CN106544445A - 用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的lamp引物组合及其应用 - Google Patents

用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的lamp引物组合及其应用 Download PDF

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CN106544445A CN201710017463.2A CN201710017463A CN106544445A CN 106544445 A CN106544445 A CN 106544445A CN 201710017463 A CN201710017463 A CN 201710017463A CN 106544445 A CN106544445 A CN 106544445A
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刘厚明
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Abstract

本发明公开了用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的LAMP引物组合及其应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列12所示的12种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1，可应用于检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1。本发明提供的引物组合鉴定用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

Description

用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的LAMP引物组 合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的LAMP引物组合及其应用。
背景技术
抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物。近年来，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，随着抗生素使用量的加大，细菌耐药的情况也越发严重。
抗生素种类繁多，作用机制多样。氨基糖苷类抗生素是一种分子结构内有1个氨基环醇环和0个、1个或多个氨基糖分子的抗生素，自1944年Waksman等报道了链霉菌产生的链霉素以来，已报道的天然和半合成的氨基糖苷类抗生素总数已经超过了3000种，它具有水溶性好，性质稳定，抗菌谱广，杀菌完全，与β-内酰胺等抗生素有很好的协同作用，对许多致病菌有抗生素后效应等特点。氨基糖苷类抗生素主要作用于细菌体内的核糖体，与30S亚单位的16S rRNA解码区的A部位结合，从而抑制细菌蛋白质的合成并破坏细菌细胞膜的渗透性，加速药物分子的大量进入，从而发挥作用。其中最重要的药物主要有新霉素(Neomycin)、巴龙霉素(Paromomycin)、核糖霉素(Ribostamycin)、卡那霉素(Kanamycin)、庆大霉素(Gentamicin)、西梭米星(Sisomicin)、托普霉素(Tobramycin)等。
随着氨基糖苷类抗生素使用量的加大，相关耐药细菌的出现也备受重视。耐药菌的出现对氨基糖苷类抗生素的使用造成了巨大的威胁。细菌产生耐药性的原因很多，主要原因是减少药物吸收和/或药物在细菌体内的积累；或细菌产生钝化酶使药物失活，后者是耐药的主要原因。由于细菌内质粒上耐药基因(如耐药基因aacC1、耐药基因aadA1)的存在，导致如乙酰基转移酶(AAC)、核苷转移酶(AAD)和磷酸转移酶(APH)等氨基糖苷类抗生素钝化酶的产生，使相关药物进行化学修饰从而与细菌核糖体的结合能力大大降低，由此产生严重的耐药现象。目前细菌耐药性的检测方法主要有通过细菌耐药表型、β-内酰胺酶、特殊耐药菌和耐药基因进行检测。最为直观的检测方法是以体外培养的药物检测，但仍存在培养时间长等缺陷。随着耐药机理的研究逐步深入，分子生物学方法检测细菌耐药基因逐渐被临床接受。常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应(PCR)、PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、生物芯片技术(genechip)、自动DNA测序(DNA sequencing)等。传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；Sanger DNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。
LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展LAMP试剂盒的应用推广。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因的LAMP引物组合及其应用。
本发明首先提供了一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)：
(a1)由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成；
(a2)所述引物组Ⅰ或所述引物组Ⅱ。
所述引物组Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成。
所述引物Ⅰ-F3可为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅰ-B3可为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅰ-FIP可为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅰ-BIP可为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅰ-LF可为如下(b9)或(b10)：
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅰ-LB可为如下(b11)或(b12)：
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅱ可由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成。
所述引物Ⅱ-F3可为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅱ-B3可为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅱ-FIP可为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅱ-BIP可为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅱ-LF可为如下(c9)或(c 10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子。
所述引物Ⅱ-LB可为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(y1)或(y2)或(y3)：
(y1)鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y2)用于检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y3)用于检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途可为如下(y1)或(y2)或(y3)：
(y1)鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y2)用于检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y3)用于检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1的方法，可包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或疑似含有耐药基因aacC1；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中不含有或疑似不含有耐药基因aacC1；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或疑似含有耐药基因aadA1；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中不含有或疑似不含有耐药基因aadA1。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因aacC1；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐药基因aacC1；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因aadA1；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐药基因aadA1。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。
本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
本发明还保护所述引物组合在鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
以上任一所述待测样本可为人(Homo sapiens)的脓液。
以上任一所述耐药基因aacC1具体可为Genebank号为GQ281658.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐药基因aadA1具体可为Genebank号为KF914302.1的核苷酸序列所示的DNA分子。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明提供的引物组合用于检测耐氨基糖苷类抗生素的两种耐药基因，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的检测结果。
图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的检测结果。
图3为实施例4中样本一的检测结果。
图4为实施例4中样本二的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。
pUC57质粒为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式:
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。
实施例1、试剂盒的制备
试剂盒由两个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种耐氨基糖苷类抗生素的耐药基因。
用于检测耐药基因aacC1的引物组如下：
外引物F3：5’-TCGCACATGTAGGCTCG-3’(序列表中序列1)；
外引物B3：5’-AAACTTTGGCAGAACGTAAG-3’(序列表中序列2)；
内引物FIP：5’-CGGCTGATGTTGGGAGTAGGGCTCTTGATCTTTTCGGTCG-3’(序列表中序列3)；
内引物BIP：5’-GACTCCGATTACCTCGGGAACTCGCCAACAACCGCTTCT-3’(序列表中序列4)；
环引物LF：5’-GCTACGTCTCCGAACTCA-3’(序列表中序列5)；
环引物LB：5’-AGACATTCATCGCGCTTG-3’(序列表中序列6)。
用于检测耐药基因aadA1的引物组如下：
外引物F3：5’-TGTGCACGACGACATCA-3’(序列表中序列7)；
外引物B3：5’-GGAACCGGATCAAAGAGTTC-3’(序列表中序列8)；
内引物FIP：5’-CGAAGATACCTGCAAGAATGTCATCCAGCTAAGCGCGAACT-3’(序列表中序列9)；
内引物BIP：5’-CAGCCACGATCGACATTGATCGGACCTACCAAGGCAACG-3’(序列表中序列10)；
环引物LF：5’-GCTGCCATTCTCCAAATTG-3’(序列表中序列11)；
环引物LB：5’-TGACAAAAGCAAGAGAACAT-3’(序列表中序列12)。
用于检测耐药基因aacC1的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测耐药基因aadA1的引物组命名为引物组Ⅱ。
实施例2、特异性实验
待测样本1：含耐药基因aacC1的质粒。含耐药基因aacC1的质粒的制备方法为：将pUC57质粒的MCS区间的DNA片段替换为Genebank号为GQ281658.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重组质粒即为含耐药基因aacC1的质粒。
待测样本2：含耐药基因aadA1的质粒。含耐药基因aadA1的质粒的制备方法为：将pUC57质粒的MCS区间的DNA片段替换为Genebank号为KF914302.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重组质粒即为含耐药基因aadA1的质粒。
各个待测样本分别进行如下步骤：
1、提取待测样本的质粒DNA。
2、以步骤1提取的质粒DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液、1μL引物混合物、1μL质粒DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
按照上述方法，将质粒DNA替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。
采用引物组Ⅰ的结果见图1。待测样本为含耐药基因aacC1的质粒(即待测样本1)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。待测样本为含耐药基因aadA1的质粒(即待测样本2)或空白对照的时候不显示阳性扩增曲线(即非“S型”扩增曲线)。
采用引物组Ⅱ的结果见图2。待测样本为含耐药基因aadA1的质粒(即待测样本2)的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。待测样本为含耐药基因aacC1的质粒(即待测样本1)或空白对照的时候不显示阳性扩增曲线(即非“S型”扩增曲线)。
以上结果表明，本发明提供的两个引物组分别对其靶标基因具有很高的特异性。
实施例3、灵敏度实验
待测样本1：实施例2制备的含耐药基因aacC1的质粒。
待测样本2：实施例2制备的含耐药基因aadA1的质粒。
1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组进行环介导等温扩增。
待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、5×102、102或101)，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
引物组Ⅰ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅱ检测靶标基因的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。
实施例4、应用
待测样本为样本一或样本二：
样本一：已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有耐药基因aacC1的人的脓液；
样本二：已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有耐药基因aadA1的人的脓液。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的待测样本的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系与反应条件均同实施例2。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。
样本一的结果见图3。采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。采用引物组Ⅱ或空白对照的时候不显示阳性扩增曲线，与实际情况完全一致。
样本二的结果见图4。采用引物组Ⅱ检测的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。采用引物组Ⅰ或空白对照的时候不显示阳性扩增曲线，与实际情况完全一致。
以上结果表明，利用本发明提供的试剂盒可以对耐氨基糖苷类抗生素的耐药基因aacC1和耐药基因aadA1进行检测，结果准确可靠。
<110> 博奥生物集团有限公司 深圳市第三人民医院
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<223>
<400> 6
agacattcat cgcgcttg 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
tgtgcacgac gacatca 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
ggaaccggat caaagagttc 20
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
cgaagatacc tgcaagaatg tcatccagct aagcgcgaac t 41
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
cagccacgat cgacattgat cggacctacc aaggcaacg 39
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gctgccattc tccaaattg 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
tgacaaaagc aagagaacat 20

Claims (9)

1.引物组合，为如下(a1)或(a2)：
(a1)由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成；
(a2)所述引物组Ⅰ或所述引物组Ⅱ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)：
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)：
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c 10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(y1)或(y2)或(y3)：
(y1)鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y2)用于检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y3)用于检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(y1)或(y2)或(y3)：
(y1)鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y2)用于检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1；
(y3)用于检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或疑似含有耐药基因aacC1；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中不含有或疑似不含有耐药基因aacC1；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中含有或疑似含有耐药基因aadA1；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌中不含有或疑似不含有耐药基因aadA1。
6.一种检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因aacC1；如果采用所述引物组Ⅰ不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐药基因aacC1；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐药基因aadA1；如果采用所述引物组Ⅱ不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐药基因aadA1。
7.权利要求1所述引物组合在检测待测菌是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
8.权利要求1所述引物组合在检测待测样本中是否含有耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
9.权利要求1所述引物组合在鉴定耐药基因aacC1和/或耐药基因aadA1中的应用。
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