中。
如本文所使用,术语“CTX-M-1-组群-阳性样品”是指含有携带属于CTX-M-1组群的CTX-M类型的基因的细菌的样品。对应的术语已经用于其他主要CTX-M组群,即CTX-M-2、-8、-9和-25组群。
在本发明的上下文中,比对了获得自NCBI公共序列数据库、公开可用的LaheyClinic数据库(至2012年10月11日为止)和公开于科学论文(Saladin等人 FEMSMicrobiol.Lett., 2002, 209:161−168; Pagani等人, J. Clin. Mirobiol., 2003, 41:4264−4269; Naas等人, Antimicrob. Agents Chemother., 2007, 51:223−230; Birkett等人, J. Med. Microbiol., 2007, 56:52−55; Oxacelay等人, J. Antimicrob.Chemother., 2009, 64:986−989; Monstein等人, BMC Infect. Dis., 2009,接受用于发表)的117种CTX-M序列和22种密切相关的非CTX-M序列(表1)。系统地分析比对且用于鉴定用于扩增引物和检测探针的目标位点,所述扩增引物和检测探针具有最高可能的CTX-M变体间同源性、但具有足够差异用于鉴别密切相关的非CTX-M序列,特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的染色体K1基因。
表1. 本比对中使用的CTX-M和非CTX-M序列。
本寡核苷酸与用星号标记的序列不完全互补。
在比对中,识别对于设计本引物和探针理想的区域。该目标区域包含短区域,所述短区域在不同的CTX-M-变体之间显示非常高同源性,但与比对中使用的密切相关的非CTX-M序列的相应区域明显不同。
所述比对用于针对超过90%的CTX-M变体设计完全互补的探针和引物。设计的探针和3'-引物与比对中使用的密切相关的非CTX-M序列相比含有至少2至6个核苷酸差异。将所有探针序列设计为互补的并因此检测反义链,因为扩增反义链的反向引物相比于扩增有义链的正向引物具有更多个针对非CTX-M序列的核苷酸错配。换言之,反义链比相应的有义链更特异性地被扩增。为了简化本发明用于确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在的方法,个别设计各寡核苷酸序列,使得对于鉴定尽可能多的CTX-M变体所需的序列的总数将尽可能低。因此,本序列与较早的CTX-M探针和引物的不同不仅在于其长度,而且在于对于宽范围CTX-M检测所需的显著较低数目的不同的引物和探针分子。
如本文所使用,术语“引物”是指包含至少20个核苷酸或由至少20个核苷酸组成的寡核苷酸分子,其被设计为与目标blaCTX-M基因的互补部分杂交且充当用于例如通过PCR扩增目标核酸分子的起始位点。
如本文所使用,术语“5'-引物”,即“正向引物”,是指与反义链杂交且扩增blaCTX-M基因的有义链的核苷酸的引物分子,而术语“3'-引物”,即“反向引物”,是指与有义链杂交且扩增blaCTX-M基因的反义链的核苷酸的引物分子。
在一个方面,本发明提供包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成的5'引物:
其中X1是C或T,且X2是A或G;或
其中 X1是C或T;
X2是A或G;且
当X1是C且X2是A或G时,X3是G;或
当X1是T且X2是G时,X3是G;或
当X1是T且X2是A时,X3是T;或
其中 当X2是A或G,且X3是T,且X4是G时,X1是C;
当X2是A,X3是C,且X4是G时,X1是C;
当X2是G,X3是T,且X4是G时,X1是T;或
当X2是A,X3是T,且X4是T时,X1是T。
这些引物可以替代方式呈现,即作为分别包含SEQ ID NO: 3至6、SEQ ID NO: 7至10或SEQ ID NO: 7至10和62中记载的核酸序列或由其组成的正向引物的混合物(表2)。根据产生CTX-M的细菌的检测和鉴定的期望覆盖范围,可以采用这些引物或引物混合物的任何组合或任一者。
表2. 设计的正向引物。SEQ ID NO: 3至6的引物涵盖于SEQ ID NO:1的正向引物混合物中,而SEQ ID NO: 7至10的引物涵盖于SEQ ID NO:2的正向引物混合物中,而SEQ IDNO:7至10和62的引物涵盖于SEQ ID NO:61的正向引物混合物中。
*通过OligoAnalyzer 3.1以以下值计算:c(Na+) = 100 mM,c(Mg2+) = 1.5 mM,c(dNTP) = 0.4 mM。剩余的解链温度用较早版本的程序计算。
在另一个方面,本发明提供包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成的3'-引物:
或
其中,
当X2是A或C,X3是G,X4是C,X5是A,且X6是C时,X1是A;
当X2是C,X3是G,X4是C,X5是G或A,且X6是G时,X1是G;或
当X2是C,X3是A,X4是T,X5是G,且X6是G时,X1是G。
再次,这些引物可以替代方式记载,即作为分别包含SEQ ID NO: 13至17或SEQ IDNO: 18至22或由其组成的反向引物的混合物。根据产生CTX-M的细菌的检测和鉴定的期望覆盖范围,可以采用上述引物的任何组合或任一者。
表3. 设计的反向引物。SEQ ID NO: 13至17的引物涵盖于SEQ ID NO:11的反向引物混合物中,而SEQ ID NO: 18至22的引物涵盖于SEQ ID NO:12的反向引物混合物中。
在一些实施方案中,上面公开的5'-和3'-引物或引物混合物可以任何期望的组合用于扩增CTX-M目标核酸。因此,如果需要,SEQ ID NO:1的5'-引物混合物可以与SEQ IDNO:12的3'-引物混合物;SEQ ID NO:2的5'-引物混合物和SEQ ID NO:11的3'-引物混合物;和SEQ ID NO:61的5'-引物混合物和SEQ ID NO:11的3'-引物混合物一起使用。然而,合适引物对的更优选的非限制性实例包括SEQ ID NO:1的5'-引物混合物和SEQ ID NO:11的3'-引物混合物;SEQ ID NO:2的5'-引物混合物和SEQ ID NO:12的3'-引物混合物;和SEQ IDNO:61的5'-引物混合物和SEQ ID NO:12的3'-引物混合物。
用SEQ ID NO:61的引物混合物替代SEQ ID NO:1或2的引物混合物延伸了待扩增的CTX-M类型的范围,以便还覆盖CTX-M-114,如果样品中存在的话。
应当意识到,在一些实施方案中,所述引物不必与目标链完全互补,但必须充分互补以与其杂交,且保留在正常引物杂交条件下扩增blaCTX-M基因的能力。
如本文所使用,术语“杂交”或“结合”是指在两个单链核酸分子的互补区域之间的物理相互作用,其生成双链结构。具体而言,术语“杂交”是指在允许两个分子的互补区域通过氢键键合相互作用且保持接合的杂交条件下的本寡核苷酸及其目标多核苷酸之间的相互作用。术语“杂交条件”独立地不仅指杂交步骤本身的条件,而且指其后进行的一个或多个洗涤步骤的条件。杂交条件的可改变的变量包括,但不限于,持续时间(通常若干秒至若干小时),温度(通常25℃至70℃),盐组成和浓度(例如,2-4xSSC6xSSC或SSPE),离液剂组成(例如,甲酰胺或二甲基亚砜(DMSO))和浓度,和降低非特异性结合的物质的使用(例如,牛血清白蛋白(BSA)或鲑鱼精DNA(ssDNA))。
术语“杂交严格”是指杂交中容忍错配的程度。条件越严格,错配的DNA链更可能被强制分开,而不那么严格的杂交条件增强错配链的稳定性。本领域技术人员能够选择杂交条件,使得实现期望水平的严格性。通常,可以通过增加温度、降低盐浓度和使用有机溶剂增加严格性。设计本引物以便在正常PCR引物杂交条件下与其目标序列杂交。本领域技术人员能够容易地确定和选择此类条件。
本发明的进一步方面涉及寡核苷酸探针。如本文所使用,术语“探针”是指设计用于检测待分析的样品中的目标核酸分子的寡核苷酸。根据选择的检测方法,本探针可以本领域中众所周知的不同形式来提供。例如,各探针可以被提供为单一探针分子或由两个个别探针分子组成的双探针,所述两个个别探针分子彼此接近地与在互补目标序列中的相邻位置(优选具有零至十个间插核苷酸)杂交。在一些实施方案中,所述双探针在互补目标序列中具有一个间插核苷酸。
如上所解释,本探针可以作为下文中表示为单探针的单一寡核苷酸分子提供。在此类情况下,所述探针与对应于衍生自CTX-M-15变体(基因文库号AY463958)的SEQ ID NO:23的核苷酸397-617(即,通过本引物可获得的扩增子)或优选核苷酸503-539的blaCTX-M基因的区域杂交。在一些实施方案中,单探针包含与SEQ ID NO:23的核苷酸397-617或503-539的所述区域中的连续核苷酸杂交的至少10个、优选10至30个核苷酸,或由其组成。本领域技术人员可以容易确定其他CTX-M变体中的对应基因区域。
在一些进一步实施方案中,本单探针包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:72的核酸序列或其至少10个、优选10至30个连续核苷酸,或由其组成。SEQ ID NO:24和72如下:
其中当X2是T,X3是G,X4是G,X5是A,X6是G,X7是C,X8是A或G,且X9是T时,X1是T;
当X2是T,X3是G,X4是C,X5是A,X6是A,X7是C,X8是A,且X9是C时,X1是T;
当X2是T,X3是G,X4是G,X5是A,X6是A,X7是C,X8是A,且X9是T时,X1是T;
当X2是T,X3是C,X4是G或T,X5是G,X6是A,X7是T,X8是A,且X9是C时,X1是C;
当X2是T,X3是G,X4是G,X5是G,X6是A,X7是T,X8是A,且X9是C时,X1是C;
当X2是T,X3是G,X4是C,X5是A,X6是A,X7是C,X8是A,且X9是C时,X1是C;
当X2是C,X3是C,X4是G,X5是A,X6是A,X7是C,X8是A,且X9是T时,X1是C;或
(SEQ ID NO:72),其中
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是G,X9是A,X10是A,X11是G,X12是C;X13是A或G,且X14是T时,X1是T;
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是C,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是T或C;
当X2是A ,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是G,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是T时,X1是T;
当X2是A,X3是C,X4是C,X5是A,X6是T,X7是G,X8是G,X9是A,X10,是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14 T时,X1是C;
当X2是A,X3是C,X4是A,X5是A,X6是C,X7是G,X8是T,X9是A,X10是A,X11是G,X12是C;X13是A,且X14 T时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是C,X5是A,X6是T,X7是G,X8是G或T时,X1是C,当X10是A,X11是A,X12是T;X13是A,且X14是C是,X9是G;
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是G,X9是G,X10是A,X11是A,X12是T;X13是A,且X14是C时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是C,X9是A,X10是G,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是C,X5是A,X6是T,X7是A,X8是T,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是C,X5是A,X6是C,X7是G,X8是T,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C;
