CN109439781A - 用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用 - Google Patents

用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用，其中引物组合物为用于检测gluD基因的引物组合物、用于检测tcdA基因的引物组合物、用于检测tcdB基因的引物组合物、用于检测cdtA基因的引物组合物和用于检测cdtB基因的引物组合物中的一种或多种；试剂盒包括上述的引物组合物、dNTP、聚合酶、反应缓冲液、荧光试剂。本发明的引物组合物根据艰难梭菌几种保守基因序列所设计，能更准确的判断是否为艰难梭菌以及确定产毒艰难梭菌的毒素类型，可应用于艰难梭菌的LAMP检测，具有灵敏性高，特异性强等优势。

Description

用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)是一种严格厌氧生长的革兰阳性梭状芽孢杆菌，为人类肠道中的正常菌群。是一种机会致病菌，生存环境恶劣情况下可以形成次极端芽孢的专性厌氧菌。大量应用广谱抗生素等原因造成肠道稳态失衡,该菌过度繁殖，引起CDAD(艰难梭菌相关性腹泻)。艰难梭菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，是引起院内肠道感染的主要致病菌之一。临床上，约15％～25％的抗菌药物相关性腹泻，50％～75％的抗菌药物相关性结肠炎和95％～100％的伪膜性肠炎是由CDI(艰难梭菌感染)引起。CDI主要是由于长期或不规范使用抗菌药物而导致肠道菌群紊乱而最终产毒艰难梭菌在人类肠道过度繁殖引起。主要临床症状为发热、腹痛以及水样便腹泻。轻者引起腹泻，严重者引起伪膜性肠炎，且常伴有中毒性巨结肠、肠穿孔、感染性休克等并发症，甚至最终导致死亡。在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国CDI潜在威胁远高于国际水平，临床需求较明确。
艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株的产毒因子主要包括毒素A和毒素B，由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受负向调节基因tcdC、正向调节基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE调节，以上基因共同构成了致病决定区。毒素A又称肠毒素，易导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。此外，在北美洲和欧洲引起广泛暴发流行的027型艰难梭菌可以产生更强的毒素，即二元毒素(binarytoxin，CDT)。CDT由CDT a和CDT b这两种独立蛋白链组成，由致病性决定区外的2个染色体基因cdt A基因和cdt B基因编码。cdtA是一种ADP核糖转移酶，可阻断肌动蛋白片段的合成而诱导细胞死亡，cdtB是一种运输蛋白，被丝氨酸蛋白酶激活后，cdtB通过与宿主细胞结合，把cdtA转移至细胞液中，诱导细胞骨架解聚，生成微管突出物，增强艰难梭菌的定植。
目前对于艰难梭菌的检测的主要对象是细菌、毒素、毒素基因、乳酸脱氢酶。目前国际公认鉴定艰难梭菌的“金标准”仍然是传统的粪便标本培养和细胞毒素实验，但周转时间长、操作难、设备技术要求高。目前并未常规应用于临床微生物实验室；GDH(谷氨酸脱氢酶)是所有艰难梭菌高水平表达的代谢酶(艰难梭菌中GDH抗原由gluD基因编码)，可用于筛查疑似艰难梭菌患者粪便样本，能够通过EIAs(酶联免疫法)直接检测粪便中的GDH抗原，操作简单、快速且敏感度高，但是由于不能区分产毒和非产毒艰难梭菌而只能作为一种高度敏感的初筛手段；EIAs直接检测粪便中的艰难梭菌毒素，通过单克隆抗体特异性结合艰难梭菌A/B毒素蛋白进行检测，特异性高，能区分产毒和非产毒艰难梭菌，且检测周期短，数小时能出结果，操作简便、应用广泛，但是敏感性较低(39％～76％)，因此常和GDH检测或核酸扩增技术联合应用，用于艰难梭菌感染实验室两步法或三步法诊断。PCR法检测CDI具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域，但是同时面对的一个问题是价格比较贵，检测成本比较高，临床推广有一定难度。因此，开发一种快速、特异、灵敏且成本相对更低的艰难梭菌毒素基因检测方法意义重大。
LAMP是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，1小时内即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。目前已被广泛应用于肿瘤筛选、植物病毒检测、转基因食品检测、动物胚胎性别鉴定、水生和陆生动物的细菌性及病毒性疫病检测等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、由其组成的检测试剂盒和应用。根据艰难梭菌特异性保守基因gluD、tcdA、tcdB、cdtA以及cdtB设计引物，然后以待测物的基因组DNA为模板，在引物的引导下进行LAMP扩增并且通过荧光染料作用产生荧光信号来快速定性检测待测样品。本发明可实现单独或联合检测gluD、tcdA、tcdB、cdtA以及cdtB基因，在等温条件下实现便捷、高效、高特异以及高灵敏度的艰难梭菌检测。同时，可为区分无毒株艰难梭菌与产毒株艰难梭菌及毒素类型提供新的技术平台，也能够指导临床诊疗及预防艰难梭菌高毒力菌株的流行，用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测产毒艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的社会、经济效益。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测艰难梭菌基因的引物组合物，所述引物组合物为用于检测gluD基因的引物组合物、用于检测tcdA基因的引物组合物、用于检测tcdB基因的引物组合物、用于检测cdtA基因的引物组合物和用于检测cdtB基因的引物组合物中的一种或多种；
所述用于检测gluD基因的引物组合物包括gluD-F3、gluD-B3、gluD-FIP、gluD-BIP，所述gluD-F3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述gluD-B3的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述gluD-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述gluD-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述用于检测tcdA基因的引物组合物包括tcdA-F3、tcdA-B3、tcdA-FIP、tcdA-BIP，所述tcdA-F3的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述tcdA-B3的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，所述tcdA-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，所述tcdA-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；
