CN104328204A - 艰难梭菌ab毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明是根据艰难梭菌特异性保守基因tcdA和tcdB设计引物，然后以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增，再通过反应液的颜色变化或反应液浊度变化同步定性检测待测样品中的艰难梭菌产毒株。本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位及各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒，属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法技术领域。
背景技术
艰难梭菌（Clostridium difficile，Cd）为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于水、土壤等自然环境及动物和人的粪便中。艰难梭菌是一种条件致病菌，本身没有侵袭性，当人体肠道正常微环境遭到破坏时，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)。在医院获得感染性腹泻所明确的病原体中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占15%~25%。而伪膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。CDI具有复发率高、耐药率高、难治率高、死亡率高、医疗费用高等特点。
艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株主要分泌毒素A和毒素B，分别由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受tcdR、tcdC、tcdE调节。毒素A又称肠毒素，易使回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素B的毒力较毒素A强10倍。一般认为毒素A在艰难梭菌感染的发病中起重要作用，毒素B只起辅助作用，并不能单独导致感染。然而，近年来有研究表明，毒素B对于艰难梭菌感染的发生、发展至关重要，只产生毒素A的艰难梭菌菌株是没有毒性的（Savidge TC, Pan WH, Newman P, O'brien M, Anton PM, Pothoulakis C. Clostridium difficile toxin B is an inflammatory enterotoxin in human intestine. Gastroenterology. 2003;125(2)：413-420.）。在艰难梭菌感染患者的粪便中已发现毒素A阴性、毒素B阳性的菌株；而毒素A阳性，毒素B阴性的菌株尚未被发现，表明毒素B可以单独致病。据国外综合医院统计，A(+)B(+)占艰难梭菌的57%，A(-)B(+)占34%，A(-)B(-)占9%。而A(-)B(+)占艰难梭菌产毒株的10%，临床症状比A(+)B(+)更严重，可出现脱水、低血压性休克、死亡率较高，耐药性更高（Wilkins TD, Lyerly DM. Clostridium difficile testing： after 20 years, still challenging. J Clin Microbiol. 2003;41(2)：531-534.）。随着全球范围内艰难梭菌感染的暴发流行增多，艰难梭菌感染快速而特异的实验室检测对于疾病感染的控制和临床诊治显得迫切重要。而选择tcdA和tcdB作为检测艰难梭菌的目的基因，能全面、特异的鉴定临床产毒株型艰难梭菌。
目前，粪便中艰难梭菌实验室检测包括作为检测“金标准”的艰难梭菌毒素检测及细胞毒素中和试验，但因培养条件及技术要求高、耗时长，难以用于临床常规检测。国内外广泛应用的酶联免疫试验(EIA)则快速、特异，不敏感；而乳胶凝集试验(GDH)则快速、敏感，但该方法存在交叉反应、假阳性率高，特异性差等缺点。利用普通PCR可检测艰难梭菌，但因实验设备要求高、操作复杂、速度慢，扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤，不适合基层医院及现场快速检测的应用。因此，寻找快速、特异、敏感的艰难梭菌检测方法是艰难梭菌感染研究领域的热点。
随着分子诊断技术的不断进步，T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术—环介导恒温扩增技术（LAMP），该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在恒温（63~67℃）的条件下，利用高活性链置换DNA聚合酶（BstDNA聚合酶），使得链置换DNA合成在不停地自我循环，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生，从而实现对目的基因的快速检测。该方法检测时间短（30~60min），无需特殊仪器，操作简便，配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结果。LAMP方法目前已成功应用于细菌、病毒及寄生虫的定性和定量检测、胎儿性别鉴定和其他方面，成为常用的临床快速检验方法之一。2005年，日本Haru Kato等（Kato, H. and T. Yokoyama, et al. (2005). Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification.J Clin Microbiol 43(12)： 6108-12.）提出运用LAMP法针对tcdB基因设计6条引物检测艰难梭菌，通过浊度仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳判读结果，检测结果特异、敏感、快速，不足之处在于无法检测艰难梭菌是否携带tcd A基因，不利于艰难梭菌毒素分型，结果判读方式繁琐、需借助相关仪器，无法实现肉眼快速判读结果。刘畅等分别在2012年（刘畅，蒋栋能，蒲晓允.快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究[J].国际检验医学杂志.2012（20））和2013年（Liu, C. and D. N. Jiang, et al. (2013). "DNA detection of Clostridium difficile infection based on real-time resistance measurement." Genet Mol Res 12(3)： 3296-304.）提出：针对tcdA基因设计4条引物检测艰难梭菌，分别通过实时电阻测量和显色试剂判读结果，LAMP法特异、敏感、快速，适合现场和基层推广，不足之处在于无法检测艰难梭菌tcdB携带情况。目前缺乏针对艰难梭菌tcdA基因和tcdB基因设计特异性引物，通过显色试剂判读结果来实现快速、简便、特异、灵敏的同步检测艰难梭菌tcdA和tcdB。
发明内容
本发明的目的是提供一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及应用于该LAMP检测方法的专用引物。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒。
本发明的技术方案如下。
一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）引物的设计：分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物；
（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在步骤（1）获得引物的引导下进行LAMP扩增；所述待测物包括人及动物的粪便或培养分离的菌株；
（3）反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，反应后根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测扩增反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因。
经上述艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法步骤（1）设计优化获得一种用于对艰难梭菌tcdA、tcdB进行LAMP检测的专用引物如下：
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT
B3：ATTTTATCATTTCCCAACGGT
FIP：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG
BIP：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC
LF： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA
LB：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA
所述tcdA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1；
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC
B3：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC
FIP：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT
BIP：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC
LF： AATAGTTGCAATTATAGG
LB：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG
所述tcdB引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1。
采用本发明的检测方法，以上述专用引物进行LAMP扩增反应条件可为：检测tcdA时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min；检测tcdB时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min。
优选的，所述的LAMP扩增反应条件为：检测tcdA时，扩增反应体系在61℃下恒温60min；检测tcdB时，扩增反应体系在60℃下恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，扩增反应体系在60℃下恒温60min。
本发明的检测方法中所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl（终反应体系26μl），所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰。
以上述专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系优选如下：待测物的基因组DNA 2μl、20 mM Tris·HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、0.1%Tween20，0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO4、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、专用引物、加双蒸水至总容量25μL；所述的专用引物及其加入量为：tcdA引物：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），所述tcdA引物的引物对（FIP和BIP）、（LF和LB）、（F3和B3）中各条引物的混合比例优选为等量混合； tcdB引物：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），所述tcdB引物的引物对（FIP和BIP）、（LF和LB）、（F3和B3）中各条引物的混合比例优选为等量混合。
