RU2814548C1 - Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents
Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814548C1 RU2814548C1 RU2023115232A RU2023115232A RU2814548C1 RU 2814548 C1 RU2814548 C1 RU 2814548C1 RU 2023115232 A RU2023115232 A RU 2023115232A RU 2023115232 A RU2023115232 A RU 2023115232A RU 2814548 C1 RU2814548 C1 RU 2814548C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- causative agent
- dna
- mannheimia haemolytica
- control sample
- genome
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 title claims abstract description 28
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title claims abstract description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 21
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241001293415 Mannheimia Species 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- -1 blood serum Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101001017362 Enterobacteria phage T4 Holin Proteins 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- 241000828071 Mannheimia haemolytica USDA-ARS-USMARC-183 Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Описана тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тест-система включает буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
взятых в объемном соотношении 1:1. При этом для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:
а для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange. Изобретение расширяет функциональные возможности и повышает точность при выявлении возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica). 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.
Известно выявление ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannhcimia haemolytica) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции, которую осуществляли в реакционной смеси следующего состава: 3 мкл кДНК, по 10 пмоль праймеров, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 10х буфера для Taq-полимеразы и деионизированная вода до объема 25 мкл. (М.А. Шибаев Разработка метода выявления mannheimia haemolytica с помощью полимеразпой цепной реакции и нуклеотидного секвеиирования (Журнал Ветеринарная патология. №4. 2007, стр. 95-99, https://vetpat.ru/wp-content/uploads/2014/03/vet_patologija_04_07.pdf).
Однако известное техническое решение недостаточно точное из-за использования метода электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2726242, кл. C12Q 1/68, 2020 г., включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидиой последовательностью:
- прямой праймер
- обратный праймер - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1.
Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале (кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов, смывах с поверхностей методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica).
Технический результат достигается тем, что в тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающее буфер для проведения полимеразной ценной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
- прямой праймер
- обратный праймер - зонд, взятых в
объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:
, при этом для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.
Новизна заявляемой тест-системы для состоит в идентификации ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Такая постановка HI IP в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемая тест-система рекомендована для использования в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Тест система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени реализуют следующим образом.
Предварительно выделяют ДНК из биологического материала животного сорбционным методом. В качестве биологического материала по выбору может быть использованы: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и корма, а также культуры микроорганизмов, смывы с поверхностей.
Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange и для внутреннего контрольного образца бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл - FAM/Grcen. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) и бактериофага Т4 со следующими нуклеотидными последовательностями:
- праймер прямой
праймер обратный
- зонд
- Праймер прямой
- Праймер обратный
- зонд.
Затем измеряют накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Для повышения точности идентификации возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) для внутреннего контрольного образца используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комилементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные для генома Mannheimia haemolytica, были отобраны на основе нуклеотидной последовательности гена супероксиддис-мутаза (SOD, superoxide dismutase, CDS 765102..765743, product='superoxide dismutase", CP004752 2657957 bp DNA circular BCT 24-APR-2020 DEFINI-TION Mannheimia haemolytica USDA-ARS-USMARC-183 chromosome, complete genome).
Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Mh-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Mh-F и Mh-R). На 5'-конце олигонуклеотидного зонда помещен флуоресцентный краситель Карбокси-Х-родамин (ROX).
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный зонд Т4-Р, помеченный флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеин (FAM).
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР в качестве праймеров и зонда. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах других представителей кокцидий из группы простейших, а также в геномах любых видов животных и человека.
Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ)
Пример включает следующие этапы:
1. Отбор материала для исследования
Для исследования используют следующий материал:
• Мазки и соскобы слизистых оболочек носа. Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;
• Фрагменты паренхиматозных органов (фрагменты печени, легких, селезенки, а также миндалины, лимфоузлы и др.). Отбирают в стерильный контейнер.
• Цельная кровь. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.
• Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду.
• Отбор исследуемых образцов кормов/сырья проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп сырья, пищевых продуктов и кормов.
2. Подготовка исследуемого материала
Мазки и соскобы со слизистых конъюнктивы в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.