当X2是G,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是G,X8是C,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是T,X6是T,X7是G,X8是C,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C;且
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,X7是A,X8是C,X9是A,X10是A,X11是A,X12是C;X13是A,且X14是C时,X1是C。
这些探针可以替代的不同方式记载,即作为分别包含SEQ ID NO: 25至33或SEQID NO: 25-30和73–79或由其组成的寡核苷酸探针的混合物(表4)。根据产生CTX-M的细菌的检测和鉴定的期望覆盖范围,可以采用本文记载的探针的任何组合或任一者。
表4. 设计的能够检测90%的现有CTX-M变体的单探针混合物。SEQ ID NO: 25至33的探针涵盖于SEQ ID NO:24的单探针混合物中,而SEQ ID NO: 25–33和73–79的探针涵盖于SEQ ID NO:72的单探针混合物中。
根据待采用的检测方法,本单探针可以二分以形成任何期望的双探针。此类双探针不必是连续的,即可以从探针省略二分位点周围任何适当数目的核苷酸。此外,考虑到待采用的检测方法的具体要求,本领域技术人员可以容易地选择合适的二分位点。本双探针的成员可以表示为反映它们在对应的blaCTX-M有义序列中的顺序的5'-探针和3'-探针。换言之,5'-探针的序列位于3'-探针的序列上游。
在一些实施方案中,根据本发明的5'-探针包含以下核酸序列或由其组成:
或
其中
当X2是T,且X3是G时,X1是T或C;
当X2是C或T,且X3是C时,X1是C;或
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T,且X7是G时,X1是T;
当X2是A,X3是C,X4是C,X5是A,X6是T,且X7是G时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是C或G,X5是A,X6是T,且X7是G或A时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是C,X5是A,X6是C,且X7是G时,X1是C;
X1是C,X2是G,X3是T,X4是G,X5是A,X6是T或X7是G;
当X2是A,X3是C,X4是A,X5是A,X6是C,且X7是G时,X1是C;
当X2是A,X3是T,X4是G,X5是T,X6是T,且X7是G时,X1是C。
这些探针可以替代的不同方式记载,即作为分别包含SEQ ID NO: 36至39、SEQ IDNO: 40至43或SEQ ID NO: 40–43和64–69或由其组成的寡核苷酸探针的混合物(表5)。根据产生CTX-M的细菌的检测和鉴定的期望覆盖范围,可以采用本文记载的探针的任何组合或任一者。与SEQ ID NO:34和35的探针混合物相比,SEQ ID NO:63的探针混合物将目标识别延伸至CTX-M-8、CTX-M-40、CTX-M-63、CTX-M-67、CTX-M-78、CTX-M-86、或CTX-M-121阳性的样品。因此,尽管前者探针提供约90%的CTX-M变体的检测,但后者探针将检测率延伸至超过90%的现有的CTX-M变体。
表5. 设计的5'-探针。SEQ ID NO: 36至39的探针涵盖于SEQ ID NO:34的5'-探针混合物中,而SEQ ID NO: 40至43的探针涵盖于SEQ ID NO:35的5'-探针混合物中,而SEQID NO:40–43和64–69的探针涵盖于SEQ ID NO:63的5'-探针混合物中。
*通过OligoAnalyzer 3.1以以下值计算:c(Na+) = 100 mM,c(Mg2+) = 1.5 mM,c(dNTP) = 0.4 mM。剩余的解链温度用较早版本的程序计算。
在一些实施方案中,根据本发明的3'-探针包含以下核酸序列或由其组成:
或
其中
当X2是G,X3是C;X4是A或G,且X5是T时,X1是A;或
当X2是A,X3是C;X4是A,且X5是C或T时,X1是A;且
当X2是A,X3是T;X4是A,且X5是C时,X1是G;
其中
当X2是A,X3是G,X4是C;X5是A或G,且X6是T时,X1是A;
当X2是A,X3是A,X4是C;X5是A,且X6是C或T时,X1是A;
当X2是A,X3是A,X4是T;X5是A,且X6是C时,X1是G;且
当X2是G,X3是A,X4是C;X5是A,且X6是C时,X1是A。
这些探针可以替代的不同方式记载,即作为分别包含SEQ ID NO: 46至50、SEQ IDNO: 51至55或SEQ ID NO: 51-55和71或由其组成的寡核苷酸探针的混合物(表6)。根据产生CTX-M的细菌的检测和鉴定的期望覆盖范围,可以采用本文记载的探针的任何组合或任一者。与SEQ ID NO:44和45的探针混合物相比,SEQ ID NO:70的探针混合物将目标识别延伸至CTX-M-110阳性的样品。
表6. 设计的3'-探针。SEQ ID NO: 46至50的探针涵盖于SEQ ID NO:44的5'-探针混合物中,而SEQ ID NO: 51至55的探针涵盖于SEQ ID NO:45的5'-探针混合物中;或其中SEQ ID NO:51-55和71的探针涵盖于SEQ ID NO:70的5'-探针混合物中。
*通过OligoAnalyzer 3.1以以下值计算:c(Na+) = 100 mM,c(Mg2+) = 1.5 mM,c(dNTP) = 0.4 mM。剩余的解链温度用较早版本的程序计算。
由SEQ ID NO:34、35、或63的5'-探针和SEQ ID NO:44、45、或70的3'-探针组成的双探针被设计为具有这样的解链温度(Tm):其允许仅在低于对于本引物理想的退火和延伸温度的温度中结合至它们的目标序列。Tm是50%的本寡核苷酸与完全匹配的目标序列杂交的温度(在限定离子强度、pH和DNA浓度下)。
本领域技术人员意识到,本引物和探针可以不同的方式修饰,只要它们保留它们对于CTX-M变体的特异性。例如,寡核苷酸类似物诸如肽核酸(PNA)或包含修饰碱基的寡核苷酸可以包含于本引物或探针中。此外,各种化合物或基团(例如,氨基)或其他分子诸如对于检测必需的标记可以结合至引物或探针,或者它们可以完全不修饰。自然,这些寡核苷酸序列的反平行序列是同样合适的,这对于本领域技术人员是显然的。
