KR20180124619A

KR20180124619A - Lamp를 이용한 마이코플라즈마 검출용 프라이머 및 그 용도

Info

Publication number: KR20180124619A
Application number: KR1020170059448A
Authority: KR
Inventors: 전효성
Original assignee: 주식회사 엠모니터
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2018-11-21

Abstract

본 발명은 흔한 세포배양의 원인균으로 널리 알려진 마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)을 LAMP(loop mediated isothermal amplification) 방법에 의해 각각 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것으로, 상기 프라이머 세트를 이용하는 마이코플라즈마 균주 검출 방법, 상기 프라이머 세트를 포함하는 검출용 조성물 및 검출용 키트를 제공한다.

Description

LAMP를 이용한 마이코플라즈마 검출용 프라이머 및 그 용도 {Primers used for LAMP reaction for the detection of mycoplasma and its use}

본 발명은 Loop Mediated Isothermal Amplification (이하　LAMP） 방식을 이용한 마이코플라즈마 검출용 프라이머 및 그 용도에 관한 것이다.

마이코플라즈마는 박테리아보다 작고 사상형(filamentous)과 구형(coccal)의 형태를 가진 세포벽이 없는 미생물로서 실험실에서 세포배양 시 감염이 흔하게 일어나나 표현형의 변화를 일으키지 않아 광학현미경으로 발견하기가 어려워 세포배양 실험실이나 세포은행에서 문제가 된다. 평균 15% ~ 35% 의 세포가 마이코플라즈마에 감염되어있다는 조사결과가 있으며 감염된 마이코플라즈마의 박멸을 위해 몇가지의 항생제를 사용할 수는 있으나 상당수의 마이코플라즈마에서 테트라사이클린계 항생제에 내성이 생겼고, Mycoplasma bominis 의 경우 에리스로마이신에 대한 자연내성을 지니고 있어 치료가 용이하지는 않다.

식물학적으로는 마름무늬매미충 등의 벡터를 통해 대추나무나 뽕나무와 같은 과실나무들에 도깨비집병이나 오갈병과 같은 문제를 유발하며, 축산학적으로도 특히 양계업계에서 문제가 되는 복합만성호흡기병, 전염성활막염 등과의 연관성 및 높은 감염률로 관리의 중요성이 높은 세균이다. 계란내 잔류 등의 문제로 인한 항생제 사용의 어려움으로 무감염계 유지관리, 철저한 위생관리, 동일 연령계 유지를 통한 올인올아웃(all-in all-out) 체계 등의 전통적인 근절법에 주로 의존할 수 밖에 없는 상황임에도 불구하고 대부분의 아시아 국가 전반에서 다양한 마이코플라즈마 종이 분리되고 있다.

실험실 수준에서, 특히나 세포 배양에서 마이코플라즈마 오염은 빈번하게 발생하는 심각한 미생물 오염 중 하나이고 오염의 결과로 세포 대사작용의 저해 및 세포 죽음 등으로 세포의 증식 속도 저하와 세포기능의 심각한 변화를 초래하는 것으로 알려져 있다. 최근 들어 인간 배아줄기세포를 이용한 난치성 질환의 세포치료제 등에 대한 연구와 제품개발이 활성화되면서 세포치료제의 안전성·유효성 및 품질 평가 가이드라인에 마이코플라즈마 검사가 포함되어 있을 만큼 마이코플라즈마의 유무는 세포치료제의 안전성 평가에도 중요한 기준이다.

루프매개 등온증폭은 증폭하고자 하는 타겟 유전자와 프라이머의 결합으로부터 신장까지의 과정이 모두 등온 환경에서 이루어질 수 있는 효소의 특수한 성능과 더불어 4-6개의 프라이머 쌍의 디자인이 민감도를 결정하는 핵심적인 요소라고 할 수 있으며 일반적인 분자진단의 결과 확인법인 아가로스 전기영동 혹은 별도의 기기가 없이도 색상변화로 결과 확인이 나안(裸眼)으로 가능하여 편리성이 매우 높은 방법이다. 이러한 검사법의 특장점으로 인해 현장진단법으로서의 유용성이 여러 연구들을 통해 널리 인정되고 있으며5-7), 최근 보건복지부에서는 이 기법을 결핵 검사법으로서의 안정성과 유효성을 인정하여 고시한 바 있다.

현재 국내 특허 10-2009-0081039 호에 의하면 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코 플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 아코레 플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 또는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)에 대한 PCR 프라이머를 제시하고 있다.

