CN115651990B - 用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 - Google Patents

用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法，通过检测特征组合中的基因的存在预购判断大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶的药敏表型。本发明提供的特征组合预测药敏表型的准确率高，有利于临床开展对大肠埃希菌相关感染的精准治疗。

Description

用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试 剂盒及测序方法
技术领域
本发明涉及基因测序技术，具体说，是一种用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法。
背景技术
大肠杆菌属于革兰阴性菌，共生型的大肠杆菌作为肠道菌群的一部分可以与人和动物共生，但仍有许多大肠杆菌菌株对动物和人具有致病性。如肠外致病性大肠杆菌可引起动物和人的尿道、血液、皮肤和软组织感染；而且这类细菌是临床感染最常见的病原菌之一，由其引起的发病在细菌引起的疾病中居世界首位，大肠杆菌耐药性的出现不仅增大了临床治疗的难度，而且增加了对人体健康的危害。
许多的抗菌药物具有广谱、高效以及不同抗菌药物之间具有协同作用的特点，而且大肠杆菌血清型众多，免疫预防的效果并不理想，因此使用抗菌药物治疗大肠杆菌感染依旧是目前主要的方法，但是养殖业中不合理使用抗菌药物以及在饲料中添加抗菌药来促进动物的生长造成了大肠杆菌耐药性越来越严重。大肠杆菌的耐药性已经成为一个令人担忧的问题，具有通过水平基因转移积累抗性基因的能力，具有这种能力的基因有编码超广谱β-内酰胺酶(赋予对广谱头孢菌素的抗性)、碳青霉烯酶(赋予对碳青霉烯类的抗性)、16SrRNA甲基化酶(赋予对氨基糖苷类的抗性)的基因，以及质粒介导的喹诺酮抗性基因(赋予对氟代喹诺酮类药物的抗性)和mcr基因(赋予对多黏菌素的抗性)等.
抗生素敏感试验(AST,简称药敏试验)在当前病原微生物耐药性持续增长的形势下，已成为指导临床科学合理用药不可或缺的重要环节。因此，药敏检测方法的完善与发展是快速获取科学、准确微生物耐药谱的前提，也是实现有效临床治疗的重要保障。长期以来对于药敏检测方法研究一直备受重视。纸片扩散法、稀释法等传统方法由于它们操作相对简单、成本低廉，一直是当前人们所推崇的药敏检测方法，但它们的检测结果易受多方面因素干扰，包括依赖于培养，在针对一些生长缓慢菌株、难养菌及厌氧菌的药敏检测上都存在一定的局限性，阳性率低、耗时长等不足。近年来，随着分子生物学、微生物生理学等学科的飞速发展，一些新型的药敏检测技术(流式细胞荧光法抗生素敏感试验、基于微流体技术的药敏试验、针对生物膜的药敏试验、基于辅助显色试剂的快速药敏检测、分子生物学药敏检测技术等)也不断涌现。这些方法具有便捷、快速、直观等优点，但目前在稳定性及可操作性上还有待进一步完善。
以上除分子生物雪药敏检测技术外所描述的新型药敏检测技术都属于对待检菌株耐药性的表型检测，尽管这些药敏检测技术相对简单，但都需要迸行菌株分离、纯化，因此一般需要较长时间才能完成，另外它还受到不同实验条件的影响，往往需要几种方法相互印证才能获得准确的结果。为了缩短药敏检测的时间、提升药敏试验的可靠性，一些针对细菌抗药性基因的分子生物学检测技术开始建立和运用，例如PCR技术、分子杂交技术等，尽管该方法与传统方法相比是一种革新，但却需要建立在对细菌耐药性分子机制的深入探究和了解的基础上，特别是对于一些多重耐药菌该技术难以准确判别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合、试剂盒及测序方法，可一次性分析亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶4种抗生素耐药情况，具有较好的准确率、敏感度和特异性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶中的一种或几种组合；
预测大肠埃希菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合包括KPC-3、NDM-9、NDM-5，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合包括NDM-5、NDM-9、NDM-7、KPC-2，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对头孢噻肟药敏表型的特征基因组合包括CMY-2、CMY-42、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-27、CTX-M-15、CTX-M-65、NDM-5、NDM-1、KPC-3、SHV-12、TEM-135，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对头孢他啶药敏表型的特征基因组合包括KPC-3、CMY-2、CMY-42、NDM-1、CTX-M-55、CTX-M-1、CTX-M-15、SHV-12，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药。