应当理解的是,本引物和探针也涵盖与本引物和探针具有至少80%同一性、优选至少85%、更优选至少90%同一性的那些。更优选地,所述序列与本文公开的寡核苷酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性,最优选100%同一性。具体而言,在引物的5'-末端可以存在差异。
如本文所使用,两个氨基酸或两个核酸序列之间的百分比同一性等同于两个序列之间的百分比同源性。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数目的函数(即,%同一性=相同位置的数目/预期与blaCTX-M杂交的多核苷酸的连续位置的总数目x100)。可以使用本领域中已知的标准方法来完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定。
还应当意识到,与本文公开的引物和探针序列相比,本引物和探针序列可以缺乏一个或多个核苷酸,具有一个或多个额外核苷酸,或具有核苷酸序列的一个或多个改变,只要它们保留它们的功能特征。
本引物和探针可以使用本领域已知适合于该目的的任何方法来产生。
如本文所使用,术语“生物样品”是指生物、优选人来源的任何样品,包括但不限于,来自不同身体部位的粘膜的拭子和刷样品,脓液样品,和待检测的实现局部感染的不同体液的样品。此类体液的非限制性实例包括滑液、腹膜液、脑脊液(CSF)、尿液和血液。所述生物样品也可以是表面样品,诸如例如医院环境中所取的擦拭样品。还考虑食物样品和土壤样品。
在本发明的一些实施方案中,DNA必须在任何扩增反应前从待研究的生物样品中提取。可以通过使用众所周知的DNA提取方法或市售的试剂盒诸如NucleoSpin®组织试剂盒(Macherey-Nagel)或氯仿-苯酚提取从生物样品提取DNA。也可以不经单独分离而从待分析的样品直接获得DNA。
可以在本诊断方法中采用包括扩增阶段和检测阶段的任何适当技术。根据所讨论的技术,扩增和检测阶段可以同时或相继进行。
在根据本发明的方法的一些实施方案中,利用国际专利公开WO2010/109065中公开的螯合物互补技术进行产生CTX-M的细菌的检测。为此目的,本探针被提供为双探针,其彼此接近地与互补目标序列中的相邻位置(优选具有零至十个间插核苷酸)杂交。双探针的一个成员用镧系元素离子载体螯合物诸如Eu(III)、Sm(III)、Tb(III) 和Dy(III)的环状或非环状的氨基多羧酸螯合物标记,而其他成员用捕光天线配体诸如单配位基、二齿、三齿或四齿配体标记。在识别目标序列和与目标序列杂交后,使镧系元素离子载体螯合物和天线配体紧密接近,实现螯合物互补,即,形成高荧光混合的镧系元素复合物,其因此增加镧系元素发光的强度。当形成复合物时,在同时,或在时间分辨的荧光测定术中,在激发之后的短暂延迟之后,可以在一个波长激发荧光,且在另一个波长测量发射。
螯合物互补技术可以用于等温和热循环核酸扩增反应,诸如实时定量PCR或均相终点PCR(homogeneous end-point PCR)中。本领域技术人员可以容易选择具有足够高的热力学和动力学稳定性的离子载体螯合物以便适合于PCR中使用。
用于测定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的优选检测方法是基于螯合物互补的实时PCR,其原理示于图1中。优选地,与铕(Eu)离子载体螯合物、优选7d-DOTA-EuIII缀合的寡核苷酸探针包含SEQ ID NO:34、35或63中记载的核酸序列或由其组成,而与捕光天线配体、优选4-((4-异硫氰酸根合苯基)乙炔基)-吡啶-2,6-二甲酸缀合的探针包含SEQ ID NO: 44、45或70中记载的核酸序列或由其组成,或反之亦然。
适合于应用于本发明用于确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在的方法中的其他技术包括均质的基于荧光的核酸杂交测定法,其通常基于猝灭探针,即,TaqMan®探针或两个能量-转移探针。如本领域中众所周知,猝灭探针,即含有荧光部分和猝灭剂部分两者的单链自猝灭寡核苷酸探针可以用于实时定量PCR中,其中所述荧光部分在核酸扩增过程中的杂交后通过核酸聚合酶的核酸酶作用而切割,导致产生可检测的荧光信号。用作猝灭探针的优选探针是本文设计的单探针,诸如包含SEQ ID NO:24或72中记载的核酸序列或其至少10个、优选10至30个连续核苷酸或由其组成的那些。在一些实施方案中,所述探针包含SEQ ID NO: 34、35、44、45、63或70中记载的核酸序列或由其组成。
在两个能量-转移探针的情况下,其他探针分子用能量供体标记,而其他探针分子用能量受体标记。通常,供体的发射谱应当与受体的激发谱重合。本领域技术人员可以容易地选择适合于在实时定量PCR或任何其他适用的DNA扩增方法中使用的适当的供体-受体-对。识别互补目标序列后,供体-和受体-标记的探针彼此接近地与相邻位置杂交,生成由从供体至受体的荧光能量转移(FRET)导致的可检测的荧光信号。当利用该检测技术时,根据本发明的双探针是优选的。包含SEQ ID NO:34、35或63或由其组成的探针可以用受体诸如TAMRA™或Cy5™标记,而包含SEQ ID NO:44、45或70或由其组成的探针可以用供体诸如FAM™、TET™或Cy3™标记,或反之亦然。
基于FRET且适合用于本发明用于确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法的另一种检测方法依赖于分子信标,其是形成茎-和-环结构的单链寡核苷酸杂交探针。该环含有根据任何本实施方案的核酸探针序列,而该茎通过位于探针序列任一侧的互补臂序列的退火而形成。一个臂用荧光团标记,而另一个臂用猝灭剂标记。在目标序列不存在的情况下,该茎以闭合构象保持探针,引起荧光被猝灭。相反,在目标序列存在的情况下,环序列将与其杂交,因此将探针线性化且引起荧光团和猝灭剂远离彼此,导致荧光信号的恢复。
在根据本发明的方法的一些进一步实施方案中,可以通过采用具有竞争性杂交的均相检测来实现产生CTX-M的细菌的检测。此类方法及其不同的变体是本领域中容易获得的。在此类实施方案中,本探针被提供为双链探针,其中第一链包含SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:72、或其至少10个或10至30个连续核苷酸、或SEQ ID NO:34、35、44、45、63或70或由其组成,且第二链与第一链互补。在一些实施方案中,所述探针可以额外地或替代地,是各自具有第一链的至少三种不同的寡核苷酸分子的混合物,所述第一链彼此独立地包含SEQ IDNO:24或72中包含的核酸序列或其至少10个或10至30个连续核苷酸,或由其组成。所述第一和第二探针链可以是相同或不同的长度。通常,所述第一链用荧光团标记,且所述第二链用猝灭剂标记。在目标核酸分子不存在的情况下,所述探针链与彼此杂交,且形成其荧光被猝灭的双链探针分子。另一方面,在目标核酸分子存在的情况下,所述第一探针链与目标杂交,因此,逃离猝灭剂探针的猝灭作用且导致可检测的信号。荧光信号的水平与待分析的生物样品中的目标核酸的量成正比。该技术可以用实时定量PCR或终点PCR组合。优选地,采用包含集成热循环仪、信号检测单元诸如时间分辨的荧光测量单元和用于分析结果的软件的闭管平台。此类平台是本领域中可用的,且它们可含有干燥形式的所有必需的试剂。
适用于用于本诊断方法中的又另一种技术是连接介导的PCR(LM-PCR),其中两个探针分子彼此接近地与互补目标链中的相邻位置杂交,导致产生具有单链切口的双链分子。在探针分子和目标序列之间的完全匹配的情况下,该切口通过DNA连接酶连接,由此连接探针分子。在错配的情况下,连接反应没有发生,因此,探针分子将不会连接。
在本发明用于检测产生CTX-M的细菌的方法的一些实施方案中,可以采用DNA微阵列技术。在该情况下,DNA微阵列或DNA芯片是指小基板(substrate),在所述小基板上已经附接本探针、优选包含选自SEQ ID NO: 24至55和63至79的核酸序列或由其组成的那些中的一种或多种。所述探针可以附接至与适合用于该目的的任何可商购的点样仪(arrayer)共价或非共价结合的微阵列载体(诸如硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃或硅)的表面上,或者它们可以被手动移液至表面上。或者,所述探针可以通过适当的原位合成方法诸如光刻法或喷墨技术直接合成至表面上。
对于微阵列应用,可以使用任何适当的标记方法,以产生标记的目标链或标记的探针分子。合适标记的非限制性实例包括荧光标记(例如,Cy5™、Cy3™、Cy2™、TexasRed™、FITC、Alexa Fluor® 488、TMR、FluorX™、ROX™、TET™或HEX™)、放射性标记(例如,32P、33P或33S)、化学发光标记(例如,HiLight单色试剂盒)和比色标记(例如,酶标记)。
微阵列可以通过适用于该目的的任何设备或阅读器进行分析。如果荧光标记目标链,则还可以例如通过荧光显微镜进行分析。如果已经使用放射性标记,则可以通过放射自显影分析阵列或膜。
一般而言,基于杂交的检测方法可以被分为两类,即,在溶液中进行的那些和在固体支持物上进行的那些。在上述合适的示例性检测方法中,只有基于微阵列的技术属于后者类别,其中检测探针附接至结合DNA的固体支持物上。合适的固体表面的非限制性实例包括基于硝酸纤维素或尼龙膜和玻璃或硅的表面。
重要的是,本探针基本上不自杂交或形成其他不需要的二级结构,所述二级结构会阻止或削弱它们在用于检测目的的溶液中杂交技术中使用的适用性。
在一个方面,本发明提供用于任何本发明用于检测生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在的方法中使用的试剂盒。此试剂盒可以包含本探针中的一种或多种,所述探针包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列、其至少10个或10至30个连续核苷酸、SEQ ID NO: 34、35、44、45、63或70,或由其组成。额外地或替代地,所述探针可以是至少三种不同的寡核苷酸分子的混合物,所述寡核苷酸分子各自彼此独立地包含SEQ ID NO:24或72中包含的核酸序列或其至少10个或10至30个连续核苷酸,或由其组成。所述试剂盒中可以包括或不包括本引物或其任何组合。所述试剂盒还可以适合用于利用集成扩增和检测的任何已知平台。
对于本领域技术人员将显而易见的是,随着技术进步,创造性的概念可以各种方式实施。本发明及其实施方案不限于上述实例,但可以在权利要求的范围内变化。
实施例
实施例1. 引物表征
样品制备
获得自芬兰国立健康和福利研究所的九个不同的患者样品可用于这些测试。所述样品中的六个含有携带blaCTX-M的大肠杆菌,而所述样品中的三个含有携带K1的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。基于测序分析,在六个大肠杆菌样品中,两个是CTX-M-1-组群-阳性的,两个是CTX-M-2-组群-阳性的,且两个是CTX-M-9-组群-阳性的。
使用NucleoSpin®组织试剂盒根据制造商的说明提取灭活的细菌细胞的DNA,除了预裂解步骤和洗涤和洗脱体积。通过将155 μl缓冲液T1和25 μl蛋白酶K添加至45 µl细菌悬浮液且在56℃孵育三小时而进行预裂解。缓冲液B5和BE分别以550 µl和80 µl的体积使用。用Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA测定试剂盒且通过在480 nm激发样品且在520 nm收集荧光发射1.0秒而测定DNA浓度。如用已知DNA量生成的标准曲线所测定,DNA产量在5 µg和28 µg之间变化。
扩增反应
引物混合物(SEQ ID NO:1、2、11、和12)购自Thermo Fisher Scientific,且使用基于SYBR® Green I的实时PCR在所有可能组合的不同浓度测试功能性。在测试中,从CTX-M-9-组群-阳性的大肠杆菌样品分离的DNA以0、1000、或10000个基因组拷贝/反应用作模板。从blaCTX-M-缺陷的大肠杆菌菌株(ATCC 25922)分离的DNA以10000个基因组拷贝/PCR反应用作阴性对照。
用于测试SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:12的引物混合物的组合的替代模板包括从产酸克雷伯氏菌样品(10000个基因组拷贝/反应)和CTX-M-1-阳性的大肠杆菌样品(0、1000或10000个基因组拷贝/反应)分离的DNA。
除了模板DNA以外,各反应混合物在20 µl的总体积的GenomEra PCR缓冲液(Abacus Diagnostica)中含有0.4 mM dNTP (Bio-Rad)、0.4 µl Phire® Hotstart IIDNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、2 mg/ml BSA和SYBR® Green I (Life Technologies)。
使用C1000 Touch™热循环仪组合CFX96 Touch™实时PCR检测系统(Bio-Rad)一式三份进行各扩增反应。循环由以下组成:在98℃初始变性2.5 min,随后首先9个循环的62℃持续15秒、73℃持续10秒和98℃持续10秒,然后18个循环的25℃持续30秒、73℃持续10秒、98℃持续10秒、62℃持续15秒、73℃持续10秒和98℃持续10秒。在循环10开始的每第二循环中的延伸步骤结束时测量荧光。
结果
根据结果,正向和反应引物混合物的所有组合在扩增CTX-M-阳性的DNA样品中不论模板浓度都表现良好,但如预期,未能特异性扩增CTX-M-阴性的对照样品以及产酸克雷伯氏菌样品。
图2显示使用不同的引物混合物组合在正向和反向引物两者混合物的0.5 µM的总引物浓度(个别引物寡核苷酸的浓度在0.10 µM和0.13 µM之间变化)获得的结果。对于图2,模板DNA以10000个基因组拷贝/反应的量使用。用测试的其他模板DNA量获得的结果与图2中显示的结果完全一致,且平行反应的表现的差异接近于不存在。
PCR之后,进行解链曲线分析以表征扩增产物及其解链温度。根据该分析,含有CTX-M-阳性的模板DNA的所有反应都产生单一熔点峰,其与正确扩增子的理论解链温度良好对应。这些结果证实,正向和反向引物混合物以任何组合都良好工作,并且它们特异性扩增目标序列。
由于blaCTX-M和K1基因之间的非常高的同源性,本引物混合物在含有产酸克雷伯氏菌DNA作为模板的PCR中也产生特异性扩增产物。该结果显示于图3,其中引物混合物SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:12以0.5 µM的个别引物浓度使用)。因此,需要进一步程序用于区分K1扩增产物和blaCTX-M扩增产物。
实施例2. 螯合物互补测定的探针制备和表征
3'-氨基C6-修饰的Eu-探针(SEQ ID NO:34和35)以及5'-氨基C6修饰的和3'-磷酸酯-修饰的天线探针两者(SEQ ID NO:44和45)购自Biomers.net。
基本上如例如Karhunen等人于Acta Chimica Acta 772 (2013) 87-92中较早所述,经由氨基C6接头用7d-DOTA–EuIII (2,2',2''-(10-(3-异硫氰酸根合苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三(乙酸酯)-铕(III))在3'-末端标记Eu-探针。简而言之,各标记反应在50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.8)中含有2.2 µg/µl寡核苷酸探针和20倍摩尔过量的DOTA–EuIII。将反应物在+37℃的温度在缓慢摇动下孵育过夜。离子载体螯合物标记的探针用NAP™-5凝胶过滤柱(GE Healthcare)根据制造商的说明使用含有10 mM Tris (pH7.5)、50 mM NaCl和10 µM EDTA的洗脱缓冲液进行预纯化。其后,用反相HPLC用150 mm ×4.6 mm Aeris™ PEPTIDE柱(Phenomenex)使用以下梯度以2.00 ml/min的流速纯化洗脱物:95%溶液A (50 mM乙酸三乙基铵; TEAA; Sigma-Aldrich)和5%溶液B (95%乙腈/50 mMTEAA)在1分钟内至86% A和14% B,且7分钟内至70% A和30% B,且最终在一分钟内至100%B。用100% B洗涤1分钟之后,B的百分比在1分钟内降低至5%,且将柱用95% A平衡8分钟。收集的级分在miVac Duo (GeneVac Ltd.)中干燥。
基本上如例如Karhunen等人(同上)较早所述,经由氨基C6接头用光吸收天线配体(4-((异硫氰酸根合苯基)乙炔基)-吡啶-2,6-二甲酸)的异硫氰酸酯活化形式在5'-末端标记天线-探针。简而言之,各标记反应含有1.4 µg/µl寡核苷酸探针和使用Hielscer超声波匀浆仪溶解于N,N-二甲基甲酰胺中的100倍摩尔过量的天线配体。在50 mM碳酸盐缓冲液(pH 9.8)中实施标记反应。将反应物在+50℃的温度在缓慢摇动下孵育过夜,且与7d-DOTA-EuIII标记反应类似地预纯化。其后,用反相HPLC用150 mm × 4.6 mm Hypersil® ODSC18柱(Thermo Fisher Scientific)使用以下梯度以0.5 ml/min的流速纯化洗脱物:95%溶液A (50 mM乙酸三乙基铵; TEAA; Sigma-Aldrich)和5%溶液B (95%乙腈/50 mM TEAA)在1分钟内至86% A和14% B,且25分钟内至70% A和30% B,且最终在2分钟内至100% B。用100%B洗涤5分钟之后,B的百分比在3分钟内降低至5%,且将柱用95% A平衡22分钟。收集的级分在miVac Duo (GeneVac Ltd.)中干燥,且储存在-20℃。
将HPLC级分溶解于10 mM Tris (pH 7.5)、50 mM NaCl、10 µM EDTA中,且通过用NanoDrop® ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)使用UV-Vis软件测量260和330nm的吸光度而测定其寡核苷酸含量。
通过杂交实验验证标记反应的成功和探针与互补目标寡核苷酸形成荧光复合物的能力。为此,设计人工目标寡核苷酸,使得目标序列的总数为可能最低,而各铕探针将在结合至目标寡核苷酸后与至少一种天线探针形成荧光复合物,反之亦然。设计的目标寡核苷酸A至E,涵盖针对本文设计的各探针序列的互补位点,显示于表7中。
表7. 设计用于验证本探针的功能的合成目标寡核苷酸。可变位点已经通过加下划线突出显示。
