CN105624292A - 一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测方法；本发明还提供一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：DNA抽提试剂、2对多重PCR扩增引物、2×PCR？Mix预混液、灭菌双蒸水；所述检测方法包括：痰液标本和血液标本鲍曼不动杆菌DNA提取,？根据鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测待测样本中多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感菌株；本发明建立了一套简便、快速、可行的多重耐药鲍曼不动杆菌诊断方法，可以实现短时间内（4~6小时）对多重耐药鲍曼不动杆菌检测，为临床治疗争取时间，并遏制多重耐药的发生。

Description

一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及临床痰液标本中DNA提取和多重耐药鲍曼不动杆菌快速检测方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,Ab）是不动杆菌属中最常见的一个菌种，是一种不发酵糖类、革兰染色阴性、无动力的球杆菌，普遍存在于自然界和人体。该菌在医院内分布广泛且可以长期存活，是院内感染重要的条件致病菌之一，可引起呼吸机相关性肺炎（VAP）,泌尿系统感染、菌血症、复杂的皮肤软组织感染、腹膜炎和中枢神经系统感染等。感染多见于免疫力低下的患者，特别是重症监护病房（ICU）病人。
近年来在全球范围内鲍曼不动杆菌耐药性上升显著。世界各地大量报道了多重耐药鲍曼不动杆菌（multi-drug-resistanceAcinetobacterbaumannii,MDR-Ab）和泛耐药鲍曼不动杆菌（extensivedrug-resistanceAcinetobacterbaumannii,XDR-Ab）的爆发流行。MDR-Ab是指对头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷以及β-内酰胺酶抑制剂，这五类抗生素中至少三类耐药的鲍曼不动杆菌；XDR-Ab是指对上述五类抗生素均耐药的鲍曼不动杆菌，但不包括多粘菌素和替加环素耐药；仅针对上述五类抗生素中1类或2类耐药的敏感株鲍曼不动杆菌目前临床已较少见；多/泛耐药鲍曼不动杆菌已成为卫生保健领域的重大课题和21世纪抗感染治疗领域的超级挑战。
产碳青霉烯酶（oxacillin-hydrolyzing，OXA）是鲍曼不动杆菌获得对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素酶，本质上仍属于β-内酰胺酶。根据该酶的分子结构可分为A类、B类和D类。D类酶目前报道最多，按氨基酸同源性又可分为8种，在鲍曼不动杆菌中主要是4种：OXA23、OXA24、OXA51和OXA58。OXA酶编码基因多位于细菌染色体或质粒上，由整合子或转座子介导，极易在鲍曼不动杆菌之间发生平行传播。因此鲍曼不动杆菌OXA酶表达情况具有明显的地域性，我国目前报道的鲍曼不动杆菌OXA基因主要有OXA23、OXA24和OXA51（[1]许顺姬等,不动杆菌碳青霉烯酶耐药性与OXA-51基因型研究.现代预防医学[J],2015.42(5):889-891.；[2]邓德耀等,OXA-51型β内酰胺酶的研究进展.中国感染与化疗杂志[J],2014.14(5):451-454.；[3]张伟红等,耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药表型和碳青霉烯酶基因型分析.中国感染与化疗杂志[J],2011.11(1):45-48.）。
我国由于临床长期经验性和广泛性使用广谱抗生素，造成近年来鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率显著升高，并已从单一抗生素耐药发展成为多重耐药，成为医院感染的重要病原菌之一。国内通常使用亚胺培南+β-内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗鲍曼不动杆菌感染，但目前鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药性已非常严重。对于耐亚胺培南鲍曼不动杆菌治疗则使用替加环素，该药物成本高昂且已发现鲍曼不动杆菌有耐替加环素的趋势，因此临床鲍曼不动杆菌治疗需要科学合理的选择抗生素。目前临床只能通过细菌培养和药敏实验的方法检测鲍曼不动杆菌耐药性，该方法至少需要72h，远不能适应临床治疗的要求，急需一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法（[1]李玉梅等,医院细菌分离培养及药敏试验结果分析.中国公共卫生[J],2015.31(3):383-384.；[2]张利元等,医院感染的细菌分布及药敏检测分析.中国现代医学杂志[J],2012.22(25):86-89.）。
发明内容
本发明实施提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，用于解决临床快速评估鲍曼不动杆菌耐药性，并指导临床合理使用抗生素。
本发明根据鲍曼不动杆菌OXA24（GeneBank:AJ239129.2）和OXA51（GeneBank:AJ309734.2）基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测100株鲍曼不动杆菌（其中多重耐药菌50株，敏感菌50株），经检测发现多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因；以此建立从临床痰液标本中提取基因组DNA的方法；通过多重PCR快速检测临床标本中鲍曼不动杆及其耐药性。
其中，针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