优选，所述预测大肠埃希菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合还包括KPC-2、NDM-7、NDM-1基因。
优选，所述预测大肠埃希菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合还包括NDM-1、KPC-3基因。
优选，所述预测大肠埃希菌对头孢噻肟药敏表型的特征基因组合还包括CMY-44、CMY-30、CTX-M-9、CTX-M-2、NDM-9、KPC-2、SHV-2、IMP-70、TEM-225、TEM-116基因。
优选，所述预测大肠埃希菌对头孢他啶药敏表型的特征基因组合还包括KPC-2、CMY-44、CMY-30、NDM-5、NDM-7、CTX-M-2基因。
含有上述用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
采用上述试剂盒对大肠埃希菌进行药敏表型的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
本发明的有益效果是：本发明是基于核酸分子检测耐药的方法，可不依赖于细菌培养，直接针对临床标本或其他方式取得的少量大肠埃希菌基因组核酸进行检测，并根据本发明提供的特征基因组合预测其药敏表型，相比传统方法具有检测周期短，检测灵敏度高的特点。
附图说明
图1是用于亚胺培南药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的大肠埃希菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
图2是用于美罗培南药敏表型预测的特征基因在公共数据库下载的大肠埃希菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
图3是用于头孢噻肟药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的大肠埃希菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
图4是用于头孢他啶药敏表型预测的特征基因突变位点在公共数据库下载的大肠埃希菌菌株中的检出结果(左半)与实际药敏表型结果和预测药敏表型结果之间的对应关系(右半)图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明采用的技术方案是：一种用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合，抗生素为亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶中的一种或几种组合；
预测大肠埃希菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合包括KPC-3、NDM-9、NDM-5，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合包括NDM-5、NDM-9、NDM-7、KPC-2，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对头孢噻肟药敏表型的特征基因组合包括CMY-2、CMY-42、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-27、CTX-M-15、CTX-M-65、NDM-5、NDM-1、KPC-3、SHV-12、TEM-135，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
预测大肠埃希菌对头孢他啶药敏表型的特征基因组合包括KPC-3、CMY-2、CMY-42、NDM-1、CTX-M-55、CTX-M-1、CTX-M-15、SHV-12，基因同时进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一基因检测结果为阳性，推测为耐药；和/或
优选、所述预测大肠埃希菌对亚胺培南药敏表型的特征基因组合还包括KPC-2、NDM-7、NDM-1基因。
优选、所述预测大肠埃希菌对美罗培南药敏表型的特征基因组合还包括NDM-1、KPC-3基因。
优选，所述预测大肠埃希菌对头孢噻肟药敏表型的特征基因组合还包括CMY-44、CMY-30、CTX-M-9、CTX-M-2、NDM-9、KPC-2、SHV-2、IMP-70、TEM-225、TEM-116基因。
优选，所述预测大肠埃希菌对头孢他啶药敏表型的特征基因组合还包括KPC-2、CMY-44、CMY-30、NDM-5、NDM-7、CTX-M-2基因。含有上述用于预测大肠埃希菌对抗生素药敏表型的特征基因组合检测试剂的试剂盒。
采用上述试剂盒对大肠埃希菌进行药敏表型的测序方法，采用全基因组测序方法或宏基因组测序方法。
下面结合具体的检测方法和效果对比，对本发明进行详细说明：
实施例1用特征组合对公共数据库中大肠埃希菌的药敏表型进行预测
1.1数据收集：从公共数据库(NCBI NDARO数据库和PATRIC数据库)下载3894株大肠埃希菌基因组信息及其对应抗生素药敏表型数据。其中亚胺培南(英文缩写IPM)耐药株143株，敏感株1473株；美罗培南(英文缩写MEM)耐药株191株，敏感株1293株；头孢噻肟(英文缩写)耐药株901株，敏感株1342株；头孢他啶(英文缩写)耐药株738株，敏感株1681株。