杂交反应在60 µl的总体积中在50 mM Tris-HCl (pH 7.7)、600 mM NaCl、0.1%(体积/体积) Tween 20、0.05% (w/v) NaN3、30 µM DTPA中含有0或10 nM合成目标寡核苷酸(Integrated DNA Technologies)和25 nM对应的Eu-和天线-标记的探针。通过将反应物在室温孵育10分钟、在+50℃再孵育20分钟且最终在室温孵育15分钟而在黄色MaxiSorp™板(Nunc)中进行实验。在缓慢搅拌下进行第一和第三孵育。其后,使用Victor™ 1420板阅读器(PerkinElmer Wallac)测量EuIII发光。
与不含任何目标寡核苷酸的反应中相比,在含有完全互补的目标寡核苷酸的反应中,测试的所有Eu-和天线-探针组合都提供高180-至1700-倍的Eu-信号。换言之,标记反应是成功的,且各探针组合提供与背景信号可容易区别的特异性信号。
实施例3. 基于螯合物互补的PCR
本引物和探针以不同浓度和不同组合使用。SEQ ID NO:34的Eu-探针混合物与SEQ IDNO:44的天线-探针混合物一起使用,且SEQ ID NO:35的Eu-探针混合物与SEQ ID NO:45的天线-探针混合物一起使用。替代模板包括从两个独立的CTX-M-1-组群-阳性的、CTX-M-2-组群-阳性的和CTX-M-9-组群-阳性的大肠杆菌样品、三个独立的产酸克雷伯氏菌样品和一个CTX-M-阴性的大肠杆菌样品分离的DNA。模板浓度在0和10000个基因组拷贝/扩增反应之间变化。
如上所述且进行一些改良建立扩增反应。反应混合物含有30 µM DTPA,但不含SYBR® Green I。进一步,由于更大的反应体积(40 µl,而不是20 µl),使用0.8 µl Phire® Hotstart II DNA聚合酶。在这些实验中,正向和反向引物两者混合物(分别为SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:11)以0.5 µM的总引物浓度使用。利用C1000 Touch™热循环仪一式三份实施各PCR反应。循环由以下组成:在98℃初始变性2.5 min,随后首先10个循环的62℃持续15秒、73℃持续10秒和98℃持续10秒,然后18个循环的25℃持续35秒、73℃持续10秒、98℃持续10秒、62℃持续15秒、73℃持续10秒和98℃持续10秒。在循环10开始的在25℃的每第二循环中测量荧光。使用340 nm的激发波长、615 nm的测量波长、250 µs的延迟时间和750 µs的测量时间用Victor™ X4多标记板阅读器(PerkinElmer)进行测量。
测试的所有探针混合物组合都表现良好,但SEQ ID NO:35的Eu-探针混合物和SEQID NO:4的天线-探针混合物的组合提供最高的信号背景比。用该探针混合物组合以0.05 µM的个别探针浓度使用10000个基因组拷贝/反应的模板量获得的结果呈现于图4中。三个独立的产酸克雷伯氏菌样品或CTX-M-阴性的大肠杆菌样品无一提供高于背景信号的信号,而所有CTX-M-阳性样品都提供与背景信号可容易区别的信号。
用CTX-M-阳性样品(0、0.01、0.1、1、10、100、1000、或10000个基因组拷贝/反应)的十倍稀释系列连同SEQ ID NO:35的Eu-探针混合物和SEQ ID NO:45的天线-探针混合物(以0.05 µM的个别探针浓度)进行的分析灵敏度测试的结果显示于图5中。三个平行反应各自提供信号,当10或更多个基因组拷贝/反应被用作模板时,所述信号超过阈值信号水平(信号背景比1.5)。对于CTX-M-9-组群模板,每一个基因组拷贝/反应足以在所有三个平行样品中提供可检测的信号,并且0.01个基因组拷贝/反应在平行样品之一中提供信号。对于CTX-M-1-组群和CTX-M-2-组群-阳性样品,一个基因组拷贝/反应在三个平行样品中的两个中提供信号。因此,本基于螯合物互补的诊断方法的分析灵敏度是10个基因组拷贝。重要地,该值显示,对于blaCTX-M,本方法的灵敏度比已知的VAPChip阵列高达10倍(Bogaerts等人.2011, Antimicrob. Agents Chemother. 55 :4457−4460)。
实施例4. 具有延伸的CTX-M变体目标变异性的基于螯合物互补的PCR
SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物与SEQ ID NO:70的天线-探针混合物一起使用。对于分析特异性研究,替代模板包括从以下分离的DNA:21种不同的细菌物种(E. hormaechi、变形链球菌(S. mutans)、弗氏柠檬酸杆菌(C. freundii)、肠炎沙门氏杆菌(S. enteriditis)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、摩氏摩根氏菌(M. morganii)、奇异变形菌(P. mirabilis)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、缓症链球菌(S. mitis)、化脓性链球菌(S. pyögenes)、粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E. facium)、产气荚膜梭菌(C. perfringens)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、P. vulgaris、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、大肠杆菌(E. coli)、肺炎克雷伯(K. pneumoniae))的十二个独立的CTX-M-1-组群-阳性的、两个独立的CTX-M-2-组群-阳性的、一个CTX-M-8-组群-阳性的、和十二个独立的CTX-M-9-组群-阳性的大肠杆菌样品、两个独立的CTX-M-1-组群-阳性的阴沟肠杆菌(E. cloacae)样品、一个CTX-M-25-组群-阳性的肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)样品、四个独立的产酸克雷伯氏菌样品和一个CTX-M-阴性样品。CTX-M-阴性样品的模板浓度为100 000个基因组拷贝/反应,且CTX-M-阳性样品的模板浓度为100个基因组拷贝/反应。对于用分离的DNA的分析灵敏度研究,替代模板包括从CTX-M-1-组群、CTX-M-2-组群、CTX-M-8-组群、CTX-M-9-组群或CTX-M-25-组群阳性的一个样品分离的DNA,其中模板浓度为0、0.1、1、10、100、1000、10000、100000个基因组拷贝/反应。
如上面实施例3中所述进行扩增反应。所有反应都含有内部扩增对照以验证阴性反应中的成功扩增。
分析特异性研究的结果显示于图6中。CTX-M-阴性样品或产酸克雷伯氏菌样品无一提供高于背景信号的信号,而所有CTX-M-阳性样品都提供与背景信号可容易区别的信号。
关于CTX-M-2-组群-阳性样品的分析灵敏度测试的结果显示于图7中。在用1个或多个基因组拷贝/反应的所有情况下都看到清楚的信号增加。用CTX-M-1-组群、CTX-M-8-组群、CTX-M-9-组群或CTX-M-25-组群-阳性样品获得了类似的结果。
实施例5. 用细菌细胞的基于螯合物互补的PCR
SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物与SEQ ID NO:70的天线-探针混合物一起使用。替代模板包括来自一个CTX-M-1-组群-阳性的、一个CTX-M-2-组群-阳性的、一个CTX-M-9-组群-阳性的和一个CTX-M-8-组群-阳性的大肠杆菌样品和一个CTX-M-25-组群-阳性的肺炎克雷伯氏菌样品的细菌细胞。
在热混合器中的5 ml SB培养基中在37℃培养细菌细胞,直到可见混浊但没有过度生长。离心(2719xg, 2 min)之后,将细胞沉淀物轻轻悬浮于2ml无菌PBS缓冲液中。通过引入0.05% NaN3而停止1 ml所得悬浮液中的细菌生长,且剩余的无NaN3的细菌悬浮液立即用于制备SB培养基中的十倍稀释系列。将一百ul SB稀释液铺板于LA板上且在37℃培养。在NaN3处理的细菌悬浮液中,将十倍稀释系列制备于无菌水中且冷藏保存,直到通过PCR分析。将水稀释系列的样品未经DNA分离即直接添加至PCR反应中。如上面实施例3中所述进行扩增反应。所有反应都含有内部扩增对照以验证阴性反应中的成功扩增。在过夜培养之后计数LA板上的菌落以证实PCR反应中分析的样品中的细菌计数。
作为实例,CTX-M-2-组群-阳性细胞的细菌细胞PCR的代表性结果显示于图8中。在具有三个或更多个细菌的菌落形成单位的所有样品中都检测到CTX-M。
支持致谢
导致本发明的工作已经根据基金协议号259848接受来自欧盟第七构架计划(FP7/2007-2013)的资助。
Claims (15)
1.确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法,其中所述方法包括以下步骤:
a) 提供怀疑含有产生CTX-M的细菌的生物样品;
b) 如果有的话,扩增所述样品中的编码CTX-M的DNA;和
c) 使用至少一种探针检测扩增的DNA,所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交,所述区域对应于CTX-M-15中的SEQ ID NO:23的核苷酸397-617的区域,且所述探针包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸,
其中步骤b)和c)可以单独或同时进行。
2.根据权利要求1的方法,其中所述区域对应于CTX-M-15中的SEQ ID NO:23的核苷酸503-539的区域。
3.根据权利要求1或2的方法,其中所述探针是至少三种探针的混合物,所述探针各自包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的不同的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
4.根据权利要求3的方法,其中所述探针混合物包含九种或十六种探针,所述探针各自分别包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的不同的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法,其中所述探针已经被二分为5'-探针和3'-探针。
6.根据权利要求5的方法,其中所述5'-探针包含SEQ ID NO:34、35或63中记载的核酸序列,且所述3'-探针包含SEQ ID NO:44、45或70中记载的核酸序列。
7.根据任一前述权利要求的方法,其中所述扩增用包含SEQ ID NO:1、2或61中记载的核酸序列的正向引物和包含SEQ ID NO:11或12中记载的核酸序列的反向引物进行。
8.根据任一前述权利要求的方法,其中所述检测在溶液中进行。
9.根据权利要求8的方法,其中所述检测基于选自以下的技术:螯合物互补、基于荧光的核酸杂交测定法和连接介导的PCR。
10.根据权利要求1至7中任一项的方法,其中所述检测在固体支持物上进行。
11.根据权利要求10的方法,其中所述检测基于DNA微阵列技术。
12.寡核苷酸探针,其包含与SEQ ID NO:34、35、44、45、63或70中记载的序列,或与SEQID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸具有至少80%序列同一性的核酸序列。
13.根据权利要求12的寡核苷酸探针,其中所述探针包含至少三种不同的寡核苷酸分子,所述寡核苷酸分子各自彼此独立地包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中包含的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
14.根据权利要求13的寡核苷酸探针,其中所述探针是包含九种或十六种探针的探针混合物,所述探针各自分别包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的不同的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
15.寡核苷酸引物,其包含与SEQ ID NO:1、2、11、12或61中记载的序列具有至少80%序列同一性的核酸序列。
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