Пробы тканей и органов, а также пробы продуктов животного происхождения гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем обычно готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об/мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции ПК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения нуклеиновой кислоты (ПК).
Молоко в объеме до 10 мл обеззараживают и центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.
От кормов/сырья плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированные или консервированные корма/сырье перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния. Отбирают лабораторные пробы (20-40 мг) в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл и направляют на выделение НК. 3. Проведение анализа Исследование проводили с помощью набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica). Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (Таблица 1, комплект №1) и комплекта контрольных образцов (Таблица 2, комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы) 2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале и кормах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.
Исследование с помощью набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» состоит из трех циклов:
• экстракция ДНК;
• проведение ПЦР РВ;
• учет результатов анализа.
4. Экстракция (выделение) НК из клинического материала
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО Т2.
Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения ДНК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).
Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения ДНК. Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.
5. Подготовка образцов к проведению ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием НКО MANNHEIMIA, ВКО Т2 и ДНК буфера.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета па каждую реакцию ПЦР:
• 5 мкл ПЦР СМЕСЬ MANNHEIMIA
• 10 мкл ПЦР БУФЕР MANNHEIMIA
• 0,5 мкл I AQ POLYMERASE
Перемешивают смесь па вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной но п. 7.1 (включая пробу ВК-);
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО MANNHEIMIA.
6. Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки прибора «Rotor-Genc Q». Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» указаны таблице 3.
7. Интерпретация результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 к Инструкции.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале ROX/Orange Mannheimia haemolytica) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом но каналу ROX/Orange отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или па ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.
Образец считается положительным (ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл.4). Если для исследуемого образца по каналу ROX/Orange значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале ROX/Orange более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct па канале ROX/Orange менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.
Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica), отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4).
Claims (9)
- Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага 14 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
- - прямой праймер
- - обратный праймер
- - зонд,
- взятых в объемном соотношении 1:1, отличающаяся тем, что для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:
-
-
-
- при этом для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814548C1 true RU2814548C1 (ru) | 2024-03-01 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430967C2 (ru) * | 2001-10-26 | 2011-10-10 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика С.А. Де С.В. | Способ обнаружения бактерий pasteurella trehalosi и/или mannheimia haemolytica у домашней птицы (варианты) |
| RU2014104931A (ru) * | 2014-02-11 | 2015-08-20 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) | СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ И ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИИ Mannheimia haemolytica С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ |
| US11365238B2 (en) * | 2015-12-07 | 2022-06-21 | Camas Incorporated | Sequencing chicken antibody repertoires following hyperimmunization and the identification of antigen-specific monoclonal antibodies |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2430967C2 (ru) * | 2001-10-26 | 2011-10-10 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика С.А. Де С.В. | Способ обнаружения бактерий pasteurella trehalosi и/или mannheimia haemolytica у домашней птицы (варианты) |
| RU2456343C2 (ru) * | 2001-10-26 | 2012-07-20 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика С.А. Де С.В. | Новые бактерии, вызывающие заболевания домашней птицы, и полученная из них вакцина |
| RU2014104931A (ru) * | 2014-02-11 | 2015-08-20 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) | СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ И ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИИ Mannheimia haemolytica С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ |
| US11365238B2 (en) * | 2015-12-07 | 2022-06-21 | Camas Incorporated | Sequencing chicken antibody repertoires following hyperimmunization and the identification of antigen-specific monoclonal antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| EP1633884A1 (en) | Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| RU2703401C1 (ru) | Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2785381C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2819044C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2782427C1 (ru) | Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2694501C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2689718C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| CN112063734A (zh) | 一种采用实时荧光定量pcr技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法 | |
| RU2726432C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| RU2728660C1 (ru) | Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| CN111778343A (zh) | 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用 | |
| RU2719719C1 (ru) | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700255C1 (ru) | Тест-система для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2703400C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2700254C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота | |
| RU2700448C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц | |
| RU2725216C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| RU2782573C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2694719C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных |