RU2782427C1 - Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents
Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782427C1 RU2782427C1 RU2021138989A RU2021138989A RU2782427C1 RU 2782427 C1 RU2782427 C1 RU 2782427C1 RU 2021138989 A RU2021138989 A RU 2021138989A RU 2021138989 A RU2021138989 A RU 2021138989A RU 2782427 C1 RU2782427 C1 RU 2782427C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cryptosporidiosis
- dna
- causative agent
- fluorescent
- animal
- Prior art date
Links
- 208000008953 Cryptosporidiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 206010011502 Cryptosporidiosis infection Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 36
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title claims abstract description 34
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 claims abstract description 8
- 244000052769 pathogens Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 43
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 8
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 5
- -1 probes Substances 0.000 claims description 4
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108020004418 Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 229920002973 ribosomal RNA Polymers 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002483 18S ribosomal RNA Polymers 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 description 1
- 210000000795 Conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 229940026599 Cryptosporidium parvum Drugs 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- NIKFYOSELWJIOF-UHFFFAOYSA-O Fuchsine Chemical compound Cl.C1=C(N)C(C)=CC(C(=C2C=CC(=[NH2+])C=C2)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 NIKFYOSELWJIOF-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 Nose Anatomy 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002741 Palatine Tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции. Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных, в воде из водоемов и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени включает выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из биологического материала инфицированного животного сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси, содержащей в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green. для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) из материала по выбору: вода из водоемов, корма, фекалии, паренхиматозные органы, кишечник и тонкая кишка, мясо и сырые мясные продукты, сырое молоко и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) со следующей нуклеотидной последовательностью:
Crypto-F: 5'-AAGGGTTGTATTTATTAGATAA-3';Crypto-R: 5'-GTCAGAAACTTGAATGATA-3';
Crypto-Z: HEX-5'-TCCGTAAAGTTATTATGAGTCACCAAT-3'-BHQ1, при этом для ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) используют флуоресцентный краситель - JOE(HEX)/Yellow. Способ позволяет расширить функциональные возможности и повысить точность при выявлении возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis). 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.
Известен в медицине способ диагностики криптоспоридиоза включающий гистологическое исследование биоптата, дофиксацию срезов метанолом, экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение 5-10 мин, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту. Способ обеспечивает положительный эффект в виде выявления объективных критериев диагностики криптоспоридиоза, обеспечивающих тактику лечения (патент РФ №2229128, кл. G01N 1/30, 2004 г.).
Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2680094, кл. C12Q 1/68, 2019 г., которое включает: выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из биологического материала инфицированного животного сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F: 
- прямой праймер
T4R: 
- обратный праймер
Т4Р: 
- зонд, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза. (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных, в воде водоемов и кормах.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis).
Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных, в воде из водоемов и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из биологического материала инфицированного животного сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F: 
- прямой праймер
T4R: 
- обратный праймер
Т4Р: 
- зонд, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) из материала по выбору: вода из водоемов, корма, фекалии, паренхиматозные органы, кишечник и тонкой кишки, мясо и сырые мясные продукты, сырое молоко и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) со следующей нуклеотидной последовательностью:
Crypto-F: 
Crypto-R: 
Crypto-Z: 
при этом для ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) используют флуоресцентный краситель - JOE(HEX)/Yellow.
Новизна заявляемого способа состоит в идентификации ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis)c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени осуществляется следующим образом.
Предварительно выделяют ДНК из биологического материала животного сорбционным методом. В качестве биологического материала по выбору может быть использованы: вода из водоемов, корма, фекалии, паренхиматозные органы, кишечник и тонкой кишки, мясо и сырые мясные продукты, сырое молоко, которые подвергают определенной обработке.
Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) используют флуоресцентный краситель - JOE(HEX)/Yellow и для внутреннего контрольного образца бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл - FAM/Green. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) и бактериофага Т4 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Crypto-F: 
Crypto-R: 
Crypto-Z: 
T4F: 
- прямой праймер
T4R: 
- обратный праймер
Т4Р: 
- зонд.
Затем измеряют накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Для повышения точности идентификации возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) для внутреннего контрольного образца используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Crypto-F: 
Crypto-R: 
Crypto-Z: 
T4F: 
- прямой праймер
T4R: 
- обратный праймер
Т4Р: 
- зонд.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные для генома криптоспоридий (Cryptosporidium spp.) были отобраны на основе нуклеотидной последовательности гена 18S rRNA генома (LOCUS AF093490 1746 bp DNA linear INV 04-MAY-2010 DEFINITION Cryptosporidium parvum strain Bovine C. parvum genotype (BOH6) small subunit ribosomal RNA gene, complete sequence.)
Дизайн олигонуклеотидных праймеров разработан с использованием специализированного программного обеспечения Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). В результате анализа выбран участок между 100 и 400 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности. С помощью программы «Oligo 6.0» рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома.
Crypto-F: 
Crypto-R: 
Специфичность праймеров (Crypto-F и Crypto-R) оценивали на сервере NCBI с использованием программы BLAST.
Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Crypto-Z (гомологичный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Crypto-F и Crypto-R). 3'-конец олигонуклеотидного зонда был помечен флуоресцентным красителем HEX, а 5'-конец зонда содержит гаситель флуоресценции BHQ1:
Crypto-Z: 
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР в качестве праймеров и зонда. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах других представителей кокцидий из группы простейших, а также в геномах любых видов животных и человека.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем FAM. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем FAM (Карбоксифлуоресцеин - длина волны возбуждения - 490 нм, флуоресценции - 520 нм). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ)
Пример включает следующие этапы:
1. Отбор материала для исследования
Для исследования используют следующий материал:
Мазки и соскобы слизистых оболочек носа. Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;
Фрагменты паренхиматозных органов (фрагменты печени, легких, селезенки, а также миндалины, лимфоузлы и др.). Отбирают в стерильный контейнер.
Цельная кровь. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.
Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду.
Отбор исследуемых образцов кормов/сырья проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп сырья, пищевых продуктов и кормов.
2. Подготовка исследуемого материала
Мазки и соскобы со слизистых конъюнктивы в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.
Пробы тканей и органов, а также пробы продуктов животного происхождения гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем обычно готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об./мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции НК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения нуклеиновой кислоты (НК).
Молоко в объеме до 10 мл обеззараживают и центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.
От кормов/сырья плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированные или консервированные корма/сырье перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния. Отбирают лабораторные пробы (20-40 мг) в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл и направляют на выделение НК.
3. Проведение анализа
Исследование проводили с помощью набора реагентов «ПЦР-КРИПТОСПОРИДИОЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidium spp.)». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (Таблица 1, комплект №1) и комплекта контрольных образцов (Таблица 2, комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-КРИПТОСПОРИДИОЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidium spp.) в биологическом материале и кормах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, 21.10.60-221-51062356-2020 Для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.
Исследование с помощью набора реагентов «ПЦР-КРИПТОСПОРИДИОЗ-ФАКТОР» состоит из трех циклов:
экстракция ДНК;
проведение ПЦР РВ;
учет результатов анализа.
4. Экстракция (выделение) НК из клинического материала
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Внести во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО Cryptosporidium.
Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения ДНК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).
Выделять ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения ДНК.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.
5. Подготовка образцов к проведению ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО Cryptosporidium, ВКО Cryptosporidium и ДНК буфера.
В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ Cryptosporidium
10 мкл ПЦР БУФЕР Cryptosporidium
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешать смесь на вортексе и сбросить капли кратковременным центрифугированием.
Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Внести по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО Cryptosporidium.
6. Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q указаны таблице 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора.
7. Интерпретация результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 к Инструкции.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале JOE(HEX)/Yellow) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.
Образец считается положительным (ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidium spp.) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.
Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidium spp.), отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4).
Claims (8)
- Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных, в воде из водоемов и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из биологического материала инфицированного животного сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси, содержащей в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
- T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер
- T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер
- Т4Р: СУ5-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, отличающийся тем, что выделяют ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) из материала по выбору: вода из водоемов, корма, фекалии, паренхиматозные органы, кишечник и тонкая кишка, мясо и сырые мясные продукты, сырое молоко и для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) со следующей нуклеотидной последовательностью:
- Crypto-F: 5'-AAGGGTTGTATTTATTAGATAA-3'
- Crypto-R: 5'-GTCAGAAACTTGAATGATA-3'
- Crypto-Z: НЕХ-5'-TCCGTAAAGTTATTATGAGTCACCAAT-3'-BHQ1,
- при этом для ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) используют флуоресцентный краситель - JOE(HEX)/Yellow.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2782427C1 true RU2782427C1 (ru) | 2022-10-26 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2229128C2 (ru) * | 2002-06-28 | 2004-05-20 | Российский государственный медицинский университет | Способ диагностики криптоспоридиоза |
| RU2680094C1 (ru) * | 2018-10-01 | 2019-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2229128C2 (ru) * | 2002-06-28 | 2004-05-20 | Российский государственный медицинский университет | Способ диагностики криптоспоридиоза |
| RU2680094C1 (ru) * | 2018-10-01 | 2019-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| WO2004101815A1 (en) | Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes | |
| CN111518877B (zh) | 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒 | |
| RU2694558C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота | |
| RU2703401C1 (ru) | Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| RU2703394C1 (ru) | Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| RU2782427C1 (ru) | Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2785381C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2819044C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2719719C1 (ru) | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2728660C1 (ru) | Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| RU2726432C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| RU2700381C1 (ru) | Способ выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц | |
| CN111778343A (zh) | 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用 | |
| RU2700478C1 (ru) | Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2701332C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц | |
| CN112063734A (zh) | 一种采用实时荧光定量pcr技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法 | |
| RU2794654C1 (ru) | Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700448C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя орнитоза (Chlamydophila psittaci) у птиц |