所述用于检测tcdB基因的引物组合物包括tcdB-F3、tcdB-B3、tcdB-FIP、tcdB-BIP，所述tcdB-F3的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，所述tcdB-B3的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，所述tcdB-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.11所示，所述tcdB-BIP的DNA序列如SEQ IDNO.12所示；
所述用于检测cdtA基因的引物组合物包括cdtA-F3、cdtA-B3、cdtA-FIP、cdtA-BIP，所述cdtA-F3的DNA序列如SEQ ID NO.13所示，所述cdtA-B3的DNA序列如SEQ ID NO.14所示，所述cdtA-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.15所示，所述cdtA-BIP的DNA序列如SEQ IDNO.16所示；
所述用于检测cdtB基因的引物组合物包括cdtB-F3、cdtB-B3、cdtB-FIP、cdtB-BIP，所述cdtB-F3的DNA序列如SEQ ID NO.17所示，所述cdtB-B3的DNA序列如SEQ ID NO.18所示，所述cdtB-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.19所示，所述cdtB-BIP的DNA序列如SEQ IDNO.20所示。
做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的引物组合物、dNTP、聚合酶、反应缓冲液、荧光试剂。
上述的试剂盒，优选的，还包括甜菜碱、MgSO4和KCl。
上述的试剂盒，优选的，所述荧光试剂为SYBR Green I。
上述的试剂盒，优选的，所述用于检测gluD基因的引物组合物中，gluD-FIP和gluD-BIP︰gluD-F3和gluD-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，所述用于检测tcdA基因的引物组合物中，tcdA-FIP和tcdA-BIP︰tcdA-F3和tcdA-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，所述用于检测tcdB基因的引物组合物中，tcdB-FIP和tcdB-BIP︰tcdB-F3和tcdB-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，所述用于检测cdtA基因的引物组合物中，cdtA-FIP和cdtA-BIP︰cdtA-F3和cdtA-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，所述用于检测cdtB基因的引物组合物中，cdtB-FIP和cdtB-BIP︰cdtB-F3和cdtB-B3的摩尔比为4︰1。
上述的试剂盒，优选的，所述试剂盒中，所述dNTP的浓度为1.2mM，所述聚合酶为8UBst DNA聚合酶，所述反应缓冲液为1X Thermopol反应缓冲液，所述甜菜碱的浓度为1M，所述MgSO4的浓度为3.2mM、所述KCl的浓度为12mM，所述荧光染料为0.8X SYBR Green I。
做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述试剂盒在艰难梭菌的LAMP检测中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用的方法为：将待测物基因组的模板DNA置于试剂盒中进行LAMP扩增，用PCR仪实时检测开始反应后反应液的荧光强度，根据荧光强度曲线确定所述反应液中是否存在艰难梭菌以及产毒艰难梭菌产毒类型。
上述的应用，优选的，当试剂盒中所述用于检测gluD基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线，其他引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中存在非产毒艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因、tcdB基因的引物组合物或所述用于检测gluD基因、tcdA基因和tcdB基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线，其他引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中存在产毒艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因、tcdB基因、cdtA基因和cdtB基因的引物组合物或所述用于检测gluD基因、tcdA基因、tcdB基因、cdtA基因和cdtB基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线时，表示待测样品中存在毒素加强型艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因的引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中不存艰难梭菌。
上述的应用，优选的，所述LAMP扩增的条件为在63℃下恒温45min～90min。
进一步的，所述LAMP扩增的条件为在63℃下恒温60min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的引物组合物，LAMP引物根据艰难梭菌几种保守基因序列所设计，能更准确的判断是否为艰难梭菌以及确定产毒艰难梭菌的毒素类型；具有灵敏性高，特异性强等优势。
(2)本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的检测试剂盒，可按实验需要单独或联合检测gluD、tcdA、tcdB、cdtA和cdtB，快速确定是否为艰难梭菌，以及产毒艰难梭菌毒素基因存在情况。快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应60分钟内即可完成；结果鉴定简便：直接通过检测荧光信号以及荧光信号出峰时间来判断；特异性高，每个基因对应的4条引物对艰难梭菌靶序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性。灵敏度高，能达到1pg/μL。
(3)本发明提供了一种用于检测艰难梭菌的检测试剂盒在艰难梭菌的LAMP检测中的应用，可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌以及其毒素携带情况，为艰难梭菌的检测及毒素类型提供了新的技术平台，为临床诊疗及预后提供指导，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测产毒艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为实施例3用艰难梭菌gluD引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。