본 발명자들은 신속한 검출이 가능함과 함께, 높은 특이도를 가지는 마이코플라즈마 검출용 프라이머를 개발하고자 예의 연구한 결과, 세포 배양액으로부터 별도의 전처리 과정없이 단순 가열 처리 이후 주형(template)으로 삼아 LAMP 반응을 유도하여 다수의 종을 한번에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 디자인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 마이코플라즈마 균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 및 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나이상의 프라이머 세트를 포함하는, 마이코플라즈마 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트로서,

상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하고,

상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 7 내지 12로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하며,

상기 제3 프라이머 세트는 서열번호 13 내지 18로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 것인, 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것을 특징으로 한다.

또한 하기의 단계를 포함하는, 상기 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 마이코플라즈마 균을 검출하는 방법을 제공한다:

마이코플라즈마 균 검출이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;

상기 프라이머 세트 중 어느 하나의 세트를 제공하는 단계;

상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및

상기 LAMP 반응 결과를 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 마이코플라즈마 감염으로 판정하는 단계.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 또는 코인두 분비물 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 LAMP 반응 결과물 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 조성물을 제공한다.

아울러, 상기 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는, 마이코플라즈마의 실험실에서의 중요성에 견주어볼 때 되도록 많은 종류의 마이코플라즈마 종의 유무를 빠른 시간 내에 확인하는 것이 가능한 프라이머 세트로, 세포 배양액으로부터 별도의 전처리 과정없이 단순 가열 처리 이후 주형(template)으로 삼아 LAMP 반응을 유도함으로써 빠르게 다종의 마이코플라즈마를 검출해낼 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 최종 검출 결과 확인은 육안으로 변화되는 색상을 감지함으로써 가능하며, 종래 PCR을 이용한 검출 방법과 비교할 때, 전체 반응시간을 단축하는 것과 동시에, 각 종에 대하여 높은 특이도를 가지는 장점이 있다. 일반적으로 LAMP 반응을 통한 검출 방법은, PCR 검출법에 비해 많은 프라이머쌍을 사용하기 때문에 많은 종을 한꺼번에 감지하기 위한 프라이머 사이트는 상당히 제한적인 특징이 있다. 이에 본 발명에서는 약 70여종에 달하는 마이코플라즈마 종을 진단할 수 있는 프라이머세트를 직접 디자인하였고, 70여종의 마이크플라즈마에 대하여 특이적으로 진단이 가능하다는 것을 실험적으로 확인하였다.

도 1은 마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)의 균주들에 대하여 제작한 플라스미드를 주형으로 등온증폭을 수행한 후, 반응물의 색상 및 전기영동을 통해 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)의 균주들에 대하여 제작한 플라스미드를 주형으로 사용하고, 본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭을 수행한 후, 반응물의 색상 및 전기영동을 통해 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 다종의 균주 간에 교차반응을 통해 반응물이 색 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 LAMP 방식을 이용하여 마이코플라즈마를 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것으로, 본 발명은 다종의 마이코플라즈마를 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법)으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 그 용도로서, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 상기 프라이머 세트 또는 조성물 또는 키트를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다.

한 양태에서 본 발명은 마이코플라즈마의 여러 균주들을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 분석에 사용되는 것이다.

본 발명에서 용어 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트가 사용되는 마이코플라즈마 균의 핵산은 마이코플라즈마 균 유래의 DNA, 예를 들면 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또는 이에 상응하는 DNA를 포함하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 "프라이머"도 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.

본 발명에서 용어 "검출"은 마이코플라즈마 균의 감염 여부, 또는 감염된 대상체의 예후를 판정하는 것, 감염 후 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "표적" 또는 "표적 핵산"은 본 발명의 프라이머 세트가 결합하여 본 발명에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개의 프라이머 세트 (한국 특허 제612551호 등 참고)를 표준 방법으로 하여, 6개의 프라이머 세트를 이용한 방법 (Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고), 그리고 역전사 방식의 LAMP (Yoshida, N. et al. 2007. Simple differentiation method of mumps Hoshino vaccine strain from wild strains by RT-LAMP. Vaccine 25, 1281-6 등 참고)를 모두 포함하는 것이다.

본 발명에서 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합 할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본 발명에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "교잡" 또는 "혼성화"는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본 발명에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것을 참고 할 수 있다.

본 발명에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본 발명에 따른 표적인 마이코플라즈마 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 프라이머는 마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)들을 LAMP 방식을 통해 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인 된 것으로, 각 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 HA(Hemagglutinin) 유전자, Matrix 유전자 및 NA(Neuraminidase) 유전자 부위를 특이적으로 인식하여 높은 민감도로 균을 검출할 수 있도록 디자인 되었다.

