CN104212899A - 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物 - Google Patents

用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104212899A
CN104212899A CN201410452505.1A CN201410452505A CN104212899A CN 104212899 A CN104212899 A CN 104212899A CN 201410452505 A CN201410452505 A CN 201410452505A CN 104212899 A CN104212899 A CN 104212899A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
ctx
gene
bla
detect
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410452505.1A
Other languages
English (en)
Inventor
郑秋月
刘冉
肖珊珊
曹际娟
战晓微
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410452505.1A priority Critical patent/CN104212899A/zh
Publication of CN104212899A publication Critical patent/CN104212899A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物，包括引物对SEQ ID NO.1/2、SEQ ID NO.3/4、SEQ ID NO.5/6和SEQ ID NO.7/8。在此基础上进一步建立mPCR-DHPLC/电泳检测试剂盒及方法，以检测食品中的产CTX-M-1/CTX-M-9/OXA型ESBLs大肠杆菌及耐氨基糖苷类抗生素大肠杆菌。所建立的方法在一次检测中即可同时高特异性、高灵敏度地完成对样品中的大肠杆菌blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaOXA、aadA四种耐药基因的检测，方法耗时短，操作简捷，并具有快速高通量等优点，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求，满足了食品中微生物检测迅速准确的需求。

Description

用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及食品及生物产品中耐药性大肠杆菌所携带的耐药基因的检测。
技术背景
大肠杆菌是常见的可引起人畜共患病的致病菌，食品动物来源的菌株具有耐药性可能对人类存在巨大的潜在危害，检测食品源、动物源等的大肠杆菌耐药性的研究尤为重要。由于细菌耐药性的研究主要为临床医学领域，而对于动物源性及食源性细菌的耐药性研究起步较晚，且往往由于细菌同时食物链传播给人类，人们对食物链的中间环节多着眼于细菌致病性的检测，而忽略了细菌耐药性。
产β-内酰胺酶是大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，目前，超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)种类已超过200多种，其类型可以分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型等。(1)CTX-M型ESBLs，属于Ambler分类法中的A类酶，呈碱性，是一类非TEM非SHV型ESBLs，1990年由Bauernfeind等在大肠埃希菌中首次发现并命名为CTX-M-1，该类酶对头孢噻肟的水解能力明显强于头孢他啶，因而被命名为头孢噻肟酶(cefotaximase)。CTX-M型ESBL大肠杆菌是我国国内主要流行的基因型，动物源性食品中分离大肠杆菌以CTX-M-9基因型为主。(2)目前发现的OXA型β-内酰胺酶有88种，其中有11种属于ESBLs。OXA型ESBLs包括OXA-2、OXA-10、OXA-1三个基因型。有报道鸡源性大肠杆菌中OXA型-内酰胺酶的检出率达40％，说明该型酶在动物源性大肠杆菌的检出率也较高。(3)氨基糖苷类药物曾是治疗临床细菌性感染的有效药物，与β-内酰胺类药物联合应用是治疗革兰阴性菌感染性疾病的“杀手锏”。随着抗菌药的广泛应用，革兰阴性菌在对β-内酰胺类药物耐药性上升的同时，对氨基糖苷类药物的耐药性亦不断上升。在动物源性大肠杆菌中，对氨基糖苷类药物耐药的基因有多种，常见的有aadA1，aaC2，aaC4，aphA3，aadB，aac(3)-Ⅰa等，其中aadA1基因的检出率最高(59.1％)。
目前，国内对动物源性细菌耐药性的方法主要依据临床和实验室标准化委员会(Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI)制订的《动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法》SN/T1944-2007进行体外细菌培养药敏性试验，而缺少快速检测食品中大肠杆菌耐药菌株的检测方法。体外细菌培养药敏性试验操作繁琐，不适于大量样品的检测，且只能检测菌株的耐药表型，而对于耐药基因尚未表达的耐药菌株易造成漏检。而且完成药敏鉴定的全自动生化鉴定仪价格昂贵，鉴定结果受操作人员的影响较大，也易造成假性耐药或假性敏感现象；此外该体外药敏试验的结果无法评估细菌耐药性对人体的危害。因此急需建立更加准确高效的检测方法，可以快速实现大肠杆菌耐药菌株的鉴别分型，并可有效避免被测菌株因体外药敏试验而产生的假性耐药或假性敏感现象。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物，包括引物对SEQ ID NO.1/2、SEQ ID NO.3/4、SEQ ID NO.5/6和SEQ ID NO.7/8。
关于这些引物对的描述如下表：
所述组合物被应用于PCR反应，针对性扩增待测样品中可能含有的目的基因片段，这些目的基因片段包括：产CTX-M-9型ESBLs耐药大肠杆菌的blaCTX-M-9基因、产CTX-M-1型ESBLs耐药大肠杆菌的blaCTX-M-1基因、产OXA型ESBLs耐药大肠杆菌的blaOXA基因以及耐氨基糖苷类大肠杆菌的aadA基因。
