RU2816522C1 - СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ ИЗ ГРУППЫ aadA У БАКТЕРИЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» - Google Patents
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ ИЗ ГРУППЫ aadA У БАКТЕРИЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816522C1 RU2816522C1 RU2023118181A RU2023118181A RU2816522C1 RU 2816522 C1 RU2816522 C1 RU 2816522C1 RU 2023118181 A RU2023118181 A RU 2023118181A RU 2023118181 A RU2023118181 A RU 2023118181A RU 2816522 C1 RU2816522 C1 RU 2816522C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aada
- detection
- aminoglycosides
- group
- genes
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 241000607128 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis Species 0.000 description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100377748 Campylobacter jejuni aadK gene Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 241000607361 Salmonella enterica subsp. enterica Species 0.000 description 2
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- 108010016299 6'-aminoglycoside acetyltransferase-2''-aminoglycoside phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100214700 Acinetobacter baumannii aacC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000943303 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101100214703 Salmonella sp aacC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101150100833 aacC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229940037649 staphylococcus haemolyticus Drugs 0.000 description 1
- 101150054264 strA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ обнаружения генов устойчивости к аминогликозидам из группы aadA у бактерий животного происхождения методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», включающий проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора оригинальных олигонуклеотидов SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3. Техническим результатом заявленного изобретения является возможность идентификации генов резистентности группы aadA к аминогликозидам из образцов биологического материала животных и объектов их содержания, продовольственного сырья, пищевых продуктов, без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистых бактериальных культур с высокой специфичностью и чувствительностью. 1 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано как способ идентификации и детекции генов генов устойчивости к аминогликозидам из группы aadA методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Аминогликозиды (АГ), относятся к старейшим классам противомикробных препаратов. АГ представляют собой бактерицидные противомикробные препараты, действие которых основано на нарушении синтеза бактериального белка за счет связывания с 30S субъединицей рибосомы. АГ должны проникнуть в бактерию, чтобы оказать свое действие, и их поглощение бактериальной клеткой является кислородозависимым процессом. Поэтому спектр активности АГ ограничивается аэробными и факультативно-анаэробными бактериями в аэробных условиях. Спектр активности АГ включает грамотрицательные бактерии, стафилококки, микобактерии, лептоспиры и некоторые простейшие. Они малоэффективны в отношении стрептококков, анаэробных бактерий и внутриклеточных бактерий. Энтерококки и стрептококки обычно проявляют определенную степень внутренней устойчивости к АГ из-за непроницаемости их клеточной стенки, хотя проникновение в бактериальную клетку может быть усилено другими противомикробными препаратами, которые ингибируют синтез клеточной стенки, такими как β-лактамные антибиотики. Поэтому АГ часто применяют в сочетании с β-лактамами. Эта комбинация также расширяет спектр действия [1].
В ветеринарии АГ используются для лечения инфекций у всех основных видов сельскохозяйственных животных и домашних животных. Всемирная организация по охране здоровья животных классифицирует их как критически важные для ветеринарии противомикробные препараты (VCIA) на основании широкого спектра и характера болезней, для лечения которых они используются у животных. АГ имеют важное значение при септицемии, болезнях пищеварительной, дыхательной и мочевыделительной систем [2].
Существуют различные методы идентификации и детекции генетических детерминант резистентности к АГ, основная часть которых основана на применении различных методов: полимеразно-цепная реакция и реакция на чипах. Однако использование таких способов, предусматривает идентификацию генов резистентности к аминогликозидам, актуальным в медицине RU 2409680 C1, RU 127074 U1, RU 2015151395 A.
Наиболее близкое по существу к изобретению является CN 101392287 (A), раскрывающий технологию обнаружения генов лекарственной устойчивости у бактерий животного происхождения к аминогликозидам (aphA3, aacC4, aadA и aacC2) методом четырехкратной ПЦР с применением электрофоретической детекции результатов амплификации. Предлагаемое изобретение предусматривает детекцию генов резистентности к аминогликозидам группы aadA в режиме «реального времени», что значительно сокращает сроки исследования.
Целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения генов резистентности группы aadA к аминогликозидам у бактерий животного происхождения методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».
Заявленный технический результат - идентификация генов резистентности группы aadA к аминогликозидам из образцов биологического материала животных и объектов их содержания, продовольственного сырья, пищевых продуктов, без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистых бактериальных культур с высокой специфичностью и чувствительностью. Достигается разработкой методики выделения ДНК и использованием оригинального набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления генов группы aadA: aadA1_2, aadA1_3, aadA1b_1, aadA1_4, aadA1_5, aadA2_1, aadA2_2, aadA2b_1, aadA3_1, aadA8b_1, aadA8b_2, aadA12_1, aadA15_1, aadA17_1, aadA21_1, aadA22_1, aadA23_1, aadA24_1, aadA25 (всего 19 генов) устойчивости к аминогликозидам при проведении полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Аналитическая чувствительность методики идентификации и детекции генов группы aadA составляет 2,5х104 копий/мл. Специфичность способа идентификации и детекции генов группы aadA при исследовании образцов биологического материала животных и объектов их содержания, продовольственного сырья, пищевых продуктов, без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистых бактериальных культур в рамках контрольной панели составляет 100%.
Для выбора мишени с целью выявления генов резистентности к аминогликозидам были проанализированы данные из базы Pathogen Detection (NCBI) [3], которая находится в открытом доступе и содержит информацию исследователей из разных стран об изолятах, выделенных из различных источников: из клинических образцов, пищевых продуктов, от животных, из окружающей среды и их характеристики (геномные последовательности, наличие генов резистентности и др.). Частота обнаружения генов резистентности к аминогликозидам aadA1 составила 23%, aadA2 - 14% от общего количества исследований ветеринарных образцов.
Для выбора и анализа ДНК последовательностей генов резистентности были использованы базы данных ResFinder, Arg-ANNOT, CARD и NCBI BARRGD, а также последовательности геномов различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые были ранее получены в ФГБУ «ВГНКИ» методом полногеномного секвенирования. Подбор праймеров производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT), анализировалось не менее пяти наборов олигонуклеотидов для выявления каждого целевого гена. Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу Ugene и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Критерии для выбора праймеров были следующие: средняя длина - 16-25 нуклеотидов; GC состав 35-60%; температура отжига от 50 °C до 72 °C, разница в температуре отжига в паре праймеров не должна превышать 6 °C; вторичная структура (образование шпилек): по минимуму; димеры: нежелательны, необходимо избегать само- и взаимокомплементарности между 3’-концами; минимум G/C на 3’-конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов). Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенном на сайте NCBI. Выбранные в качестве мишени гены группы aadA кодируют ферменты О-аденилтрансферазы (ANT), модифицирующие аминогликозиды путем присоединения нуклеотида аденина. Модифицированные молекулы теряют способность связываться с рибосомами и подавлять синтез белка бактерий.
Сущность изобретения заключается в том, что при проведении полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации и детекции группы генов устойчивости к аминогликозидам. Выбранные нуклеотиды имеют следующую структуру (таблица 1):
Таблица 1
Характеристики праймеров и зонда для детекции генов группы aadA
| Наименование | Последовательность, 5’-3’ | Длина праймера, п.н. | Tm, °C |
GC% | Длина ампликона, п.н. |
| aadA-F | GGCGATGAGCGAAATGTAGT | 19 | 61.7 | 47.4 | 139 |
| aadA-Z | ROX-AATCGCGCCGAAGGATGTCG-BHQ2 | 20 | 67.1 | 57.1 | |
| aadA-R | CTTCAAGTAWGACGGGCTGATA | 22 | 61.7 | 45.5 |
Оптимизированы условия амплификации: концентрации прамеров и зонда, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.
Материалом для исследования служат образцы биологического материала, полученные из продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистые бактериальные культуры.
Отбор проб, выделение, идентификация бактерий и получение чистой бульонной культуры изолятов проводят по стандартным методикам в соответствии с утверждёнными нормативными документами. Отбор проб смывов с тушек, клеток, стен, оборудования и др. проводят с использованием велюр-тампонов eSwab-system. Фекалии и образцы подстилки собирают в пластиковые контейнеры для сбора биоматериала с завинчивающейся крышкой.
Для подготовки анализируемой пробы бактериального изолята отбирают дозатором 1,0 см3 жидкой бульонной культуры бактерий в предварительно промаркированную одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3. Центрифугируют на микроцентрифуге в течение 5 мин при 8000 об/мин. Затем удаляют надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 1,0 см3 той же бульонной культуры и центрифугируют в течение 5 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Полученный осадок анализируемой пробы в закрытых промаркированных пробирках передают на выделение ДНК.
Для подготовки анализируемой пробы смывов с тушек, клеток, стен, оборудования и др. велюр-тампон eSwab-системы с биоматериалом помещают в одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3 с изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия (600 мм3). Тщательно перемешивают на вортексе. Для выделения ДНК используют 100 мм3 полученного раствора.
Анализируемые пробы фекалий или пробы подстилки, отобранные в пластиковые контейнеры, готовят в виде суспензии в стерильном изотоническом 0,9% растворе хлорида натрия. В промаркированную одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3 шпателем помещают пробу фекалий или подстилки до нижней риски, затем вносят 600 мм3 раствора натрия хлорида. Тщательно перемешивают встряхиванием. Суспензию центрифугируют при 400g в течение 2 мин. Для выделения ДНК используют 100 мм3 верхней фракции суспензии, отобранной при помощи дозатора с наконечником с фильтром.
Выделение ДНК из анализируемой пробы, осуществляют с помощью набора реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ) или «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen), или «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen) или или «PureLink Microbiome DNA Purification Kit» (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве отрицательного контроля выделения (Kв) используют 100 мм3 воды деионизованной.
Для приготовления мастермикса «ПЦР-смесь-1» в отдельных пробирках смешивают из расчета на одну реакцию следующие реагенты: растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации (6 пмоль специфических праймеров aadA-F и aadA-F, 3 пмоль специфического зонда aadA-Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3, деионизованная вода).
Смесь с полимеразой для выявления целевого гена готовили в отдельной пробирке (из расчета на каждую реакцию с учетом контролей выделения и ПЦР), вносят по 10 мм3 «ПЦР-смеси-1», 0,5 мм3 ДНК-полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера с магнием. Затем вносят по 15 мм3 приготовленной смеси с полимеразой в тонкостенные пробирки и по 10 мм3 исследуемых или контрольных проб. Запускают на амплификаторе для проведения ПЦР в режиме «реального времени» RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) соответствующую программу термоциклирования: удержание - 15 мин при 95°С, циклирование 15 с при 95°С, 45 с при 62°С (40 циклов, детекция на втором этапе, канал Orange).
Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом должны быть установлены следующие настройки: в меню основного окна «Количественный анализ» должны быть активированы кнопки «Динамич. Фон» и «Коррек. Уклона», установлено значение «Порог Фона», равное 10%, выбрана линейная шкала графического изображения результатов, выставлен «Threshold/Порог», равный 0,05.
Результаты ПЦР исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для положительных - ПЦР, K+ ≤ 27 и отрицательных контролей амплификации - «нет значений» и отрицательного контроля выделения ДНК - «нет значений». При идентификации мишени результаты интерпретируются в качественном формате на основании наличия значения Ct. В образце обнаружен ген устойчивости к аминогликозидам из группы aadA, если в таблице результатов по каналу Orange определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 33.
Пример 1. Проверка специфичности способа выявления генов группы aadA
Для подтверждения специфичности способа готовят контрольную панель, содержащую ДНК, выделенную из различных чистых бактериальных культур. В качестве контрольных используют изоляты, которые охарактеризованы полногеномно, с указанием на присутствие или отсутствие фрагмента гена aadA, а также отсутствие или присутствие других генов устойчивости к аминогликозидам, результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты амплификации фрагмента генов группы aadA, выделенных из чистых культур микроорганизмов контрольной панели
| № пп |
Ожидаемый результат амплификации фрагментов генов | Полученный результат амплификации фрагмента гена |
Наименование образца | |
| Повтор 1 | Повтор 2 | |||