상술한 바와 같이 LAMP 반응에는 최소 4개의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응을 위해 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머, 및 LB 프라이머의 특징 및 기능 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein ("FAM"), TET, ROX, VIC, 또는 JOE가 사용된다. 일 구현예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다. 또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.

또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.

다른 양태에서 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 본 발명에 따른 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 반응에 사용되는 성분 및 검출하고자하는 마이코플라즈마 유형에 적합한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 반응에 사용되는 성분 및 검출하고자 하는 마이코플라즈마 유형에 적합한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 별도로 또는 하나의 튜브에 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 핵산을 포함하지 않는 시료, 양상대조군은 하나 이상의 검출대상 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머, 키트 및 조성물은 생물학적 시료에서 마이코플라즈마를 핵산수준에서 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 핵산의 존재 여부, 핵산 증가, 변화 정도에 따라 마이코플라즈마 감염 또는 감염 후 치료를 받는 경우 치료의 효과를 예측할 수 있다.

이런 측면에서 본 발명은 또한 마이코플라즈마의 검출, 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 시료에서 마이코플라즈마 균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 상술한 바와 같은 프라이머세트, 조성물 또는 키트를 이용하여 수행되며, 일 구현예에서 마이코플라즈마 검출이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료로부터 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 를 수행하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 이어 증폭결과를 대조군의 시료와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 대상체 시료와 비교하여 증폭산물의 양에 변화가 있는 경우, 이를 마이코플라즈마 감염으로 판정하는 단계를 포함하는, 마이코플라즈마를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 정성 또는 정량분석을 통해 감염 여부를 판별할 수 있으며, 예를 들면 음성 대조군과 비교하여 그 양이 증가한 경우, 또는 음성 대조군에는 검출되지 않았으나, 시료에서 양성 반응이 나온 경우, 또는 일정한 양 이상으로 검출이 된 경우 이를 감염으로 판정할 수 있을 것이다. 판정 또는 판단 기준은 당업계의 기준을 고려하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법에 사용되는 시료, 시약, 증폭 방법 및 반응 조건 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 마이코플라즈마 표준물질 확보

마이코플라즈마 종(Mycoplasma species)들 중 하기 표 1에 명시된 균주들에 대해 플라스미드를 제작하여 실시예에서 사용하였다.

LAMP 기술을　이용한　프라이머를　검증하기　위해서　먼저　주형　DNA를　추출하였다．　H1299 (ATCC, CRL-5803) 세포주를　배양　배지　（RPMI1640, 10% FBS, Clontech)에　키운　다음，　mycoplasma를　접종하였다．　24시간　배양후　세포와　배지를　함께　또는　분리하여　DNA를　추출하였다．　DNA 추출은 시료를 채취하여 G-spin total DNA Extraction mini kit (iNtRON biotechnology, 대한민국)를 사용하여 DNA를 추출하였다.

추출된 DNA는 UV 분광도계로 농도와 순도를 측정한 다음 LAMP 반응에서 주형 DNA로 사용하였다. 주형 DNA는 LAMP 반응에 사용하기 쉽게 distilled water에 10ng/ul의 농도로 희석하여 다음 사용 시까지 70℃에 보관하였다.

species
M.hyorhinis	Entomoplasma freundtii	M.anseris
M.zalophi	Spiroplasma lineolae	M.hyorhinis
M.yeatsii	Spiroplasma tabanidicola	M.lagogenitalium
M.cottewii	Acholeplasma multilocale	M.moatsii
M.putrefaciens	Entomoplasmamelaleucae	Mycoplasma sp. LR5794
M.leachii	Mesoplasma photuris	M.molare
M. capricolum subsp. capricolum	Spiroplasma culicicola	M.sualvi
M.capricolumcapricolum	M.monodon	M.iguanae
M.mycoidessubsp.capri	M.arginini	M.conjunctivae
M.mycoidessubsp.mycoidesSC	M.canadense	M.orale
M.mycoidesmycoidesLC	M.gateae	M.falconis
M.capricolumcapripneumoniae	M.subdolum	M.hominis
Mesoplasmaseiffertii	M.alkalescenns	M.cloacale
Mesoplasma syrphidae	M.buccale	M.pulmonis
Mesoplasma corruscae	M.auris	M.testudineum
Mesoplasma chauliocola	M.phocicerebrale	M.neophronis
Mesoplasma florum	M.arthritidis	M.dispar
Mesoplasma tabanidae	Mycoplasma sp. Sgv2e	M.timone
Mesoplasma coleopterae	Mycoplasmasp. Sgv2b	Mycoplasma sp.13CL
Mesoplasma grammopterae	Mycoplasmasp. Sgv2c	M.spumans
Mesoplasma entomophilum	Mycoplasmasp. Sgv2d	M.phocidae
Entomoplasma lucivorax	M.hyosynoviae	M.equirhinis
Entomoplasma ellychniae	M.salivarium
Entomoplasma somnilux	M.faucium

