CN112063734A - 一种采用实时荧光定量pcr技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法，可有效解决人类血液中布鲁氏菌定量检测的问题，其解决的技术方案是，采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，引物和探针序列是：上游引物:5’‑GGAAGGTTCAGAAACAACCAC‑3’，下游引物：5’‑GTTGTAACCGGCCTGAACAC‑3’，探针：5’‑FAM‑TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG‑BHQ1‑3’，本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，采用实时荧光定量PCR技术，可准确检测出人类血液中布鲁氏菌含量，对布病的准确诊断及防控策略的制定有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法。
背景技术
布鲁氏菌病（布病）由布鲁氏菌引起的人畜共患自然疫源性传染病，它危害严重，流行广。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害，是一种重要的生物战剂和生物恐怖剂，目前诊断布病主要采用血清学和细菌学方法。血清学方法种类繁多，但总的来说还没有任何一种方法在特异性、敏感性及可操作性等方面均令人满意，细菌培养虽可直接查到病原体，但由于布鲁氏菌分离培养条件要求苛刻，阳性率很低，且分离过程中，存在操作人员面临被布鲁氏菌感染的危险及病菌从实验室扩散的风险。因此建立一种快速、准确的布鲁氏菌检测方法，对布病的诊断、治疗、预防以及最终控制布病均具有重要的意义。
近年来，伴随着分子生物学技术的飞速发展，快速特异、灵敏度高、操作简便的聚合酶链反应技术已被引入到细菌性传染病的流行病学调查及诊断中，并初步显示了其应用前景。国内外学者在利用PCR技术检测布鲁氏菌病方面做了较多的研究工作，其中BaileyGG等按牛种布鲁氏菌31KDa外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了5个引物B1～B5，将引物按不同组合做扩增试验，结果显示B4 和B5配对最好。Ohtsuki R等根据流产布鲁氏菌 BCSP31株的基因序列设计两组用于6个种布鲁氏菌鉴别的环介导等温扩增(LAMP)的特异性引物，通过对6个种22株布鲁氏菌和18个种28株非布鲁氏菌的检测表明，对布鲁氏菌的检测具有特异性(35 min，63℃)和敏感性(10 fg基因组DNA)。李坚等根据布鲁氏菌编码312 kDa布鲁氏菌蛋白的基因(BSCP31)和IS711插入序列及相邻单染色体DNA种的不同，设计引物，建立AMOS-PCR方法，用于诊断布鲁氏菌病，并鉴定种，实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR 技术的不足，已经成为细菌、病毒等微生物快速定量检测的首选技术。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法，可有效解决人类血液中布鲁氏菌定量检测的问题。
本发明解决的技术方案是，采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，引物和探针序列是：
上游引物:5’-GGAAGGTTCAGAAACAACCAC-3’
下游引物：5’-GTTGTAACCGGCCTGAACAC-3’
探针：5’-FAM-TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG-BHQ1-3’。
一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针在制备试剂盒中的应用。
一种采用实时荧光定量PCR定量检测人类血液中布鲁氏菌试剂盒包括置于盒体内的用于定量检测人类血液中布鲁氏菌的特异性扩增引物和探针，从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂。
本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与结核分枝杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体等细菌均无交叉反应，能够在1.5小时之内对人类血液中布鲁氏菌进行定量检测，具有快速、省事、操作方便等优势，采用实时荧光定量PCR技术，可准确检测出人类血液中布鲁氏菌含量，对布病的准确诊断及防控策略的制定有重要意义。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，核苷酸序列为SEQ ID No：1:
1gtggttgtttctgaaccttccgcccctactgctgctccagttgacaccttctcgtggaccggcggctatatcggtatcaacgccggttacgcaggcggcaagttcaagcatccattttctagctttgacaaggaagacaacgaacaggtttccggttcgctcgacgtaacagctggcggcttcgtcggtggtgttcaggccggttacaactggcagctcgacaacggcgtcgtgctcggcgcggaaaccgacttccagggatcgagcgttacgggttcgatttcagccggtgccagcggt
ctcgaaggcaaagctgaaaccaaggtcgagtggttcggcacagttcgtgcccgtcttggc
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aagtcggaatacctctacaccgacctcggcaagcgcaacctcgtcgacgttgacaatagc
Ttccttgagagcaaggtcaatttccacactgttcgcgtcggtctgaactacaagttctaa 660
所述的采用实时荧光定量PCR定量检测人类血液中布鲁氏菌试剂盒包括置于盒体内的用于定量检测人类血液中布鲁氏菌的试剂盒所用特异性扩增引物和探针，特异性扩增上游引物序列如SEQ ID No：2所示，下游引物序列如SEQ ID No：3所示，探针序列如SEQ ID No：4所示，从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂，其中：
SEQ ID No：2
BL primerF:5’-GGAAGGTTCAGAAACAACCAC-3’
SEQ ID NO:3
BL primerR:5’-GTTGTAACCGGCCTGAACAC-3’
SEQ NO:4
BL Probe :5’-FAM-TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG-BHQ1-3’
所述的从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂包括：
（1）从人类血浆中提取基因组DNA所用试剂，包括蛋白酶K、细胞裂解液（Buffer BL）、清洗液1（Buffer W1B）、清洗液2（Buffer W2B）、洗脱液（Eluent B）、无水乙醇、吸附柱；
（2）将DNA实时定量PCR所用试剂，包括布鲁氏菌的引物、探针。
本发明通过荧光定量PCR分析人类血液中布鲁氏菌含量水平，本发明该方法稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与结核分枝杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体等细菌均无交叉反应，能够在1.5小时之内对人类血液中布鲁氏菌进行定量检测，具有快速、省事、操作方便等优势。采用实时荧光定量PCR技术，可准确检测出人类血液中布鲁氏菌含量，对布病的准确诊断及防控策略的制定有重要意义，有关实验资料如下：
实施例1 制备检测人类血液中布鲁氏菌量的试剂盒(用于30次反应)
1. 蛋白酶K 600 μl
2. 细胞裂解液 30 ml
3. 无水乙醇 6 ml
4. 清洗液1 15 ml
5. 清洗液1 21 ml
6. 10mM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP 100 μl
7. 10μM 布鲁氏菌目的基因特异性引物、探针（其序列如SEQ ID NO: 2、3、4所示）24μl
实施例2 血浆样本布鲁氏菌的检测
1、收集待测患者血浆，放入盛有抑制DNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、血浆DNA的提取：
（1）取200μl血浆加入已盛有1ml的细胞裂解液和20μl 蛋白酶K的EP管中，充分混合均匀。
（2）56℃温浴5分钟，然后加入200 μl的无水乙醇，盖紧EP管并剧烈摇荡30秒。2000转/分钟离心10秒。
（3）将所有上述液体转移至吸附柱中，12000转/分钟离心1分钟。
（4）弃废液，向吸附柱中加入500μl清洗液1，12000转/分钟离心1分钟。
（5）弃废液，向吸附柱中加入700μl清洗液2，12000转/分钟离心1分钟。
（6）弃废液，空离心12000转/分钟离心2分钟。
（7）室温干燥5分钟。用50 μl 洗脱液水将DNA溶解，离心12000转/分钟离心2分钟收集DNA。
（8）DNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μl DNA样品加至样品孔，根据读数直接确定DNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为DNA纯度很好。最后，DNA贮存于-80℃冰箱备用。
3、利用布鲁氏菌的引物、探针进行实时定量PCR：特异性引物和探针在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测布鲁氏菌的试剂盒所用特异性扩增引物和探针，引物序列为SEQ ID No：2、3，探针序列为SEQ ID No：4。实时定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2×)，具体步骤如下：
（1）融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix完全融解并混匀后置于冰盒内。
（2）表1 冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)：
| 试剂 | 使用量 |
| BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, Low ROX) | 10 μl |
| 特异性引物、探针(浓度10μM) | 0.8 μl |
| 模板DNA | 2 μl |
| 灭菌水 | 7.2 μl |
| 总体积 | 20 μl |
(3) 通常DNA模板的量以1-10 ng DNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
(4) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
(5) 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
(6)PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以伯乐CFX96荧光定量PCR仪为例：
a. 预变性：95℃ 2 分钟
b. 变性：95℃ 15 秒
c. 退火/延伸：60℃ 30 秒，采集信号
d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环
e. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30 秒，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
4、布鲁氏菌表达量的数据分析：本实验数据纳入含有6个浓度梯度布鲁氏菌的血浆（分别为1x101 CFU/mL，1x102 CFU/mL，1x103 CFU/mL，1x104 CFU/mL，1x105 CFU/mL，1x106 CFU/mL）。实时定量PCR的结果用CT值进行定量分析，结果见表2。
表2检测布鲁氏菌的灵敏度
| 样本浓度（CFU/ml） | CT 值 |
| 1x10<sup>6</sup> | 25.5 |
| 1x10<sup>5</sup> | 29.4 |
| 1x10<sup>4</sup> | 31.6 |
| 1x10<sup>3</sup> | 34.5 |
| 1x10<sup>2</sup> | 38.2 |
| 1x10<sup>1</sup> | 0.0 |
6、为验证布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性，本实验选取了结核分枝杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体样本进行了检测，发现均为阴性，结果见表3。
表3检测布鲁氏菌的特异性
| 细菌名称（CFU/ml） | CT 值 |
| 结核分枝杆菌（1x10<sup>6</sup>） | 0.0 |
| 沙门氏菌（1x10<sup>6</sup>） | 0.0 |
| 金黄色葡萄球菌（1x10<sup>6</sup>） | 0.0 |
| 肺炎支原体（1x10<sup>6</sup>） | 0.0 |
由以上可以清楚的看出，荧光定量PCR分析人类血液中布鲁氏菌含量水平，该方法稳定性良好、灵敏度高、特异性强，与结核分枝杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体等细菌均无交叉反应，能够在1.5小时之内对人类血液中布鲁氏菌进行定量检测，具有快速、省事、操作方便等优势。采用实时荧光定量PCR技术可准确检测出人类血液中布鲁氏菌含量，对布病的准确诊断及防控策略的制定有重要意义。
序列表
<110> 河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）
<120> 一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 1
gtggttgttt ctgaaccttc cgcccctact gctgctccag ttgacacctt ctcgtggacc 60
ggcggctata tcggtatcaa cgccggttac gcaggcggca agttcaagca tccattttct 120
agctttgaca aggaagacaa cgaacaggtt tccggttcgc tcgacgtaac agctggcggc 180
ttcgtcggtg gtgttcaggc cggttacaac tggcagctcg acaacggcgt cgtgctcggc 240
gcggaaaccg acttccaggg atcgagcgtt acgggttcga tttcagccgg tgccagcggt 300
ctcgaaggca aagctgaaac caaggtcgag tggttcggca cagttcgtgc ccgtcttggc 360
tacacggcta ccgaacgcct catggtttat ggtaccggcg gtctggccta tggtaaggtc 420
aagtctgcgt tcaacctggg tgatgatgca ggtgccctgc acacgtggtc cgacaagacg 480
aaagctggct ggaccctcgg cgctggtgct gaatatgcca tcaacaacaa ctggacgctc 540
aagtcggaat acctctacac cgacctcggc aagcgcaacc tcgtcgacgt tgacaatagc 600
ttccttgaga gcaaggtcaa tttccacact gttcgcgtcg gtctgaacta caagttctaa 660
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 2
ggaaggttca gaaacaacca c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 3
gttgtaaccg gcctgaacac 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 4
tgctgctcca gttgacacct tctcg 25
Claims (6)
1.一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针序列是：
上游引物:5’-GGAAGGTTCAGAAACAACCAC-3’
下游引物：5’-GTTGTAACCGGCCTGAACAC-3’
探针：5’-FAM-TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG-BHQ1-3’
所述的引物和探针扩增的目标核昔酸序列为序列表中SEQ ID No.1。
2.一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针在制备试剂盒中的应用。
3.一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，包括置于盒体内的用于定量检测人类血液中布鲁氏菌的特异性扩增引物和探针，从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂。
4.根据权利要求3所述的采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，所述的从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂包括：
（1）从人类血浆中提取基因组DNA所用试剂，包括蛋白酶K、细胞裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脱液、无水乙醇、吸附柱；
（2）将DNA实时定量PCR所用试剂，包括布鲁氏菌的引物、探针。
5.一种检测人类血液中布鲁氏菌的检测方法，所述的检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于，包括以下步骤：
1）收集待测患者血浆，放入盛有抑制DNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用；
2）血浆DNA的提取；
3）利用布鲁氏菌的引物、探针进行实时定量PCR；
4）布鲁氏菌实时定量PCR的结果用CT值进行定量分析。
6.根据权利要求3或4或5任一项所述的采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的条件为:
a. 预变性：95℃ 2 分钟
b. 变性：95℃ 15 秒
c. 退火/延伸：60℃ 30 秒，采集信号
d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环。
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-
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- 2020-09-24 CN CN202011016959.6A patent/CN112063734A/zh active Pending
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