| 1 | - | - | - | Salmonella enterica subsp. enterica, чувствительный к аминогликозидам |
| 2 | - | - | - | Salmonella enterica subsp. enterica, резистентный к аминогликозидам, без генов резистентности |
| 3 | aadA | aadA | aadA | Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis, резистентный к аминогликозидам, с геном aadA1 |
| 4 | aadA | aadA | aadA | Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA2 и strA/B |
| 5 | aadA | aadA | aadA | Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA1 и strA/B |
| 6 | aadA | aadA | aadA | Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA1 и aac(3) |
| 7 | - | - | - | E.coli ATCC 25922, чувствительный к аминогликозидам |
| 8 | aadA | aadA | aadA | E.coli, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA1 и strA/B |
| 9 | aadA | aadA | aadA | E.coli, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA1, aadA2, aac(3) |
| 10 | aadA | aadA | aadA | E.coli, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA1, aadA2, aph(3) |
| 11 | aadA | aadA | aadA | E.coli, резистентный к аминогликозидам, с генами aadA2, aadA22, aac(3) |
| 12 | - | - | - | E.coli, резистентный к аминогликозидам, с геном strA/B |
| 13 | - | - | - | Enterococcus faecalis ATCC 29212, чувствительный к аминогликозидам |
| 14 | - | - | - | Enterococcus faecalis, резистентный к аминогликозидам, с генами ant(6), aph(3) |
| 15 | - | - | - | Enterococcus faecalis, резистентный к аминогликозидам, с генами ant(6), aac(6)/aph(2) |
| 16 | Enterococcus faecalis, резистентный к аминогликозидам, с генами aph(3) | |||
| 17 | - | - | - | Campylobacter jejuni ATCC 33560, чувствительный к аминогликозидам |
| 18 | - | - | - | Campylobacter coli, чувствительный к аминогликозидам |
| 19 | - | - | - | Staphylococcus aureus, чувствительный к аминогликозидам |
| 20 | - | - | - | Staphylococcus haemolyticus, чувствительный к аминогликозидам |
| 21 | - | - | - | S.aureus, резистентный к аминогликозидам, с геном aadD |
| 22 | - | - | - | S.haemolyticus, резистентный к аминогликозидам, с геном aadD |
| 23 | - | - | - | S.aureus, резистентный к аминогликозидам, с геном ant(9)-Ia |
| 24 | - | - | - | S.aureus, резистентный к аминогликозидам, с генами ant(9)-Ia и aac(6')-aph(2'') |
| 25 | - | - | - | L.monocytogenes, чувствительный к аминогликозидам |
| 26 | - | - | - | L.monocytogenes, резистентный к аминогликозидам, без генов резистентности |
В рамках предложенной панели система детекции генов резистентности показала 100% специфичность: наблюдается амплификация только фрагмента генов группы aadA. Предлагаемый способ полностью удовлетворяют критерию специфичности.
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности способа выявления генов группы aadA
Для определения аналитической чувствительности ПЦР используют положительный контрольный образец (ПКО), представляющий собой растворы плазмидной ДНК c известной концентрацией, содержащей соответствующие клонированные фрагменты генов группы aadA. Готовят серии десятикратных разведений плазмидной ДНК в ТЕ буфере. Структуру положительного контрольного образца подтверждают методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняют методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye v. 1.1 («Applied Biosystems»,USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводяти на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.
Для каждой серии разведений проводят ПЦР в двух повторах. За аналитическую чувствительность принимают наименьшую концентрацию раствора плазмидной ДНК, которая воспроизводимо дает продукт в двух повторах ПЦР. Начальная концентрация серии для генов группы aadA составляла ~5×106 копий в ПЦР (при внесении 10 мкл раствора ДНК на реакцию объёмом 25 мкл). Результаты амплификации фрагмента генов группы aadA представлены на Фиг.1 Определение чувствительности ПЦР для детекции фрагмента генов группы aadA.
Литературные источники
1. Dowling P.M. Aminoglycosides. In: Giguère S, Prescott JF, Baggot JF et al., eds. Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine. Ames, IA, USA: Blackwell Publishing, 2006: 207-29.
2. OIE 2021. OIE List of Antimicrobials of Veterinary Importance
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Способ обнаружения генов устойчивости к амногликозидам из
группы aadA у бактерий животного происхождения методом ПЦР с
детекцией в режиме реального времени.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-09-01">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023118181</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-11</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2023118181</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>202311881</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-11</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="en">Федеральное государственное
бюджетное учреждение "Всероссийский государственный центр
качества и стандартизации лекарственных средств для животных и
кормов" ФГБУ "ВГНКИ", Federal state budgetary
institution "The russian state center for animal feed and drug
standardization and quality"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGBU "VGNKI"</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Прасолова Ольга
Владимировна</InventorName>
<InventorNameLatin>Prasolova Olga Vladimirovna</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ обнаружения генов
устойчивости к аминогликозидам из группы aadA у бактерий животного
происхождения методом ПЦР с детекцией в режиме "реального
времени"</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>unidentified</NonEnglishQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcgatgagcgaaatgtagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttcaagtawgacgggctgata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatcgcgccgaaggatgtcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ обнаружения генов устойчивости к аминогликозидам из группы aadA у бактерий животного происхождения методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», включающий подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора оригинальных олигонуклеотидов SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, и реакционной смеси 10 мм3 «ПЦР-смеси-1», включающей растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации, а именно 6 пмоль специфических праймеров aadA-F и aadA-F, 3 пмоль специфического зонда aadA-Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3, деионизованная вода, и добавлением 0,5 мм3 ДНК-полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера с магнием и 10 мм3 ДНК матрицы, при этом амплификация проводится по следующей программе: удержание - 15 мин при 95°С, циклирование - 15 с при 95°С и 45 с при 62°С - 40 циклов, детекция на втором этапе, канал Orange; результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и устанавливают наличие в образце гена устойчивости к аминогликозидам из группы aadA при Ct≤33.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816522C1 true RU2816522C1 (ru) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101392287A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-03-25 | 四川大学 | 一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重pcr检测技术 |
| RU2409680C1 (ru) * | 2009-07-20 | 2011-01-20 | Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулёзом Департамента здравоохранения города Москвы | Способ диагностики чувствительности штаммов mycobacterium tuberculosis к аминогликозидам |
| CN104212899A (zh) * | 2014-09-05 | 2014-12-17 | 郑秋月 | 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101392287A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-03-25 | 四川大学 | 一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重pcr检测技术 |
| RU2409680C1 (ru) * | 2009-07-20 | 2011-01-20 | Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулёзом Департамента здравоохранения города Москвы | Способ диагностики чувствительности штаммов mycobacterium tuberculosis к аминогликозидам |
| CN104212899A (zh) * | 2014-09-05 | 2014-12-17 | 郑秋月 | 用于检测大肠杆菌四种常见耐药基因的组合物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Stern A.L., Van der Verren S.E., Kanchugal P.S., Näsvall J., Gutiérrez-de-Terán H., Selmer M. Structural mechanism of AadA, a dual-specificity aminoglycoside adenylyltransferase from Salmonella enterica. J Biol Chem. 2018 Jul. 20; 293(29): 11481-11490. doi: 10.1074/jbc.RA118.003989. Epub 2018 Jun. 5. PMID: 29871922; PMCID: PMC6065190. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101215194B1 (ko) | Ｔ-세포 수용체 ｖ/ｄ/ｊ 유전자 내의 반복 서열에 의한클론 세포의 확인 방법 | |
| KR101409193B1 (ko) | 알 알엔에이를 표적으로 한 미생물의 정량적 해석방법 | |
| CN102146466B (zh) | 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法 | |
| Mirnejad et al. | Simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus and Brucella melitensis by combinatorial PCR | |
| JP5768282B2 (ja) | ｒＲＮＡ前駆体のレシオメトリック分析 | |
| CN102154487A (zh) | 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法 | |
| RU2816522C1 (ru) | СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ ИЗ ГРУППЫ aadA У БАКТЕРИЙ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» | |
| CN114041188A (zh) | 用于检测粪便样品中的幽门螺杆菌水平的方法 | |
| Ahmadi et al. | Molecular detection of Campylobacter species: comparision of 16SrRNA with slyD, cadF, rpoA, and dnaJ sequencing | |
| CN104032000B (zh) | 一种蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| RU2636458C1 (ru) | Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий | |
| El-Baaboua et al. | Comparison, validation, and optimization of internal genomic DNA extraction protocol for Campylobacter species. | |
| Rivelli Zea et al. | Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification for the Detection of Prototheca bovis Directly from Milk Samples of Dairy Cattle | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2726432C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2794156C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ" | |
| CN114196767B (zh) | 特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌st型的方法 | |
| RU2732923C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника | |
| Xiang et al. | Multiplex PCR for detection of MCR genes in clinical fecal samples | |
| Kounnoun et al. | COMPARISON, VALIDATION, AND OPTIMIZATION OF INTERNAL GENOMIC DNA EXTRACTION PROTOCOL FOR CAMPYLOBACTER SPECIES | |
| RU2730658C1 (ru) | Набор для выявления патогенных микроорганизмов вида Listeria monocytogenes и способ их выявления в пробах биоматериала, в пробах кормов, в объектах внешней среды | |
| Jakipov et al. | Genetic identification of the causative agent of brucellosis. | |
| CN108754003B (zh) | 基于颤杆菌预测艾滋病人haart治疗效果的引物 | |
| JP2021193981A (ja) | サンプルの品質の予測方法、核酸配列解析の精度の予測方法、サンプルの品質の予測装置、および核酸配列解析の精度の予測装置 |