图2为实施例3用艰难梭菌tcdA引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。
图3为实施例3用艰难梭菌tcdB引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。
图4为实施例3用艰难梭菌cdtA引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。
图5为实施例3用艰难梭菌cdtB引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。
图6为实施例4用艰难梭菌gluD引物的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。
图7为实施例4用艰难梭菌tcdA引物的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。
图8为实施例4用艰难梭菌tcdB引物的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。
图9为实施例4用艰难梭菌cdtA引物的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。
图10为实施例4用艰难梭菌cdtB引物的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种用于检测艰难梭菌毒性基因的引物组合物，包括：
用于检测gluD基因的引物组合物、用于检测tcdA基因的引物组合物、用于检测tcdB基因的引物组合物、用于检测cdtA基因的引物组合物、用于检测cdtB基因的引物组合物。
其中用于检测gluD基因的引物组合物包括：
gluD-F3(SEQ ID NO.1)：GGTGTTATAACTGGTAAGCCA；
gluD-B3(SEQ ID NO.2)：TTCAGCCATAGCTACAACA；
gluD-FIP(SEQ ID NO.3)：
CTTGCTGTAACAGCAACACCAAGAATTTGGTGGTTCTTTAGGAAG；
gluD-BIP(SEQ ID NO.4)：
TAGCTGTTCAAGGTATAGGAAACGTACCACCAAGTTTTTCACAGT。
其中用于检测tcdA基因的引物组合物包括：
tcdA-F3(SEQ ID NO.5)：TCCAATACAAGCCCTGTAG；
tcdA-B3(SEQ ID NO.6)：GAATCTCTTCCTCTAGTAGCT；
tcdA-FIP(SEQ ID NO.7)：
CTGCATTAATATCAGCCCATTGTTTATTTACATTTTGTATGGATAGGTGG；
tcdA-BIP(SEQ ID NO.8)：
AACTGTGGTATGATAGTGAAGCATTTCAGTGGTAGAAGATTCAACT。
其中用于检测tcdB基因的引物组合物包括：
tcdB-F3(SEQ ID NO.9)：TGATAGTATAATGGCTGAAGCT；
tcdB-B3(SEQ ID NO.10)：GAGATTTCAAAGTTTCTTAAGTCAG；
tcdB-FIP(SEQ ID NO.11)：
CATCTGGGAAGAAACCAACTCTTAGCAGATAATGGTAGATTTATGATGG；
tcdB-BIP(SEQ ID NO.12)：
AAGTGGCCCTGAAGCATATGCCAAATGGATATTCATACTACCTTCT。
其中用于检测cdtA基因的引物组合物包括：
cdtA-F3(SEQ ID NO.13)：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG；
cdtA-B3(SEQ ID NO.14)：TGATAGATAAGCTCCAGGAGA；
cdtA-FIP(SEQ ID NO.15)：
GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTAACTCTTACTTCCCCTGAA；
cdtA-BIP(SEQ ID NO.16)：
ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCAACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT。
其中用于检测cdtB基因的引物组合物包括：
cdtB-F3(SEQ ID NO.17)：GAGTCAAATACTGCTGGAGA；
cdtB-B3(SEQ ID NO.18)：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT；
cdtB-FIP(SEQ ID NO.19)：
CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT；
cdtB-BIP(SEQ ID NO.20)：
AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGCCTTGATCAGTAGAGGCATG。
上述引物组合物是从美国基因数据库检索获得艰难梭菌引物设计模板序列，再通过NCBIBLAST软件进行同源性分析获得特异保守序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primerdesign V4设计用于对产毒艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果五种基因优化后分别得到两组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，具体各基因特异保守序列如表1。
表1：各基因特异保守序列表
基因名 序列GenBank号 位置
gluD M65250.1 1-1266
tcdA JQ809335.1 1-1470
tcdB AF217292.1 1-1228
cdtA AF271719.1 1-1260
cdtB HQ639677.1 1-1330
gluD序列为：
tcdA序列为：
tcdB序列为：
cdtA序列为：
cdtB序列为：
实施例2
一种用于检测艰难梭菌毒性基因的LAMP检测试剂盒，包括用于检测gluD基因的LAMP检测试剂盒、用于检测tcdA基因的LAMP检测试剂盒、用于检测tcdB基因的LAMP检测试剂盒、用于检测cdtA基因的LAMP检测试剂盒、用于检测cdtB基因的LAMP检测试剂盒。试剂盒具体的成分及含量见表2至表6：
表2：检测gluD基因的LAMP检测试剂盒成分表
成分名称 浓度 体积
基因组DNA —— 2μl
gluD-FIP 40μM 0.5μl
gluD-BIP 40μM 0.5μl
gluD-F3 100μM 0.05μl
gluD-B3 100μM 0.05μl
Thermopol反应缓冲液 10X 2.5μl
MgSO<sub>4</sub> 100mM 0.8μl
KCl 100mM 3μl
dNTP 10mM 3μl