PCR产物预测长度为246bp。
针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
PCR产物预测长度为353bp。
若电泳检测结果含有246bp（OXA24）和353bp（OXA51）两个条带则确定为含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246bp（OXA24）一个条带则确定为含有敏感菌株。
本发明提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，具体包括如下步骤：
（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；
（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；
（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；
（4）对PCR结果进行电泳检测。
其中，步骤（1）中所述的引物序列如前面所述的Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）、Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）、Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）和Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）所示。
其中，步骤（2）中所述的血液标本基因组DNA抽提采用市售全血基因组DNA提取试剂盒即可。
本发明还提供了步骤（2）中所述的痰液标本DNA快速提取方法，具体步骤包括：在痰液标本中加入等体积浓度为1mol/LNaOH溶液，于60℃水浴中放置10min使痰液充分液化；然后将液化后痰液离心（6000g,10min），收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入20μL10mg/mL溶菌酶于37℃静置10min裂解细菌；再加入20μL20mg/mL蛋白酶K于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚-氯仿法抽提细菌基因组DNA。
其中，步骤（3）中所述的多重PCR检测体系包括：12.5μL的2×PCRMix预混液、各种引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10μmol/L）、痰液或血液中提取基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。
PCR扩增反应条件为：在94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min。
其中，步骤（4）中所述的电泳检测为：通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果若电泳结果含有246bp（OXA24）和353bp（OXA51）两个条带则确定为检测出含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246bp（OXA24）一个条带则确定为检测出含有敏感菌株。
本发明还提供一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：DNA抽提试剂、2对
多重PCR扩增引物、2×PCRMix预混液、灭菌双蒸水；其中所述2对多重PCR扩增引物如下：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’。
其中，鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感株菌，其中所述多重耐药鲍曼不动
杆菌均表达OXA24基因片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因。
本发明还提供一种痰液DNA提取试剂盒，包括1mol/LNaOH溶液、10mg/mL溶菌酶、20mg/mL蛋白酶K、酚-氯仿法DNA抽提试剂。
有益效果：
目前临床鉴定多重耐药鲍曼不动杆菌流程：首先从标本中分离培养鲍曼不动杆菌，再通过药敏实验鉴定多重耐药鲍曼不动杆菌。该方法耗时费力，至少需要72h才能得到结果，在临床治疗中往往不能等待药敏检测结果而直接经验性选择抗生素开始治疗。本发明确定了一个新的多重耐药鲍曼不动杆菌基因筛选方法，该方法灵敏度高，特异性强，与其他临床常见细菌无交叉。该法最低可从痰液标本中检出103个多重耐药鲍曼不动杆菌，以及从血液标本中检出105个多重耐药鲍曼不动杆菌，并且全部检测过程不超过6h。通过本发明的实施，可使临床医生在极短的时间获得鲍曼不动杆菌耐药性但并未能达到诊断目的；而可以指导医生选择合适的抗生素针对病人实际病情开展治疗，能有效避免抗生素的过度使用，减轻病人治疗费用负担，有效遏制鲍曼不动杆菌耐药性的进一步加剧。
同时，本发明还建立了一套痰液标本中基因组DNA的快速抽提方法。我国医院细菌分离鉴定标本中，痰液标本占绝大多数，数量巨大，但目前市场上尚无痰液标本基因组DNA提取试剂盒。本方法可以快速地从病人痰液标本中抽提出符合PCR实验要求的基因组DNA，整个操作可以在1h内完成，简便快速价廉，易于推广。
附图说明
图1为实施例1中多重PCR产物（大小为353bp）基因测序和BLAST比对结果。
图2为多重实施例1中PCR产物（大小为246bp）基因测序和BLAST比对结果
图3为实施例2中多重PCR法检测痰液标本结果；其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1从痰液标本中同时扩增出353bp和246bp产物，判为多重耐药鲍曼不动杆菌；泳道2从痰液标本中扩增出246bp产物，判为敏感株鲍曼不动杆菌。