1.2耐药基因及突变检测：用ncbi-blast(v2.9.0+)软件将组装好的基因组序列与耐药数据库进行比对(参数：-evalue 1e-5-outfmt 0-num_alignments 10000)，进行上述耐药基因和突变位点检测。对于基因有无特征，与该耐药基因的参考序列的比对一致率高于90％且覆盖率高于60％。
1.3统计各大肠埃希菌的菌株中耐药基因和突变的检出情况。
1.4药敏结果预测：对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测，检测出特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如图1-图4所示，亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶六种模型中，通过各菌株中的检出的特征预测得到的药敏结果，和实际药敏表型高度一致。预测性能如表1所示，特征组合预测亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶的药敏表型准确率分别为0.978、0.970、0.973、0.938，特异性和敏感度也在较高的水平。各耐药特征的特征检出样本数、表型耐药样本数和阳性预测值(阳性预测值＝表型耐药样本数/特征检出样本数)见表2。上述结果说明，利用上述特征组合，对大肠埃希菌表型耐药和表型敏感有较好的区分效果。
表1.预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
表2.特征基因和突变在公共数据库来源的菌株中的检出频数
实施例2用特征组合对临床标本中分离的大肠埃希菌的药敏表型进行预测
2.1样本采集：从某医院采集从临床标本中分离的大肠埃希菌915例，并收集相应的药敏结果。其中，亚胺培南耐药8株，敏感332株；美罗培南耐药16株，敏感274株；头孢噻肟耐药191株，敏感325株；头孢他啶耐药163株，敏感416株。
2.2样本全基因组测序：对样本进行核酸提取，Qubit检测后，确认DNA可以满足后续测序要求，对提取的核酸进行测序文库建库及高通量测序(Illumina Novaseq 6000PE150)。
2.3测序数据质量控制：使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置：-q 15 -u 40 -l read_length*0.67),去除低质量和短序列；同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置：-F -t 0.4)，并过滤掉低复杂度的序列。
2.4耐药基因检测：使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征，参考序列的比对一致率高于90％的reads大于1条，则认为有该耐药基因检出。
2.5药敏表型预测：对于某一株菌的任一种抗生素的药敏预测，检测出特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。根据特征检出结果，与医院检验科得到的药敏结果相比，准确率均在0.8以上。检出结果总结于表3。以上结果说明，对实际收集的从临床标本中分离的大肠埃希菌，利用相应特征组合也有着较高的准确率、敏感度和特异性，说明本发明有较高的实用价值。
实施例3用优选的重要特征组合对公共数据库中大肠埃希菌的药敏表型进行预测
3.1综合实施例1中各特征的检出频率、阳性预测值和特征间共同检出关系，选择KPC-3、NDM-9、NDM-5基因有无作为亚胺培南的重要特征组合，选择NDM-5、NDM-9、NDM-7、KPC-2基因有无作为美罗培南的重要特征组合，选择CMY-2、CMY-42、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-27、CTX-M-15、CTX-M-65、NDM-5、NDM-1、KPC-3、SHV-12、TEM-135基因有无作为头孢噻肟的重要特征组合，选择KPC-3、CMY-2、CMY-42、NDM-1、CTX-M-55、CTX-M-1、CTX-M-15、SHV-12基因有无作为头孢他啶的重要特征。
3.2针对实施例1中下载的大肠埃希菌菌株，根据1.2得出的特征检出结果，对3.1所述优选特征进行统计。
3.3检测出优选特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如表4所示，利用优选的耐药特征预测药敏表型有着较好的准确率、灵敏度和特异性。可见，利用优选的特征组合也可以较好的预测公共数据库中下载的大肠埃希菌的药敏表型。
表4.利用优选特征组合预测公共数据库来源菌株的药敏表型的性能
实施例4用优选的重要特征组合对临床标本内的大肠埃希菌进行药敏表型预测
4.1针对实施例2中从医院收集的大肠埃希菌菌株，根据2.4得出的特征检测结果，对3.1中优选的重要特征进行统计。
4.2检测出优选特征组合中的任一种特征，则认为该菌株对该抗生素表型耐药；否则，则判断为敏感。如表5所示，利用优选的耐药特征预测药敏表型有着较好的准确率、灵敏度和特异性。可见，利用优选的特征组合也可以较好的预测从临床标本中分离的大肠埃希菌的药敏表型。
表5.利用优选特征组合预测医院收集的菌株的药敏表型的性能
实施例5用优选的重要特征组合对临床标本中的大肠埃希菌进行药敏表型预测
5.1样本采集：从某医院采集了培养结果为大肠埃希菌阳性，且进行了药敏测试的临床标本24例，包括痰液，肺泡灌洗液，腹水，引流液，血液等。
5.2样本高通量测序测序：对样本进行DNA提取、通过Qubit检测，确认DNA质量可以满足后续测序要求，对提取的DNA进行文库建库及高通量测序(Illumina Nextseq 550SE75)。
5.3测序数据指控：使用fastp(v0.19.5)软件对得到的原始fastq序列数据进行过滤(参数设置：-q 15 -u 40 -l read_length*0.67),去除低质量序列和过短序列；同时使用komplexity(v0.3.6)软件计算序列信息复杂度(参数设置：-F-t 0.4)，并过滤掉低复杂度的序列。
5.4人源序列去除：将质控过滤得到的clean序列，使用bowtie2(v2.3.4.3)软件进行与人参考基因组序列(human_38)进行比对(参数设置：--mm--very-sensitive-k 1)，以过滤掉人源序列。
5.5物种注释：使用minimap2软件(v2.17)将Illumina reads序列与以上设定的目标病原参考基因组序列库(来源于NCBI genome数据库)进行比对(比对参数：-x sr-a--secondary＝no-L))，并采用LCA算法进行物种注释统计，最后统计检出大肠埃希菌的序列数和基因组覆盖度。
5.6耐药特征检测：使用blastn(版本2.9.0+)软件将reads序列与耐药基因参考序列进行比对。对于基因有无特征，参考序列的比对一致率高于90％的reads大于1条，则认为有该耐药基因检出。
5.7药敏表型预测：用3.1所述的各抗生素的重要特征组合对临床标本中大肠埃希菌对各抗生素的药敏表型进行预测。针对某一个抗生素，有任一重要特征检出，则认为大肠埃希菌对该抗生素耐药；否则，大肠埃希菌对该药敏感。当检出的基因组覆盖度小于一定比例且没有耐药特征检出时，由于不能确定该特征是否存在(特征可能存在于未覆盖的区域)，因此无法给出预测。表6为部分临床标本统计结果：
表6.部分临床标本的检测信息
基因组覆盖度表示在宏基因组测序得到的数据中，归属于大肠埃希菌的reads比对上的参考基因组的碱基数和参考基因组全碱基数的比率。由表7可见，通过宏基因组测序方法，利用上述优选的特征组合，可预测绝大部分临床标本中的大肠埃希菌对四种抗生素的药敏表型，且准确率高，说明本发明在辅助大肠埃希菌感染的治疗中有较高的应用价值。
表7.利用特征组合预测临床标本中的大肠埃希菌的药敏表型的性能
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (4)

1.检测特征基因组合的试剂在制备用于预测大肠埃希菌对亚胺培南耐药性和敏感性的试剂盒中的用途，所述特征基因组合由KPC-2、KPC-3、NDM-5、NDM-9、NDM-7和NDM-1组成；同时对所述组合的所有特征基因进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一特征基因检测结果为阳性，推测为耐药。
2.检测特征基因组合的试剂在制备用于预测大肠埃希菌对美罗培南耐药性和敏感性的试剂盒中的用途，所述特征基因组合由KPC-2、KPC-3、NDM-5、NDM-9、NDM-7和NDM-1组成；同时对所述组合的所有特征基因进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一特征基因检测结果为阳性，推测为耐药。
3.检测特征基因组合的试剂在制备用于预测大肠埃希菌对头孢噻肟耐药性和敏感性的试剂盒中的用途，所述特征基因组合由KPC-2、KPC-3、NDM-5、CMY-2、CMY-42、CTX-M-1、CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-27、CTX-M-15、CTX-M-65、NDM-1、SHV-12、TEM-135、CMY-44、CMY-30、CTX-M-9、CTX-M-2、NDM-9、SHV-2、IMP-70、TEM-225和TEM-116组成；同时对所述组合的所有特征基因进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一特征基因检测结果为阳性，推测为耐药。
4.检测特征基因组合的试剂在制备用于预测大肠埃希菌对头孢他啶耐药性和敏感性的试剂盒中的用途，所述特征基因组合由KPC-2、KPC-3、NDM-5、CMY-2、CMY-42、NDM-1、CTX-M-55、CTX-M-1、CTX-M-15、SHV-12、CMY-44、CMY-30、NDM-7和CTX-M-2组成；同时对所述组合的所有特征基因进行检测，若检测结果均为阴性，推测为敏感；若任一特征基因检测结果为阳性，推测为耐药。
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产NDM-1肠杆菌科细菌的研究进展;尧静;杜艳;;微生物学免疫学进展(第06期);全文 *
产碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药机制研究进展;林晓伟;徐涛涛;吕火烊;;中国卫生检验杂志(第10期);全文 *
大肠埃希氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制的研究进展;张珍珍;吴俊伟;杨卫军;;中国兽药杂志(第07期);全文 *
耐碳青霉烯类大肠埃希菌临床分离情况及碳青霉烯酶基因研究;刁文晶;皇甫昱婵;朱威南;刘婧娴;刘瑛;沈立松;;诊断学理论与实践(第06期);摘要 *

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