一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，包含有上述用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物。
所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系（如：双蒸水）。
优选的，所述试剂盒中包括：20 mM Tris·HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO4、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、tcdA引物、tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA 和双蒸水；tcdA引物为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），tcdB引物为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3）。
本发明相对于现有技术的有益效果如下：采取以上设计，本发明具有以下优点：
（1）高特异性：6条引物对艰难梭菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；
（2）高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；
（3）结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果（钙黄绿素显色原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化，反应前在扩增加入钙黄绿素显色剂，反应后反应液颜色变绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）），或者直接用浊度仪判断结果（LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应），反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）；
（4）操作简单：只要将检测样品（靶核酸）和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅或金属浴中60分钟后就可以判断结果；
（5）快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL；
（6）同步：可同步检测tcdA和tcdB，快速检测艰难梭菌产毒株。
本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为实施2艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
图2为实施2艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
图3为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
图4为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
图5为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
图6为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
图7为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
图8为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
图9为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。
图10为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。
图11为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
图12为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1 通过以下步骤实施本发明：
1、用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物设计
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌tcdA重复序列（GenBank： X92982.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQ ID NO：1），再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物序列如表1。
表1 用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdA引物
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌tcdB重复序列（GenBank： KC292192.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQ ID NO：2），再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物序列如表2。
表2 用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdB引物
2、艰难梭菌的LAMP检测：分别用实施例1获得的用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdA引物（tcdA引物的序列见序列表中SEQ ID NO：3）和tcdB引物（tcdB引物的序列见序列表中SEQ ID NO：4）对艰难梭菌标准株API10463（来自南方医科大学南方医院消化内科，广东省胃肠疾病重点实验室）进行LAMP检测，步骤如下：
（1）以艰难梭菌标准株API10463的基因组DNA为模板，在实施例1获得的tcdA引物和tcdB引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25ul LAMP反应体系包括：待测物的基因组DNA 2μl，20 mM Tris·HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO4，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶， tcdA引物、tcdB引物（其中，tcdA引物及其加入量为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合； tcdB引物及其加入量为：40pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），所述引物对中各条引物等量混合）、加双蒸水ddH2O至总容量25μL；LAMP的扩增条件为：将反应体系置60-65℃，恒温60min；
（2）结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加1μl的（终反应体系为26μl）含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，反应液颜色变绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）。
实施例2 本发明艰难梭菌LAMP检测方法最佳温度筛选实验：采用实施例1的引物及扩增反应体系，在相同反应体系下，对不同反应条件（温度）下艰难梭菌的基因组DNA进行LAMP检测，以获得扩增反应的最佳反应温度。
经试验，本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图1所示）：置58-69℃恒温60min反应条件下的最佳温度为61℃。本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图2所示）：置58-69℃恒温60min反应条件下的最佳温度为60℃。如艰难梭菌tcdA和tcdB同时检测，最佳反应条件为：60℃，恒温60min。
实施例3 本发明艰难梭菌的LAMP检测方法的特异性检测。
一、本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌 O139 群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌、布氏不动杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度的艰难梭菌LAMP检测方法的特异性。
本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图3所示，钙黄绿素染色检测结果如图5所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌 O139 群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14：鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：布氏不动杆菌，27：阳性对照，28：阴性对照）。
图3浊度曲线显示只有阳性对照曲线（艰难梭菌）发生了上升，其他曲线均没有变化； 图5中可以看出只有阳性对照（27号）显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌tcdA，其余均未检测到艰难梭菌tcdA。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdA。
二、本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌 O139 群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌、布氏不动杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度艰难梭菌的LAMP检测方法的特异性。
本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图4所示，钙黄绿素染色检测结果如图6所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌 O139 群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14：鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：阳性对照，27：布氏不动杆菌，28：阴性对照）。
图4浊度曲线显示只有阳性对照曲线（艰难梭菌）发生了上升，其他曲线均没有变化； 图6中可以看出只有阳性对照（26号）显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌tcdB，其余均未检测到艰难梭菌tcdB。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdB。
实施例4 本发明艰难梭菌的LAMP检测方法的灵敏度检测。
一、本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌tcdA的灵敏度，方法为：提取艰难梭菌标准株API10463总DNA，然后以10倍梯度（1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍）进行稀释，使1-10模板中总DNA的浓度分别为207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11模板为阴性对照（去离子水），再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列为NK1和NK2，如表3所示）进行灵敏度检测。
表3用于PCR方法的引物序列
。
本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图7所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、 0.207pg/μl、 0.0207pg/μl、 0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），代号1-5号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌tcdA，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图9所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、 0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），其中1-5号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌tcdA，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；PCR检测结果如图11所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水），M：DNA marker D2000），其中1-4号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为207pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法可检测到20.7pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到207pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
二、本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌tcdB的灵敏度，提取艰难梭菌标准株API10463总DNA和10倍梯度稀释方法与上述检测艰难梭菌tcdB的灵敏度操作相同，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列NK104和NK105，如表4所示）进行灵敏度检测。
表4用于PCR方法的引物序列
。
本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图8所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），代号1-5号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌tcdB，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图10所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、 0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），其中1-5号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌tcdB，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；PCR检测结果如图12所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、 0.0207pg/μl、 0.00207 pg/μl、0.000207 pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水），M：DNA marker D2000），其中1-4号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为207pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法可检测到20.7pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到207pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
实施例5 用于艰难梭菌的LAMP检测的试剂盒：将20 mM Tris·HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，0.1%Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO4，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶， tcdA引物、tcdB引物（其中，tcdA引物及其加入量为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合； tcdB引物及其加入量为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合）、钙黄绿素指示剂（用染色法检测时使用）以及作为阳性对照的艰难梭菌的基因组DNA 2μl、作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系（双蒸水）共同包装，再配以产品使用说明书（记载染色法和浊度法两种检测方法），得到同时用于检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒。
<110>申请人名称：南方医科大学南方医院
<120> 艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211>1991
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
atgtctttaa tatctaaaga agagttaata aaactcgcat atagcattag accaagagaa 60
aatgagtata aaactatact aactaattta gacgaatata ataagttaac tacaaacaat 120
aatgaaaata aatatttgca attaaaaaaa ctaaatgaat caattgatgt ttttatgaat 180
aaatataaaa cttcaagcag aaatagagca ctctctaatc taaaaaaaga tatattaaaa 240
gaagtaattc ttattaaaaa ttccaataca agccctgtag aaaaaaattt acattttgta 300
tggataggtg gagaagtcag tgatattgct cttgaataca taaaacaatg ggctgatatt 360
aatgcagaat ataatattaa actgtggtat gatagtgaag cattcttagt aaatacacta 420
aaaaaggcta tagttgaatc ttctaccact gaagcattac agctactaga ggaagagatt 480
caaaatcctc aatttgataa tatgaaattt tacaaaaaaa ggatggaatt tatatatgat 540
agacaaaaaa ggtttataaa ttattataaa tctcaaatca ataaacctac agtacctaca 600
atagatgata ttataaagtc tcatctagta tctgaatata atagagatga aactgtatta 60
gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720
gctaatagtt tgtttacaga acaagagtta ttaaatattt atagtcagga gttgttaaat 780
cgtggaaatt tagctgcagc atctgacata gtaagattat tagccctaaa aaattttggc 840
ggagtatatt tagatgttga tatgcttcca ggtattcact ctgatttatt taaaacaata 900
tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960
aagtataaaa aatatataaa taattataca tcagaaaact ttgataaac ttgatcaacaa 1020
ttaaaagata attttaaact cattatagaa agtaaaagtg aaaaatctga gatattttct 1080
aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140
gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200
caagtaaaaa atagatatca atttttaaac caacacctta acccagccat agagtctgat 1260
aataacttca cagatactac taaaattttt catgattcat tatttaattc agctaccgca 1320
gaaaactcta tgtttttaac aaaaatagca ccatacttac aagtaggttt tatgccagaa 1380
gctcgctcca caataagttt aagtggtcca ggagcttatg cgtcagctta ctatgatttc 1420
ataaatttac aagaaaatac tatagaaaaa actttaaaag catcagattt aatagaattt 1480
aaattcccag aaaataatct atctcaattg acagaacaag aaataaatag tctatggagc 1520
tttgatcaag caagtgcaaa atatcaattt gagaaatatg taagagatta tactggtgga 1580
tctctttctg aagacaatgg ggtagacttt aataaaaata ctgccctcga caaaaactat 1640
ttattaaata ataaaattcc atcaaacaat gtagaagaag ctggaagtaa aaattatgtt 1700
cattatatca tacagttaca aggagatgat ataagttatg aagcaacatg caatttattt 1760
tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1820
tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920
agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980
aacacaagcg a
<210> 2
<211> 8001
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60
gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120
actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180
gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240
acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300
gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360
gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420
ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480
ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540
gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600
ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660
cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720
agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780
gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840
ggtggtatgt atttagatgt tgatatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900
atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960
atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020
gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080
tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140
ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200
aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260
gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320
gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380
gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagcat atgcggcagc ttatcaagat 1440
ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500
tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc tagcttatgg 1560
tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620
ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680
tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740
attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800
actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860
tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920
tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980
gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040
tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160
gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220
caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280
tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340
atcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400
ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460
ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520
attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580
ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640
tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700
attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760
tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820
aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880
gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940
ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000
attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060
ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120
ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180
gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240
tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300
gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360
gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420
gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480
tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540
actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600
tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660
gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720
agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780
gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840
agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900
ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960
ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020
agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080
aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140
aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200
tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260
ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320
aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380
ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440
gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500
gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560
aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620
tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680
ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740
ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800
aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860
tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920
ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980
tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040
ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100
gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160
gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220
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tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340
tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400
ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460
gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520
tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580
gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640
attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700
acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760
gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatga 5820
aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880
gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940
tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000
gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060
gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120
catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180
aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta cagctgtagt tggatggaa 6240
gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300
ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360
tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420
gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480
gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540
atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggggaaga tgtatattat 6600
tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660
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ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780
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caattagtga ttagtgaata g
<210> 3
<211> 215
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
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cctagctcta ttggactaga ccgttgggaa atgat
<210> 4
<211> 1372
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attataaagg atatttcatc aaaagaatat atatcattta atcctaaaga aaataaaatt 60
acagtaaaat ctaaaaattt acctgagcta tctacattat tacaagaaat tagaaataat 120
tctaattcaa gtgatattga actagaagaa aaagtaatgt taacagaatg tgagataaat 180
gttatttcaa atatagatac gcaaattgtt gaggaaagga ttgaagaagc taagaattta 240
acttctgact ctattaatta tataaaagat gaatttaaac taatagaatc tatttctgat 300
gcactatgtg acttaaaaca acagaatgaa ttagaagatt ctcattttat atcttttgag 360
gacatatcag agactgatga gggatttagt ataagattta ttaataaaga aactggagaa 420
tctatatttg tagaaactga aaaaacaata ttctctgaat atgctaatca tataactgaa 480
gagatttcta agataaaagg tactatattt gatactgtaa atggtaagtt agtaaaaaaa 540
gtaaatttag atactacaca cgaagtaaat actttaaatg ctgcattttt tatacaatca 600
ttaatagaat ataatagttc taaagaatct cttagtaatt taagtgtagc aatgaaagtc 660
caagtttacg ctcaattatt tagtactggt ttaaatacta ttacagatgc agccaaagtt 720
gttgaattag tatcaactgc attagatgaa actatagact tacttcctac attatctgaa 780
ggattaccta taattgcaac tattatagat ggtgtaagtt taggtgcagc aatcaaagag 840
ctaagtgaaa cgagtgaccc attattaaga caagaaatag aagctaagat aggtataatg 900
gcagtaaatt taacaacagc tacaactgca atcattactt catctttggg gatagctagt 960
ggatttagta tacttttagt tcctttagca ggaatttcag caggtatacc aagcttagta 1020
aacaatgaac ttgtacttcg agataaggca acaaaggttg tagattattt taaacatgtt 1080
tcattagttg aaactgaagg agtatttact ttattagatg ataaaataat gatgccacaa 1140
gatgatttag tgatatcaga aatagatttt aataataatt caatagtttt aggtaaatgt 1200
gaaatctgga gaatggaagg tggttcaggt catactgtaa ctgatgatat agatcacttc 1260
ttttcagcac catcaataac atatagagag ccacacttat ctatatatga cgtattggaa 1320
gtacaaaaag aagaacttga tttgtcaaaa gatttaatgg tattacctaa tg
Claims (10)
1.一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）引物的设计：分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物；
（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增；所述待测物为人及动物的粪便或培养分离的菌株；
（3）反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，反应后，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测扩增反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因。
2.根据权利要求1所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：经所述步骤（1）设计优化获得用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物如下：
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT
B3：ATTTTATCATTTCCCAACGGT
FIP：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG
BIP：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC
LF： CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA
LB：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA
所述tcdA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1；
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC
B3：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC
FIP：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT
BIP：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC
LF： AATAGTTGCAATTATAGG
LB：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG
所述tcdB引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1。
3.根据权利要求1或2所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：以所述步骤（1）获得的引物按步骤（2）进行LAMP扩增的反应条件为：检测tcdA时，在58-69℃恒温60min；检测tcdB时，在58-69℃恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，在58-69℃恒温60min。
4.根据权利要求3所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应条件为：检测tcdA时，在61℃恒温60min；检测tcdB时，在60℃恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，在60℃恒温60min。
5.根据权利要求1所述的艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰。
6.根据权利要求2所述的艰难梭菌AB毒素LAMP检测方法，其特征在于：以所述的专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系如下：待测物的基因组DNA 2μl、20 mM Tris·HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、0.1%Tween20，0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO4、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、专用引物、加双蒸水至总容量25μL；所述专用引物及其加入量为：tcdA引物：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LB 和LF），5 pmol（F3 and B3）；检测tcdB时， tcdB引物：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LB 和LF），5 pmol（F3 and B3）。
7.一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物。
8.根据权利要求7所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。
9.根据权利要求7所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：20 mM Tris·HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO4、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、tcdA引物、tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA 和双蒸水；tcdA引物为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3），tcdB引物为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3）。
10.根据权利要求7~9中任一项所述的同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒可同步定性检测艰难梭菌tcdA和tcdB。
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