本发明的目的之二在于提供一种用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的试剂盒，包括上述本发明的用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物。
显然，所述试剂盒可应用于PCR扩增，所述试剂盒中，除了包括上述特异性引物组合物，还可以包括用于PCR反应的其它组分，所述组分包括但不限于Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCR缓冲液以及水。
所述试剂盒试剂盒保存条件：-20℃保存。
本发明再一方面的目的在于提供一种检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法，包括PCR反应的步骤，所述PCR反应使用上文所述本发明的用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物为mPCR扩增引物。
具体的实施方案中，本发明的检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法中，所述的PCR反应体系总体积25μL，包括：待测样品DNA溶液1μl，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，PCR反应液12μL和余量的水；
所述PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP各2.5mM及0.1μM的引物对SEQ ID NO.1/2(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2各0.1μM)、0.1μM的引物对SEQ ID NO.3/4(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4各0.1μM)、0.2μM的引物对SEQ ID NO.5/6(SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6各0.2μM)和0.2μM的引物对SEQ ID NO.7/8(EQ ID NO.7，SEQ ID NO.8各0.2μM)。
具体的实施方案中，本发明的检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法中，所述的PCR反应参数为：
预变性：94℃，1min；
进入循环：94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸90s，30个循环；
终止延伸：72℃，10min。
对mPCR的产物，可以采用DHPLC或电泳的方法进行进一步的结果分析：
具体实施方案之一，对PCR反应产物进行DHPLC分析的步骤，分析条件如下：
色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
按照体积比，流动相为：
0min：55.0％A，45.0％B；
0.5min：50.2％A，49.8％B；
6.1min：38.8％A，61.2％B；
11.8min：35.5％A，64.5％B；
17.4min：33.9％A，66.1％B；
23.0min：32.9％A，67.1％B。
A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽15nm；发射谱带宽15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物10μL。
对所述DHPLC检测结果，按照如下标准进行判断：
检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌耐药基因；
检测样品blaCTX-M-1基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产CTX-M-1型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaCTX-M-9基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产CTX-M-9型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaOXA基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产OXA型ESBLs耐药菌株；
检测样品aadA基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为氨基糖苷类耐药菌株；
检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议样品重新增菌培养后检测；重做结果峰吸收值仍小于3mV则为阴性，否则为可疑阳性。
对所述mPCR扩增结果的分析，具体实施方案之二，是电泳分析的步骤：10μL PCR产物，于3％琼脂糖凝胶电泳，电压200V，电流190mA，电泳时间为20min，在紫外透射分析仪上观察结果。
对所述电泳检测结果，按照如下标准进行判断：
检测样品blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaOXA或aadA基因均无相应大小的扩增条带，可判定该菌不携带blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaOXA或aadA基因四种基因；
检测样品blaCTX-M-9基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产CTX-M-9型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaCTX-M-1基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产CTX-M-1型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaOXA基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产OXA型ESBLs耐药菌株；
检测样品aadA基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为氨基糖苷类耐药菌株。
本发明针对食品中产耐药大肠杆菌所携带的四种耐药基因设计特异性多重PCR探针及试剂盒，并进一步建立mPCR-DHPLC/电泳检测方法，以检测食品中的产CTX-M-1/CTX-M-9/OXA型ESBLs大肠杆菌及耐氨基糖苷类抗生素大肠杆菌。所建立的方法在一次检测中即可同时高特异性、高灵敏度地完成对样品中的大肠杆菌blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaOXA、aadA四种耐药基因的检测，进而确定待检样品是否被所对应耐药大肠杆菌所污染。此外，所述方法检测耗时短，操作简捷，并具有快速高通量等优点，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求，满足了食品中微生物检测迅速准确的需求。
本发明所建立的方法对检测国内大肠杆菌常见基因的产超广谱β-内酰胺酶菌株具有较好的检测效果，且检出两株携带耐药基因却在药敏试验中显示为非产ESBLs的菌株，说明PCR方法比耐药表型方法更稳定。对国内主要流行基因型的产ESBLs大肠杆菌具有较好的检测效果。
附图说明
本发明附图8幅，分别是：
图1：大肠杆菌耐药基因PCR-电泳结果，
图2：大肠杆菌耐药基因PCR-DHPLC结果其中，
图1和图2中：1.blaOXA基因；2.aadA基因；3.blaCTX-M-1基因；4.blaCTX-M-9基因；。
图3：mPCR-电泳检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法特异性测试结果，
图4：mPCR-DHPLC检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法特异性测试结果，
图3和图4中：1.金黄色葡萄球菌；2.单核细胞增生李斯特氏菌；3.鼠伤寒沙门氏菌；4.粪肠球菌；5.大肠杆菌ATCC25922；6.大肠杆菌耐药阳性菌株(表1，菌株5-5，携带blaCTX-M-1，blaCTX-M-9，blaOXA，aadA基因的阳性耐药菌株)。
图5：mPCR-电泳检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法灵敏度测试结果，
图6：mPCR-DHPLC检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法灵敏度测试结果，
图5和图6中：1:5.4×106cfu/mL；2:5.4×105cfu/mL；3:5.4×104cfu/mL；4:5.4×103cfu/mL；5:5.4×102cfu/mL；6:5.4×10cfu/mL。
图7：实际样品分离大肠杆菌耐药基因mPCR-电泳检测结果
图8：实际样品分离大肠杆菌耐药基因mPCR-DHPLC检测结果
图7和图8中：1.携带blaCTX-M-1基因和blaCTX-M-9基因基因的CTX型ESBLs菌株；2.携带blaCTX-M-1基因和blaOXA基因的ESBLs菌株；3.携带blaCTX-M-1基因和aadA基因的CTX型ESBLs菌株；4.携带blaCTX-M-1基因，blaCTX-M-9基因和aadA基因的CTX型ESBLs菌株。
上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。
具体实施方式
下述非限制性实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。
本申请所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，见表1。各菌株使用菌种保存管-80℃保存，活化培养等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法进行。
表1
实施例1
⑴引物的设计、合成与试剂盒的组装：
针对耐药大肠杆菌四种耐药基因blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaOXA、aadA设计引物，所确定用于检测的引物序列及扩增片段长度如表2所示：
表2
在此基础上设计用于mPCR的试剂盒。该试剂盒中包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及上述4对耐药性大肠杆菌的引物对(浓度如表2所示)。
⑵mPCR：
使用上述步骤⑴所设计的多重引物以及相应的试剂盒，进行PCR扩增，包括如下步骤：
①待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组：
a、食品样品：
以无菌操作取食品25g(剪取样品的部位参照国标方法)，粉碎后加入装有225mLBPW的无菌三角瓶或拍击式均质袋中，摇晃3～5min或拍击1min，将三角瓶或均质袋封口后在36℃培养18～24h。
使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。
b、标准菌株：挑取单个菌落于营养肉汤中培养18～24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。
②PCR扩增：
取1μl待测样品DNA溶液，加入12μl试剂盒中的PCR反应液、0.25μL Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水至总体积25μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：
预变性：94℃，1min；
进入循环：94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸90s，30个循环；
终止延伸：72℃，10min；
PCR产物4℃保存待测。
⑶mPCR产物分析：