SYBR Green I 10X 0.08μl
Bst DNA聚合酶 8 000U/mL 1μl
甜菜碱 10mM 2.5μl
RNase-free water —— 9.02μl
表3：检测tcdA基因的LAMP检测试剂盒成分表
表4：检测tcdB基因的LAMP检测试剂盒成分表
成分名称 浓度 体积
基因组DNA —— 2μl
tcdB-FIP 40μM 0.5μl
tcdB-BIP 40μM 0.5μl
tcdB-F3 100μM 0.05μl
tcdB-B3 100μM 0.05μl
Thermopol反应缓冲液 10X 2.5μl
MgSO<sub>4</sub> 100mM 0.8μl
KCl 100mM 3μl
dNTP 10mM 3μl
SYBR Green I 10X 0.08μl
Bst DNA聚合酶 8 000U/mL 1μl
甜菜碱 10mM 2.5μl
RNase-free water —— 9.02μl
表5：检测cdtA基因的LAMP检测试剂盒成分表
表6：检测cdtB基因的LAMP检测试剂盒成分表
成分名称 浓度 体积
基因组DNA —— 2μl
cdtB-FIP 40μM 0.5μl
cdtB-BIP 40μM 0.5μl
cdtB-F3 100μM 0.05μl
cdtB-B3 100μM 0.05μl
Thermopol反应缓冲液 10X 2.5μl
MgSO<sub>4</sub> 100mM 0.8μl
KCl 100mM 3μl
dNTP 10mM 3μl
SYBR Green I 10X 0.08μl
Bst DNA聚合酶 8 000U/mL 1μl
甜菜碱 10mM 2.5μl
RNase-free water —— 9.02μl
实施例3
产毒艰难梭菌的LAMP检测方法的特异性检测。
分别以副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌、沙门氏菌基因组DNA为模板(湖南省疾病预防控制中心)，以RNase-free water为阴性对照，以同时具有tcdA、tcdB、cdtA以及cdtB毒素基因的艰难梭菌产毒株(来自湘雅医院医院感染控制中心，湖南省医院感染管理质量控制中心)为阳性对照，采用实施例2中用于检测gluD基因的LAMP检测试剂盒、用于检测tcdA基因的LAMP检测试剂盒、用于检测tcdB基因的LAMP检测试剂盒、用于检测cdtA基因的LAMP检测试剂盒、用于检测cdtB基因的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测，63℃、恒温60min；检测结果如图1至5所示。
图1为用艰难梭菌gluD引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。荧光强度曲线显示只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的gluD，其余均未检测到艰难梭菌gluD。说明本发明的艰难梭菌gluD的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌gluD。
图2为用艰难梭菌tcdA引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。荧光强度曲线显示只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的tcdA，其余均未检测到艰难梭菌tcdA。说明本发明的艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdA。
图3为用艰难梭菌tcdB引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。荧光强度曲线显示只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的tcdB，其余均未检测到艰难梭菌tcdB。说明本发明的艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdB。
图4为用艰难梭菌cdtA引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。荧光强度曲线显示只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的cdtA，其余均未检测到艰难梭菌cdtA。说明本发明的艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌cdtA。
图5为用艰难梭菌cdtB引物的LAMP检测方法特异性的PCR仪检测结果。荧光强度曲线显示只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的cdtB，其余均未检测到艰难梭菌cdtB。说明本发明的艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌cdtB。
实施例4
产毒艰难梭菌的LAMP检测方法的灵敏性检测。
提取含gluD、tcdA、tcdB、cdtA以及cdtB基因的产毒艰难梭菌总DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍)进行稀释，使总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，以RNase-free water为阴性对照。以经梯度稀释的DNA为模板，用本发明的LAMP检测方法进行灵敏度检测。
图6为艰难梭菌gluD的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。图中，从左至右，总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，未出峰的曲线为阴性对照，浓度为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl的样品有S型曲线表示检测到艰难梭菌gluD，表明本发明引物组合对艰难梭菌gluD的最低检测灵敏度为0.824pg/μl。
图7为艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。图中，从左至右，总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，未出峰的曲线为阴性对照，浓度为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl的样品有S型曲线表示检测到艰难梭菌tcdA，表明本发明引物组合对艰难梭菌tcdA的最低检测灵敏度为0.824pg/μl。
图8为艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。图中，从左至右，总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，未出峰的曲线为阴性对照，浓度为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl的样品有S型曲线表示检测到艰难梭菌tcdB，表明本发明引物组合对艰难梭菌tcdB的最低检测灵敏度为0.824pg/μl。