실시예 2. 마이코플라즈마 종에 특이적인 프라이머 제작

마이코플라즈마 종(Mycoplasma species) 균주의 정확한 검출을 위해 리보솜 유전자를 포함한 다양한 유전자를 NCBI 및 GeneBank에서 검색하여 확인한 후 균주에 특이적인 최종 프라이머를 디자인하였다.

마이코플라스즈마의 유전자 서열 및 유전체 서열은 GenBank 및 GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data) 로부터 수득하였으며, 사용한 해당 스트레인은 표1 같다. 각 프라이머는 16S rRNA의 유전자 서열을 배열하여 공통으로 검출할 수 있는 프라이머 서열로 작성하였다.

구체적으로 ClustalX multiple sequence alignment program을 이용하여 정렬한 뒤 이로부터 LAMP 프라이머를 디자인하였다. 프라이머는 HA(Hemagglutinin) 유전자, Matrix 유전자 및 NA(Neuraminidase) 유전자 부위의 서열로부터 다양한 서열 및 조합으로 디자인하였고, 프라이머로서의 가능성은 BLAST program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)으로 검증하였다. 각 프라이머 서열은 다양한 서열 및 조합으로 실험된 프라이머 중에서 특이성 및 민감도 측면에서 최적이며, LAMP 반응에 최적화되도록 디자인된 것이다. 나아가 본원에 따른 프라이머는 FIP, BIP 프라이머에 링커를 포함하지 않아 제조 비용이 낮은 것은 물론 LAMP 반응이 보다 효과적으로 진행될 수 있도록 디자인된 것이다. 프라이머는 외부에 의뢰하여 합성하였으며, 프라이머 서열은 아래 표 2, 3, 및 4와 같다.

	- 프라이머 세트 #1
F3	5′-AGT CCT GCA ACG AGC GCA A-3′(서열번호 1)
B3	5′-TGA CGG GCG GTG TGT ACA A-3′(서열번호 2)
FIP	5′-TTT GTA CCG GCC ATT GTA GCA CGT GGA GGA AGG TGG GGA TGA CG-3′(서열번호 3)
BIP	5′-TCT CAG TTC GGA TTG AAG TCT GCA ACC CGA GAA CGT ATT CAC CG-3′(서열번호 4)
LF	5′-GCC CCA STC GTA AGA GGC ATG-3′(서열번호 5)
LB	5′-GAA GTC GGA ATC GCT AGT AAT CG-3′(서열번호 6)

	- 프라이머 세트 #2
F3	5′-GAA ACT TAA AGG AAT TGA CGG G-3′(서열번호 7)
B3	5′-GGT AAG GTT CTH CGC GTA TCT TG-3′(서열번호 8)
FIP	5′-TAA TGA TCA TCG TTT ACG GCG ACG AAA GCG TGG GGA GCA AAC A-3′(서열번호 9)
BIP	5′-TCC GCC TGA GTA GTA CGY TCG CAA GAC ATG CTC CAC CGC TTG TGC GG-3′(서열번호 10)
LF	5′-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3′(서열번호 11)
LB	5′-GAA ACT TAA AGG AAT TGA CGG G-3′(서열번호 12)

	- 프라이머 세트 #3
F3	5′-GCG TAG ATA TAT GGA AGA ACA CC-3′(서열번호 13)
B3	5′-TAA ACA ACA TGC TCC ACC GCT T-3′(서열번호 14)
FIP	5′-CAT CGT TTA CAG CGT GGA CTA CAT ACT GAC ACT GAG GSA CGA AAG CGT G-3′(서열번호 15)
BIP	5′-GCA GYT AAC GCA TTA AAT GAT CCG CGT GCG GGT CCC CGT CAA TTC C-3′(서열번호 16)
LF	5′-GGG TAT CTA ATC CTG TTT GCT CC-3′(서열번호 17)
LB	5′-CTG AGT AGT ACG TTC GCA AG-3′(서열번호 18)

LAMP는 총 25 μl로 반응하였으며, LF 및 LB를 제외한 4개의 프라이머 또는 6개의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 반응에 사용된 조성 및 성분은 프라이머의 갯수를 제외하고는 동일하였으며, 다음과 같다. 총 25μl에 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1×ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 120μM HNB (Sigma) 및 10μl의 균주 분석이 필요한 시료 혹은 분리된 50ng DNA를 포함한 조성의 용액에서 수행하였다. LAMP 반응은 6개의 프라이머를 사용한 경우는 63℃에서 30분 동안 실시하였으며 Bst DNA polymerse는 80℃ 이상의 온도에서 불활성을 나타내므로 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

본 발명에 따른 균주 특이적 프라이머의 특이성 판단을 위해 사용한 대조군은 각 도면에 표시된 바와 같으며, 증폭 결과는 색분석 및 전기영동으로 분석하였다.

색분석은 HNB (hydroxy naphthol blue) 염료를 반응액에 넣어 수행하였다. HNB는 Mg² ⁺ 이온 농도의 지시자(indicator)로서 작용한다. Mg² ⁺이온이 없을 경우, 하늘색으로 보이며, Mg² ⁺ 이온이 있을 경우, 보라색을 띤다. 따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg² ⁺ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응으로, 나안 또는 약 650nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.

실시예 3. 표준물질 유효성 검증

실시예 1에서 확보한 플라스미드가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 보유된 마이코플라즈마 종 (Mycoplasma species) 플라스미드를 25pg 에서 1.6fg 까지 각각 1/5 단계희석하고, 희석한 플라스미드를 주형으로 63℃에서 30분 동안 등온증폭을 한 후 80℃에서 5분간 반응하여 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 1).

실시예 4. 프라이머 민감도 비교

실시예 1에서 확보한 마이코플라즈마 종 (Mycoplasma species) 플라스미드를 이용하여 100pg에서 50fg까지 각각 1/10씩 단계희석하여 주형으로 사용하고, 실시예 2에서 확보한 프라이머 세트를 이용하여 63℃에서 30분 동안 등온증폭을 한 후 80℃에서 5분간 반응하여 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 2).

실시예 5. 프라이머 특이도 검증

실시예 2 에서 제작한 각각의 6쌍의 프라이머를 이용하여 비교적 흔한 감염을 일으키는 것으로 알려진 여러 가지 균주간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화로 특이도를 확인하였다(도 3).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Mmonitor Inc. <120> Primers used for LAMP reaction for the detection of mycoplasma and its use <130> YP17-0323 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_F3 <400> 1 agtcctgcaa cgagcgcaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_B3 <400> 2 tgacgggcgg tgtgtacaa 19 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_FIP <400> 3 tttgtaccgg ccattgtagc acgtggagga aggtggggat gacg 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_BIP <400> 4 tctcagttcg gattgaagtc tgcaacccga gaacgtattc accg 44 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_LF <400> 5 gccccastcg taagaggcat g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1_LB <400> 6 gaagtcggaa tcgctagtaa tcg 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_F3 <400> 7 gaaacttaaa ggaattgacg gg 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_B3 <400> 8 ggtaaggttc thcgcgtatc ttg 23 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_FIP <400> 9 taatgatcat cgtttacggc gacgaaagcg tggggagcaa aca 43 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_BIP <400> 10 tccgcctgag tagtacgytc gcaagacatg ctccaccgct tgtgcgg 47 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_LF <400> 11 ggactaccag ggtatctaat cc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2_LB <400> 12 gaaacttaaa ggaattgacg gg 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_F3 <400> 13 gcgtagatat atggaagaac acc 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_B3 <400> 14 taaacaacat gctccaccgc tt 22 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_FIP <400> 15 catcgtttac agcgtggact acatactgac actgaggsac gaaagcgtg 49 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_BIP <400> 16 gcagytaacg cattaaatga tccgcgtgcg ggtccccgtc aattcc 46 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_LF <400> 17 gggtatctaa tcctgtttgc tcc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3_LB <400> 18 ctgagtagta cgttcgcaag 20

Claims

제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 및 제3 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나이상의 프라이머 세트를 포함하는, 마이코플라즈마 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트로서,
상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하고,
상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 7 내지 12로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하며,
상기 제3 프라이머 세트는 서열번호 13 내지 18로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 것인, 프라이머 세트.
제 1 항에 있어서,
상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것인, 마이코플라즈마 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
하기의 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 마이코플라즈마를 검출하는 방법:
마이코플라즈마 검출이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;
제 1 항에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나의 세트를 제공하는 단계;
상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및
상기 LAMP 반응 결과를 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 마이코플라즈마 감염으로 판정하는 단계.
제 3 항에 있어서,
상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 또는 코인두 분비물 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 LAMP 반응 결과물 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 조성물.
제 1 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트.