①取10μL步骤⑵mPCR所得产物在3％琼脂糖凝胶电泳(200V)检测20min后，在紫外透射分析仪上观察结果，如附图1所示。可见，四种耐药基因的PCR产物用凝胶电泳法检测得到单一条带，大小与预期的一致。其中泳道1为blaCTX-M-1基因，扩增出771bp的特异性条带；泳道2为blaCTX-M-9基因，扩增出862bp的特异性条带；泳道3为blaOXA基因，扩增出191bp的特异性条带；泳道4为aadA基因，扩增出272bp的特异性条带。
②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：
色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
按照体积比，流动相为：
0min：55.0％A，45.0％B；
0.5min：50.2％A，49.8％B；
6.1min：38.8％A，61.2％B；
11.8min：35.5％A，64.5％B；
17.4min：33.9％A，66.1％B；
23.0min：32.9％A，67.1％B；
其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物10μL。
本实施例的PCR-DHPLC检测结果如附图2所示，可见：大肠杆菌四种耐药基因的PCR扩增产物在50℃非变性条件下，在目标产物处均出现一个单一的洗脱峰，基线平整。
实施例2.特异性试验
分别提取金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌、大肠杆菌(ATCC25922敏感株)，产CTX-M-1型ESBLs大肠杆菌，产CTX-M-9型ESBLs大肠杆菌，产OXA型ESBLs大肠杆菌，携带aadA基因的耐氨基糖苷类抗生素大肠杆菌(见表1)DNA，根据实施例1所建立的检测方法，取产CTX-M-1型ESBLs大肠杆菌，产CTX-M-9型ESBLs大肠杆菌，产OXA型ESBLs大肠杆菌以及携带aadA基因的耐氨基糖苷类抗生素大肠杆菌DNA模板各1μL作为大肠杆菌阳性DNA模板，并分别取1μL金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌、大肠杆菌(ATCC25922敏感株)DNA模板进行mPCR扩增，并以电泳和DHPLC分析结果，分别如图3和图4所示。
电泳及DHPLC分析结果显示，只有四种耐药基因型大肠杆菌检测到阳性吸收峰，且四个吸收峰与扩增片段大小符合，表明本方法对食品中CTX-M-1、CTX-M-9、OXA型产ESBLs大肠杆菌，及耐氨基糖苷类抗生素aadA型大肠杆菌具有较好的检测特异性。
实施例3检测灵敏度试验
将大肠杆菌阳性耐药菌株(表1中5-5)接种到TSB培养基中，36±1℃培养24h，并通过梯度稀释法或计数法测出增菌液的细菌数量为5.4×108cfu/mL，并对增菌液分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释，得到细菌数量为5.4×107cfu/ml、5.4×106cfu/ml、5.4×105cfu/ml、5.4×104cfu/ml、5.4×103cfu/ml、5.4×102cfu/ml、5.4×10cfu/ml的菌液，并按照实施例1所建立的方法分别对5.4×106cfu/ml、5.4×105cfu/ml、5.4×104cfu/ml、5.4×103cfu/ml、5.4×102cfu/ml、5.4×10cfu/ml的菌液进行DNA提取并电泳检测，结果如附图5所示。图5显示：mPCR-电泳检测最低检测下限为5.4×103cfu/ml。
根据实施例1所建立的方法对5.4×106cfu/ml、5.4×105cfu/ml、5.4×104cfu/ml、5.4×103cfu/ml、5.4×102cfu/ml的菌液进行DHPLC检测，结果如附图6所示。图6显示：mPCR-电泳检测最低检测下限为5.4×103cfu/ml，与电泳检测的最低下限一致。
实施例4.实际样品检测
取4株从实际样品中分离得到的大肠杆菌，按照实施例1的方法提取DNA进行PCR-电泳/DHPLC的检测，检测结果如图7和8。
图7电泳检测结果显示：1号菌株检测到771bp，862bp两条特异性条带，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaCTX-M-9基因的CTX型ESBLs菌株；2号菌株检测到771bp，191bp两条特异性条带，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaOXA基因的ESBLs菌株；3号菌株检测到771bp，272bp两条特异性条带，该菌株为携带blaCTX-M-1和aadA基因的CTX型ESBLs菌株；4号菌株检测到771bp，862bp，272bp三条特异性条带，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaCTX-M-9和aadA的CTX型ESBLs菌株。
图8DHPLC检测结果为：1号菌株为检测到771bp，862bp两条阳性吸收峰，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaCTX-M-9基因的CTX型ESBLs菌株；2号菌株为检测到771bp，191bp两条阳性吸收峰，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaOXA基因的ESBLs菌株；3号菌株为检测到771bp，272bp两条阳性吸收峰，该菌株为携带blaCTX-M-1和aadA基因的CTX型ESBLs菌株；4号菌株检测到771bp，862bp，272bp三条阳性吸收峰，该菌株为携带blaCTX-M-1和blaCTX-M-9和aadA的CTX型ESBLs菌株。
将此4株经mPCR-电泳及DHPLC检测的大肠杆菌进行纸片扩散法及全自动微生物鉴定及药敏系统药敏检测，结果为：1号菌株为ESBLs阳性菌株；2号菌株为ESBLs阳性菌株；3号菌株为ESBLs阳性菌株且对氨基糖苷类抗生素耐药；4号菌株为ESBLs阳性菌株且对氨基糖苷类抗生素耐药。
本发明的电泳及DHPLC检测结果一致，与药敏试验的结果相符，说明该方法对于检测鉴定产CTX-M-1、CTX-M-9、OXA型ESBLs菌株及氨基糖苷类抗生素耐药菌株具有具有良好的效果。
由于细菌耐药性的复杂性，对同一种药物耐药可能存在多种耐药机制或多种耐药基因，因而，单基因无法覆盖所有耐药菌株的检测，为达到尽可能高效、快速、覆盖广、针对性强等方面的要求，本发明针对我国国内主要流行的基因型选择blaCTX-M-1，blaCTX-M-9，blaOXA三种基因作为检测产ESBL大肠杆菌，结合本试验结果来看，所有经本发明方法检测携带此三种基因中任一种或几种基因的菌株，经耐药表型确认均为产ESBLs菌株，本发明所建立的耐药基因型检测避免了耐药表型检测方法中漏检的问题。说明该方法对于检测产CTX-M-1、CTX-M-9、OXA型ESBLs大肠杆菌及携带aadA基因的耐氨基糖苷类抗生素的大肠杆菌具有良好的检测效果。
本实施例中，使用传统纸片扩散法鉴定的耐药菌株，需在细菌菌属鉴定后，再经细菌24h过夜培养才能确认其耐药性，且此方法与细菌鉴定药敏仪均需测定细菌比浊度，易受检测人员操作的影响；且纸片扩散法鉴定耗时需要3-5天，工作量大，鉴定结果影响因素多。而使用本发明的方法可在鉴定细菌菌属的同时，检测其耐药基因，方法平均总耗时(包括样品制备)6h，检测耗时(不包括样品制备)2.5h，操作简便快速。

Claims (9)

1.用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物，包括引物对SEQ ID NO.1/2、SEQ IDNO.3/4、SEQ ID NO.5/6和SEQ ID NO.7/8。
2.用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的试剂盒，包括权利要求1所述的组合物。
3.检测大肠杆菌四种常见耐药基因的方法，包括PCR反应的步骤，其特征在于，所述PCR反应使用权利要求1所述的组合物为扩增引物。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系总体积25μL，包括：待测样品DNA溶液1μl，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，PCR反应液12μL和余量的水；
所述PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP各2.5mM及0.1μM的引物对SEQ ID NO.1/2、0.1μM的引物对SEQ ID NO.3/4、0.2μM的引物对SEQ IDNO.5/6和0.2μM的引物对SEQ ID NO.7/8。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应参数为：
预变性：94℃1min；
进入循环：94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸90s，30个循环；
终止延伸：72℃，10min。
6.权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括对PCR反应产物进行DHPLC分析的步骤，分析条件如下：
色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
按照体积比，流动相为：
0min：55.0％A，45.0％B；
0.5min：50.2％A，49.8％B；
6.1min：38.8％A，61.2％B；
11.8min：35.5％A，64.5％B；
17.4min：33.9％A，66.1％B；
23.0min：32.9％A，67.1％B；
A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽15nm；发射谱带宽15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR产物10μL。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，按照如下标准判断所述DHPLC检测结果：
检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌耐药基因；
检测样品blaCTX-M-1基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产CTX-M-1型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaCTX-M-9基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产CTX-M-9型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaOXA基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为产OXA型ESBLs耐药菌株；
检测样品aadA基因出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品为氨基糖苷类耐药菌株；
检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议重新增菌培养后检测；重做结果峰吸收值仍小于3mV则为阴性，否则为可疑阳性。
8.权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括对PCR反应产物进行电泳分析的步骤：10μL PCR产物，于3％琼脂糖凝胶电泳，电压200V，电流190mA，电泳时间为20min，在紫外透射分析仪上观察结果。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，按照如下标准判断所述电泳结果：
检测样品blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaOXA或aadA基因均无相应大小的扩增条带，可判定该菌不携带blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaOXA或aadA基因四种基因；
检测样品blaCTX-M-9基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产CTX-M-9型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaCTX-M-1基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产CTX-M-1型ESBLs耐药菌株；
检测样品blaOXA基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为产OXA型ESBLs耐药菌株；
检测样品aadA基因出现相应大小的扩增条带，可判定该样品为氨基糖苷类耐药菌株。
CN201410452505.1A 2014-09-05 2014-09-05 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物 Pending CN104212899A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410452505.1A CN104212899A (zh) 2014-09-05 2014-09-05 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410452505.1A CN104212899A (zh) 2014-09-05 2014-09-05 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104212899A true CN104212899A (zh) 2014-12-17

Family

ID=52094801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410452505.1A Pending CN104212899A (zh) 2014-09-05 2014-09-05 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104212899A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544445A (zh) * 2017-01-11 2017-03-29 博奥生物集团有限公司 用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的lamp引物组合及其应用
CN106754907A (zh) * 2017-01-11 2017-05-31 博奥生物集团有限公司 用于检测产超广谱β‑内酰胺酶三种细菌耐药基因的LAMP引物组合及其应用
CN106755386A (zh) * 2016-12-15 2017-05-31 贵州大学 一种畜禽源大肠杆菌β‑内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒及其使用方法
CN111154902A (zh) * 2020-01-21 2020-05-15 成都医学院 ant(3″)-Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物
CN115651990A (zh) * 2022-09-19 2023-01-31 北京金匙医学检验实验室有限公司 用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法
RU2816522C1 (ru) * 2023-07-11 2024-04-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ ИЗ ГРУППЫ aadA У БАКТЕРИЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张忠: ""宁夏地区大肠杆菌临床分离株的耐药性研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
郭翠平: ""山东省禽源大肠杆菌中超广谱 β- 内酰胺酶的基因型检测"", 《中国动物传染病学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755386A (zh) * 2016-12-15 2017-05-31 贵州大学 一种畜禽源大肠杆菌β‑内酰胺类药物耐药基因多重PCR检测试剂盒及其使用方法
CN106544445A (zh) * 2017-01-11 2017-03-29 博奥生物集团有限公司 用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的lamp引物组合及其应用
CN106754907A (zh) * 2017-01-11 2017-05-31 博奥生物集团有限公司 用于检测产超广谱β‑内酰胺酶三种细菌耐药基因的LAMP引物组合及其应用
CN111154902A (zh) * 2020-01-21 2020-05-15 成都医学院 ant(3″)-Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物
CN115651990A (zh) * 2022-09-19 2023-01-31 北京金匙医学检验实验室有限公司 用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法
CN115651990B (zh) * 2022-09-19 2024-01-16 北京金匙医学检验实验室有限公司 用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法
RU2816522C1 (ru) * 2023-07-11 2024-04-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ ИЗ ГРУППЫ aadA У БАКТЕРИЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barykova et al. Association of Mycoplasma hominis infection with prostate cancer
Kirn et al. Update on blood cultures: how to obtain, process, report, and interpret