图9为艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。图中，从左至右，总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，未出峰的曲线为阴性对照，浓度为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl的样品有S型曲线表示检测到艰难梭菌cdtA，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtA的最低检测灵敏度为0.824pg/μl。
图10为艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法灵敏度的PCR仪检测结果。图中，从左至右，总DNA的浓度分别为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl、0.0824pg/μl，未出峰的曲线为阴性对照，浓度为8.24ng/μl、824pg/μl、82.4pg/μl、8.24pg/μl、0.824pg/μl的样品有S型曲线表示检测到艰难梭菌cdtB，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtB的最低检测灵敏度为0.824pg/μl。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南融健基因生物科技有限公司
<120> 用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，做为检测gluD基因的引物F3
<400> 1
ggtgttataa ctggtaagcc a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 根据实验要求而设计，做为检测gluD基因的引物B3
<400> 2
ttcagccata gctacaaca 19
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> 根据实验要求而设计，做为检测gluD基因的引物FIP
<400> 3
cttgctgtaa cagcaacacc aagaatttgg tggttcttta ggaag 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> allele
<222> (1)..(45)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测gluD基因的引物BIP
<400> 4
tagctgttca aggtatagga aacgtaccac caagtttttc acagt 45
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdA基因的引物F3
<400> 5
tccaatacaa gccctgtag 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdA基因的引物B3
<400> 6
gaatctcttc ctctagtagc t 21
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdA基因的引物FIP
<400> 7
ctgcattaat atcagcccat tgtttattta cattttgtat ggataggtgg 50
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdA基因的引物BIP
<400> 8
aactgtggta tgatagtgaa gcatttcagt ggtagaagat tcaact 46
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdB基因的引物F3
<400> 9
tgatagtata atggctgaag ct 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdB基因的引物B3
<400> 10
gagatttcaa agtttcttaa gtcag 25
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdB基因的引物FIP
<400> 11
catctgggaa gaaaccaact cttagcagat aatggtagat ttatgatgg 49
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测tcdB基因的引物BIP
<400> 12
aagtggccct gaagcatatg ccaaatggat attcatacta ccttct 46
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtA基因的引物F3
<400> 13
tctggtcctc aagaatttgg 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtA基因的引物B3
<400> 14
tgatagataa gctccaggag a 21
<210> 15
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(47)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtA基因的引物FIP
<400> 15
gcttgtcctt cccattttga tttaatttaa ctcttacttc ccctgaa 47
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtA基因的引物BIP
<400> 16
attggtagtg tgaatatgag tgcaaccttt aggtatagtt atacgtagt 49
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtB基因的引物F3
<400> 17
gagtcaaata ctgctggaga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtB基因的引物B3
<400> 18
tagtagctct ggaaacagtt 20
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtB基因的引物FIP
<400> 19
cggatctctt gcttcagtct ttcagattat gaaaaagctt caggtt 46
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(44)
<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测cdtB基因的引物BIP
<400> 20
agttgcagca tatccaattg ttggccttga tcagtagagg catg 44

Claims (10)