图4为实施例2中多重PCR法检测血液标本结果；其中，泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1从血液标本中同时扩增出353bp和246bp产物，判为多重耐药鲍曼不动杆菌；泳道2从血液标本中扩增出246bp产物，判为敏感株鲍曼不动杆菌。
图5为本发明中实施例3的多重PCR法的特异性检测结果；其中，泳道M为DNA标准分子量标记，泳道1的模板为大肠埃希菌，泳道2的模板为金黄色葡萄球菌，泳道3的模板为铜绿假单胞菌，泳道4的模板为肺炎克雷伯菌，泳道5的模板为肺炎链球菌，泳道6的模板为多重耐药鲍曼不动杆菌，泳道7的模板为敏感株鲍曼不动杆菌，泳道8为阴性对照。
图6为本发明中实施例4中多重PCR对痰液标本多重耐药鲍曼不动杆菌的最低检出限试验结果；其中泳道M为DNA标准分子量标记，泳道1的模板为含有多重耐药鲍曼不动杆菌痰液提取的DNA，即含细菌108个/100μL菌液，泳道2的模板含细菌107个/100μL，泳道3的模板含细菌106个/100μL，泳道4的模板含细菌105个/100μL，泳道5的模板含细菌104个/100μL，泳道6的模板含细菌103个/100μL，泳道7的模板含细菌102个/100μL，泳道8为阴性对照。
图7为本发明中实施例4中多重PCR对血液标本中多重耐药鲍曼不动杆菌的最低检出限结果；泳道M为DNA标准分子量标记，泳道1的模板为含有多重耐药鲍曼不动杆菌血液中提取的DNA，即含细菌108个/100μL菌液，泳道2的模板含细菌107个/100μL菌液，泳道3的模板含细菌106个/100μL菌液，泳道4的模板含细菌105个/100μL菌液，泳道5的模板含细菌104个/100μL菌液，泳道6的模板含细菌103个/100μL菌液，泳道7的模板含细菌102个/100μL菌液，泳道8为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：多重PCR检测鲍曼不动杆菌OXA基因
随机选取鲍曼不动杆菌100株（来源于江苏大学附属医院），包括多重耐药菌50株，敏感菌50株。所有菌株的种类和耐药性均采用法国生物梅里埃公司VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及药敏仪再次鉴定，鉴定结果与所取菌株类型一致。
将鉴定后的细菌培养于血平板，待生长至单个菌落后，挑取单个菌落与200μL灭菌双蒸水混匀，煮沸10min裂解细菌，离心后上清即为细菌基因组DNA，用于后续多重PCR检测。
根据鲍曼不动杆菌OXA24（GeneBank:AJ239129.2）和OXA51（GeneBank:AJ309734.2）基因序列设计PCR引物，交由苏州泓迅生物技术公司合成。
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
PCR产物预测长度为246bp。
针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
PCR产物预测长度为353bp。
多重PCR检测的步骤包括：12.5μL的2×PCRMix预混液、两对引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10μmol/L）、鲍曼不动杆菌基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。进行PCR反应扩增，反应条件为在94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。同时将PCR产物送苏州泓迅生物技术公司测序分析。
多重PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测发现，多重耐药鲍曼不动杆菌含有246bp（OXA24）和353bp（OXA51）两个条带，而敏感菌株仅有246bp（OXA24）一个条带。
多重PCR反应353bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.5所示：
TAATGCTTTGATCGGCCTTGAGCACCATAAGGCAACCACCACAGAAGTATTTAAGTGGGATGGTAAAAAAAGGTTATTCCCAGAATGGGAAAAGGACATGACCCTAGGCGATGCCATGAAAGCTTCCGCTATTCCAGTTTATCAAGATTTAGCTCGTCGTATTGGACTTGAGCTCATGTCTAAGGAAGTGAAGCGTGTTGGTTATGGCAATGCAGATATCGGTACCCAAGTCGATAATTTTTGGCTGGTGGGTCCTTTAAAAATTACTCCTCAGCAAGAGGCACAGTTTGCTTACAAGCTAGCTAATAAAACGCTTCCATTTAGCCAAAAAGTCCAAGATGAAGTGCAATCCA
多重PCR反应246bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.6所示：
GGTTAGTTGGCCCCCTTAAAATTACACCAGTACAAGAAGTTAATTTTGCCGATGACCTTGCACATAACCGATTACCTTTTAAATTAGAAACTCAAGAAGAAGTTAAAAAAATGCTTCTAATTAAAGAAGTAAATGAGTAAGATTTATGCAAAAAGTGGATGGGGAATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGATGGTTGGGTGGAGCAAGCTAATGGAAAAAAAATCCCCTTTTCGCTCAACT
将上述测序结果进行BLAST比对，大小为353bp的PCR产物序列与鲍曼不动杆菌OXA51基因序列一致（见图1），大小为246bp的PCR产物与鲍曼不动杆菌OXA24基因序列一致（见图2）。
实施例2：痰液标本和血液标本基因组DNA提取
（1）痰液标本液化和标本中鲍曼不动杆菌DNA抽提：
将2例痰液标本（来源于临床病人）分别直接涂片于显微镜下观察痰液中白/脓细胞数量和上皮细胞数量，当白/脓细胞数量大于上皮细胞数量10倍以上者，确认为从肺深部咳出痰，用于后续实验。
在痰液中加入等体积的1mol/LNaOH溶液，在60℃中水浴10min，使粘稠痰液液化；然后将液化后痰液离心（6000g,10min），收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；在沉淀中加入10mg/mL溶菌酶20μL，置于37℃裂解10min，再加入20mg/mL蛋白酶K20μL于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用标准酚：氯仿法抽提细菌基因组DNA。NaOH可以水解痰液中蛋白质，降低痰液稠度，有利于后续基因组DNA的抽提。经过反复实验发现，终浓度为0.5mol/LNaOH溶液，在60℃中水浴10min，既可以使用痰液液化，又不破坏细菌，可以获得较好基因组DNA纯化得率。
（2）血液标本中鲍曼不动杆菌DNA抽提：
吸取2例新鲜抗凝血（来源于临床病人）200μL分别加入20mg/mL蛋白酶K20μL于60℃消化10min后，使用全血基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，AU1801）提取总DNA。
（3）多重PCR法检测血液和痰液标本中多重耐药鲍曼不动杆菌：
PCR反应总体系为25μL；在PCR反应管中依次加入12.5μL的2×PCRMix预混液、2对引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10nmol/L）、痰液或血液基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL，同时设阴性对照（双蒸水为模板）。
所述的两对引物分别为：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
多重PCR反应参数为：94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。
PCR反应产物经1%琼脂糖电泳分析结果，各孔上样量为5μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳40min。电泳完毕后以0.5mg/L溴化乙锭染色10min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。本实施例结果可见，检测样本于246bp和353bp处同时出现条带判为多重耐药鲍曼不动杆菌，检测样本于246bp处出现条带判为敏感株鲍曼不动杆菌，阴性对照无条带（见图3和图4），在本实施例中，所检测的痰液和血液样本中分别含有多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感株鲍曼不动杆菌。
实施例3：多重PCR法的特异性检测
提取大肠埃希菌（EscherichiacoiL，美国模式菌种保藏中心，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，美国模式菌种保藏中心，ATCC25923）、铜绿假单胞菌（Psudomonasaeruginosa，美国模式菌种保藏中心，ATCC27853）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，美国模式菌种保藏中心，ATCC700603）、肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae，美国模式菌种保藏中心，ATCC496）、多重耐药鲍曼不动杆菌（来源于江苏大学附属医院）和敏感株鲍曼不动杆菌（来源于江苏大学附属医院）基因组DNA。上述细菌的纯培养物用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司，DP302）提取其基因组DNA，提取的DNA直接用于多重PCR扩增。
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因和OXA51基因引物序列为实施例1中所述的Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）、Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）、Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）、
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）。
PCR反应总体系为25μL，在PCR反应管中依次加入12.5μL的2×PCRMix预混液、2对引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10nmol/L）、细菌基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。同时设多重耐药鲍曼不动杆菌对照和敏感株鲍曼不动杆菌对照，以及阴性对照（双蒸水为模板）。
多重PCR反应参数为：94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。
PCR反应产物经1%琼脂糖电泳分析结果，各孔上样量为5μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳40min。电泳完毕后以0.5mg/L溴化乙锭染色10min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。结果如图5所示，图中可见，使用本发明中针对鲍曼不动杆菌OXA24基因和OXA51基因的PCR引物扩增，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌基因组DNA，均无扩增条带。多重耐药鲍曼不动杆菌基因组DNA扩增后于246bp和353bp处出现2个条带，敏感株鲍曼不动杆菌基因组DNA扩增后于246bp处出现1个条带。说明本发明的引物的特异性非常好，能很好的对鲍曼不动杆菌进行特异性的检测。
实施例4：多重PCR法的检测敏感度
（1）多重PCR检测痰液标本中多重耐药鲍曼不动杆菌敏感度：
在液体LB培养基中扩增多重耐药鲍曼不动杆菌（来源于江苏大学附属医院），置于37℃下振摇增菌至OD600=1（此时细菌浓度为1×109/mL，即每100μL菌液含有细菌108个）。将上述菌液以倍比稀释的方法制备成一系列浓度菌量标本（每100μL菌液分别含有细菌108~101个），分别将不同数量菌液加入正常痰液标本（来源于健康自愿者）并混合，再加入等体积的1mol/LNaOH溶液，在60℃中水浴10min，使粘稠痰液液化。吸取液化后痰液，加入10mg/mL溶菌酶20μL，置于37℃裂解10min，再加入20mg/mL蛋白酶K20μL于60℃消化20min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用标准酚：氯仿法抽提细菌基因组DNA，提取出的DNA用于多重PCR检测。
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因和OXA51基因引物序列为实施例1中所述的Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）、Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）、Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）、
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）。
PCR反应总体系为25μL。在PCR反应管中依次加入12.5μL的2×PCRMix预混液、2对引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10nmol/L）、细菌基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。
多重PCR反应参数为：94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s,，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。
PCR反应产物经1%琼脂糖电泳分析结果，各孔上样量为5μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳40min。电泳完毕后以0.5mg/L溴化乙锭染色10min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。阴性对照无条带，多重耐药鲍曼不动杆菌于353bp和246bp处同时出现条带（见图6）。当痰液标本中含有大于103个多重耐药鲍曼不动杆菌时，采用本方法即可以检出。
（2）多重PCR检测血液标本多重耐药鲍曼不动杆菌敏感度：
在液体LB培养基中扩增多重耐药鲍曼不动杆菌，置于37℃下振摇增菌至OD600=1（此时细菌浓度为1×109/mL，即每100μL菌液含有细菌108个）。将上述菌液以倍比稀释的方法制备成一系列浓度菌量标本（每100μL菌液含有细菌108~101个），分别将不同浓度菌液加入正常抗凝血液（来源于健康自愿者）并混合，各个标本中加入20mg/mL蛋白酶K20μL于60℃消化10min后，使用全血基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，AU1801）提取基因组DNA，抽提的DNA用于多重PCR检测。
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因和OXA51基因引物序列为实施例1中所述的Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）、Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）、Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）、
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）。
PCR反应总体系为25μL。在PCR反应管中依次加入12.5μL的2×PCRMix预混液、2对引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10nmol/L）、细菌基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。
多重PCR反应参数为：94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s,，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。
PCR反应产物经1%琼脂糖电泳分析结果，各孔上样量为5μL，在0.5×TAE电泳缓冲液中，90V恒压电泳40min。电泳完毕后以0.5mg/L溴化乙锭（EB）染色10min，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。阴性对照无条带，多重耐药鲍曼不动杆菌于246bp和353bp处同时出现条带（见图7）。当血液标本中含有大于105个多重耐药鲍曼不动杆菌时，采用本方法即可以检出。
SEQUENCELISTING
<110>江苏大学
<120>一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法
<130>一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ggttagttggcccccttaaa20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
taatgctttgatcggccttg20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tggattgcacttcatcttgg20
<210>5
<211>353
<212>DNA
<213>鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）
<400>5
taatgctttgatcggccttgagcaccataaggcaaccaccacagaagtatttaagtggga60
tggtaaaaaaaggttattcccagaatgggaaaaggacatgaccctaggcgatgccatgaa120
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ttggctggtgggtcctttaaaaattactcctcagcaagaggcacagtttgcttacaagct300
agctaataaaacgcttccatttagccaaaaagtccaagatgaagtgcaatcca353
<210>6
<211>246
<212>DNA
<213>鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）
<400>6
ggttagttggcccccttaaaattacaccagtacaagaagttaattttgccgatgaccttg60
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caggtaggttggttgatggttgggtggagcaagctaatggaaaaaaaatccccttttcgc240
tcaact246

Claims (10)

1.一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；
（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；
（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；
（4）对PCR结果进行电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌为多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感株菌，其中所述多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因。
3.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的多重PCR扩增引物序列如下所示：
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
PCR产物预测长度为246bp；
针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
PCR产物预测长度为353bp。
4.权利要求1步骤（2）中所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，具体步骤包括：在痰液标本中加入等体积NaOH溶液，于水浴中放置使痰液充分液化；然后将液化后痰液离心，收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入溶菌酶于37℃静置10min裂解细菌；再加入蛋白酶K于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚：氯仿法抽提细菌基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，所述NaOH溶液浓度为1mol/L；所述水浴条件为60℃水浴10min；所述溶菌酶浓度为10mg/mL；所述蛋白酶K浓度为20mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的多重PCR扩增体系包括：12.5μL的2×PCRMix预混液、各种引物上下游各0.2μL（引物浓度均为10μmol/L）、痰液或血液中提取基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。
7.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的多重PCR扩增反应条件为：在94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s，在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min。
8.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述的电泳检测为：通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果，若电泳结果含有246bp（OXA24）和353bp（OXA51）两个条带则确定为检测出含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246bp（OXA24）一个条带则确定为检测出含有敏感菌株。
9.一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA抽提试剂、2对多重PCR扩增引物、2×PCRMix预混液、灭菌双蒸水；其中所述2对多重PCR扩增引物如下：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’。
10.一种痰液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1mol/LNaOH溶液、10mg/mL溶菌酶、20mg/mL蛋白酶K、酚-氯仿法DNA抽提试剂。
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