DeMarco et al. Diafiltration MALDI-TOF mass spectrometry method for culture-independent detection and identification of pathogens directly from urine specimens
Samra et al. Use of the NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test in cerebrospinal fluid for rapid diagnosis of pneumococcal meningitis
Balss et al. Enzymatic assay for quantitative analysis of (D)-2-hydroxyglutarate
Willems et al. Towards a phenotypic screening strategy for emerging β-lactamases in Gram-negative bacilli
CN104212899A (zh) 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物
CN101570783B (zh) 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法
Monsen et al. Flow cytometry analysis using sysmex UF-1000i classifies uropathogens based on bacterial, leukocyte, and erythrocyte counts in urine specimens among patients with urinary tract infections
CN104212901B (zh) 用于金黄色葡萄球菌耐药性检测的组合物
CN104059977A (zh) 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒
Khalil et al. A sensitive colorimetric assay for identification of Acinetobacter baumannii using unmodified gold nanoparticles
Shanthi et al. Detection of Amp C genes encoding for beta-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
Zhang et al. Multidrug resistance found in extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae from rural water reservoirs in Guantao, China
Thabit et al. DETECTION OF EXTENDED-SPECTRUM-LACTAMASE ENZYMES (ESBLs) PRODUCED BY ESCHERICHIA COLI URINARY PATHOGENS AT ASSIUT UNIVERSITY HOSPITAL
Chainier et al. Integron digestive carriage in human and cattle: a “One Health” cultivation-independent approach
Hansen et al. A real-time PCR-based semi-quantitative breakpoint to aid in molecular identification of urinary tract infections
Zeng et al. A polymerase chain reaction based lateral flow test strip with propidium monoazide for detection of viable Vibrio parahaemolyticus in codfish
Xu et al. Rapid detection of mcr-1 by recombinase polymerase amplification
Li et al. A TaqMan-based multiplex real-time PCR assay for the rapid detection of tigecycline resistance genes from bacteria, faeces and environmental samples
Leigh et al. Development and evaluation of a quantitative polymerase chain reaction for aquatic Streptococcus agalactiae based on the groEL gene
Gao et al. d‐Amino Acid‐Based Metabolic Labeling Enables a Fast Antibiotic Susceptibility Test of Both Isolated Bacteria and Bronchoalveolar Lavage Fluid
CN104212902A (zh) 用于耐四环素大肠杆菌检测的组合物
CN104195250B (zh) 用于检测大肠杆菌及其i类整合子的组合物
Dossouvi et al. Molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase-producing extra-intestinal pathogenic Escherichia coli isolated in a university teaching hospital Dakar-Senegal

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141217

RJ01 Rejection of invention patent application after publication