1.一种用于检测艰难梭菌基因的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物为用于检测gluD基因的引物组合物、用于检测tcdA基因的引物组合物、用于检测tcdB基因的引物组合物、用于检测cdtA基因的引物组合物和用于检测cdtB基因的引物组合物中的一种或多种；
所述用于检测gluD基因的引物组合物包括gluD-F3、gluD-B3、gluD-FIP、gluD-BIP，所述gluD-F3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述gluD-B3的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述gluD-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述gluD-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；
所述用于检测tcdA基因的引物组合物包括tcdA-F3、tcdA-B3、tcdA-FIP、tcdA-BIP，所述tcdA-F3的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述tcdA-B3的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，所述tcdA-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，所述tcdA-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；
所述用于检测tcdB基因的引物组合物包括tcdB-F3、tcdB-B3、tcdB-FIP、tcdB-BIP，所述tcdB-F3的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，所述tcdB-B3的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，所述tcdB-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.11所示，所述tcdB-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.12所示；
所述用于检测cdtA基因的引物组合物包括cdtA-F3、cdtA-B3、cdtA-FIP、cdtA-BIP，所述cdtA-F3的DNA序列如SEQ ID NO.13所示，所述cdtA-B3的DNA序列如SEQ ID NO.14所示，所述cdtA-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.15所示，所述cdtA-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.16所示；
所述用于检测cdtB基因的引物组合物包括cdtB-F3、cdtB-B3、cdtB-FIP、cdtB-BIP，所述cdtB-F3的DNA序列如SEQ ID NO.17所示，所述cdtB-B3的DNA序列如SEQ ID NO.18所示，所述cdtB-FIP的DNA序列如SEQ ID NO.19所示，所述cdtB-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.20所示。
2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物、dNTP、聚合酶、反应缓冲液、荧光试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括甜菜碱、MgSO4和KCl。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光试剂为SYBR Green I。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中，gluD-FIP和gluD-BIP︰gluD-F3和gluD-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，tcdA-FIP和tcdA-BIP︰tcdA-F3和tcdA-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，tcdB-FIP和tcdB-BIP︰tcdB-F3和tcdB-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，cdtA-FIP和cdtA-BIP︰cdtA-F3和cdtA-B3的摩尔比为4︰1；
和/或，cdtB-FIP和cdtB-BIP︰cdtB-F3和cdtB-B3的摩尔比为4︰1。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述dNTP的浓度为1.2mM，所述聚合酶为8U Bst DNA聚合酶，所述反应缓冲液为1X Thermopol反应缓冲液，所述甜菜碱的浓度为1M，所述MgSO4的浓度为3.2mM、所述KCl的浓度为12mM，所述荧光染料为0.8X SYBR Green I。
7.一种权利要求2至6中任一项所述试剂盒在艰难梭菌的LAMP检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将待测物基因组的模板DNA置于试剂盒中进行LAMP扩增，用PCR仪实时检测开始反应后反应液的荧光强度，根据荧光强度曲线确定所述反应液中是否存在艰难梭菌以及产毒艰难梭菌产毒类型。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，当试剂盒中所述用于检测gluD基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线，其他引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中存在非产毒艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因、tcdB基因的引物组合物或所述用于检测gluD基因、tcdA基因和tcdB基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线，其他引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中存在产毒艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因、tcdB基因、cdtA基因和cdtB基因的引物组合物或所述用于检测gluD基因、tcdA基因、tcdB基因、cdtA基因和cdtB基因的引物组合物与待测样品反应出现S型曲线时，表示待测样品中存在毒素加强型艰难梭菌；
当试剂盒中所述用于检测gluD基因的引物组合物与待测样品反应不出现S型曲线时，表示待测样品中不存艰难梭菌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增的条件为在63℃下恒温45min～90min。
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