RU2680094C1 - Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных - Google Patents
Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2680094C1 RU2680094C1 RU2018134638A RU2018134638A RU2680094C1 RU 2680094 C1 RU2680094 C1 RU 2680094C1 RU 2018134638 A RU2018134638 A RU 2018134638A RU 2018134638 A RU2018134638 A RU 2018134638A RU 2680094 C1 RU2680094 C1 RU 2680094C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- control sample
- leptospirosis
- dna
- causative agent
- mixture
- Prior art date
Links
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 title claims abstract description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 20
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 101100029838 Mus musculus Pinx1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 9
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101150046735 LEPR gene Proteins 0.000 description 1
- 101150063827 LEPROT gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007719 RNA exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных. Описан тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя лептоспироза Leptospira spp. и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в объемном соотношении 1:1. Технический результат - уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении полимеразной цепной реакции. 2 ил., 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных.
Также известно использование ПЦР для диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных для этого проводили две амплификации: первая - с внешней парой праймеров (LepF и LepR), вторая - с внутренней (16LNF и 16LNR). Использовали универсальные праймеры, позволяющие определять участок генома, кодирующий 16S рРНК. Выявление продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Гели анализировали, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (
- 254 нм).
Исследуемые пробы считали отрицательными, если на электрофоре-граммах не было четких полос или полосы не соответствовали по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагались на другом расстоянии от старта) (Викторова Е.В. Автореферат диссертации по ветеринарии на тему «Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных», Москва, 2006 г.)
Недостатком известного технического решения является не достаточная чувствительность из-за проведения ПЦР в агарозном геле.
Наиболее близким аналогом является техническое решение (Инструкция по применению набора реагентов для выявления 16S РНК патогенных геновидов лептоспир в клиническом, аутопсийном и биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Leptospira-FL», Москва, 2018 г. - прототип) в котором использовали буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя лептоспироза и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец,
Недостатком является увеличение трудозатрат, времени и использование дополнительных реагентов для процесса выделения РНК для получения кДНК.
Техническим результатом является уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающем буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для уменьшения трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных и используют для внутреннего и положительного контрольных образцов различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных используется следующим образом.
Выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных. В качестве биологического материала используют по выбору: цельную кровь (от животных с острой формой инфекции), фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) и мочу. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2) накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green - накопление сигнала внутреннего контрольного образца (фиг. 1), проведят интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции - отрицательный.
Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных. Для тест системы используют набор «ПЦР-ЛЕПТОСПИРОЗ-ФАКТОР» в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ЛЕПТОСПИРОЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-129-51062356-2017, для диагностики in vitro, (http://www. vetfaktor.ru/.).
Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.
Для исследования используют следующий биологический материал:
- Цельная кровь (от животных с острой формой инфекции). Кровь забирается в пробирку с 3-6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.
- Фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) отбирают в стерильный контейнер.
- Мочу отбирают в количестве 15-25 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер. Если нет возможности исследовать материал в течение суток вносят глицерин до 10% от объема, перемешивают и хранят при температуре не выше 16°С.
Подготовка исследуемого биологического материала:
Кровь. Пробирку с кровью аккуратно несколько раз переворачивают для равномерного перемешивания. Затем готовят плазму центрифугированием в течение 6-10 мин при 1000 g. Отбирают плазму в пробирки по 1 мл и центрифугируют на микроцентрифуге при 13 тыс об/мин в течение 10 мин для концентрирования бактериальных клеток. Удаляют 900 мкл надосадочной плазмы, оставшиеся 100 мкл надосадка используют для экстракции ДНК.
Исследуемые пробы фрагментов тканей и органов от павших животных гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют десятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (2000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2-5 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.
Мочу после сбора отстаивают в течение 1 часа, затем осторожно сливают, оставляя придонную часть - около 10 мл. Центрифугируют остаток при 5000-6000 g 10 мин, удаляют надосадочную жидкость (не полностью), осадок с 100 мкл надосадочной жидкости переносят в пробирку объемом 1,5 мл и используют для экстракции ДНК.
Проведение анализа, который состоит из трех этапов:
- экстракция нуклеиновой кислоты (НК), на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);
- проведение ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
- учет результатов анализа.
Для экстракции (выделения) НК из биологического материала отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) LEPTO.
Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначить как ВК-).
Выделяют НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.
Подготовку образцов к проведению ПЦР проводят с помощью комплектов входящих набор «ПЦР-ЛЕПТОСПИРОЗ-ФАКТОР». Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) LEPTO, ВКО LEPTO и ДНК буфера, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) и фрагмент генома бактериофага T4 взятых в объемном соотношении 1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ LEPTO
10 мкл смеси ПЦР БУФЕР LEPTO
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО LEPTO ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией проводят с помощью прибора «Rotor-Gene Q», подготовленные для проведения ПЦР пробирки помещают в его ячейки. Далее программируют прибор согласно инструкции производителя.
Интерпретацию результатов анализа проводят по полученным кривым накопления флуоресцентного сигнала, которые анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале JOE(HEX)/Yellow) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу FAM/Green (фиг. 1) значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.
Образец считается положительным (ДНК бактерий рода Leptospira присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.
Эффективность заявляемого технического решения по сравнению с прототипом подтверждается сравнительным анализом по части расходного материала, трудозатрат и времени. В прототипе необходимо использовать набор реагентов в 4 формах комплектации, а в заявляемом же всего 2 формы комплектов. Что касается сокращения трудозатрат и времени, то исключение выделения РНК из биологического материал и проведения реакции обратной транскрипции, уже влечет за собой сокращение трудозатрат и времени.
Claims (7)
1. Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза Leptospira spp. у сельскохозяйственных животных, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для возбудителя лептоспироза Leptospira spp. и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, отличающийся тем, что для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза Leptospira spp. Lpts и фрагмент генома бактериофага T4, взятых в объемном соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Lpts F CCCGCGTCCGATTAG прямой праймер
Lpts R TCCATTGTGGCCGRACAC обратный праймер
Lpts Р [R6G]CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC[BHQ1]зонд
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG
Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC BHQ1зонд.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134638A RU2680094C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134638A RU2680094C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2680094C1 true RU2680094C1 (ru) | 2019-02-15 |
Family
ID=65442574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134638A RU2680094C1 (ru) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2680094C1 (ru) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2719719C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-04-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| RU2725215C1 (ru) * | 2019-10-14 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725210C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725216C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725539C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2726242C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| RU2726432C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле |
| RU2726429C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2726555C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2728382C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2728639C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2744186C1 (ru) * | 2019-10-31 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Набор для выявления возбудителя лептоспироза в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) |
| RU2782427C1 (ru) * | 2021-12-24 | 2022-10-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA48561A (ru) * | 2001-10-11 | 2002-08-15 | Акціонерне Товариство Закритого Типу Науково-Виробнича Компанія "Діапроф Мед" | Тест-система диагностическая иммуноферментная для выявления противолептоспирозных антител в сыворотках крови людей и человека |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134638A patent/RU2680094C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA48561A (ru) * | 2001-10-11 | 2002-08-15 | Акціонерне Товариство Закритого Типу Науково-Виробнича Компанія "Діапроф Мед" | Тест-система диагностическая иммуноферментная для выявления противолептоспирозных антител в сыворотках крови людей и человека |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Викторова Е.В. Авто диссертации по ветеринарии на тему "Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных", Москва, 2006 г. * |
| Инструкция по применению набора реагентов для выявления 16S РНК патогенных геновидов лептоспир в клиническом, аутопсийном и биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс Leptospira-FL", Москва, 2018 г. * |
| Инструкция по применению набора реагентов для выявления 16S РНК патогенных геновидов лептоспир в клиническом, аутопсийном и биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс Leptospira-FL", Москва, 2018 г. Викторова Е.В. Автореферат диссертации по ветеринарии на тему "Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных", Москва, 2006 г. * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2725215C1 (ru) * | 2019-10-14 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2726432C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле |
| RU2725210C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725216C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-06-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2725539C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2726242C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| RU2719719C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-04-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
| RU2726429C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани медведя (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2726555C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2728382C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани собаки домашней (Canis lupus familiaris) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2728639C1 (ru) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для идентификации ДНК ткани кошки домашней (Felis silvestris catus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах |
| RU2744186C1 (ru) * | 2019-10-31 | 2021-03-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Набор для выявления возбудителя лептоспироза в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) |
| RU2782427C1 (ru) * | 2021-12-24 | 2022-10-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2700480C1 (ru) | Тест-система для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| RU2645263C1 (ru) | Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2681473C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2703401C1 (ru) | Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| RU2703394C1 (ru) | Способ выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| CN115820818B (zh) | 一种一步法核酸检测方法及其应用 | |
| RU2700478C1 (ru) | Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2703400C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2700254C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2782427C1 (ru) | Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700449C1 (ru) | Способ выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота | |
| RU2819044C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700247C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале животных, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2785381C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2700476C1 (ru) | Способ выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале животных, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения | |
| RU2696306C1 (ru) | Способ выявления РНК вируса болезни Шмалленберга у сельскохозяйственных животных | |
| CN114058719A (zh) | 一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用 | |
| RU2719719C1 (ru) | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2700450C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |