JP2003116579A - 食中毒細菌の有する耐熱性溶血毒素関連遺伝子（ｔｄｈ関連毒素遺伝子）を網羅的に検出・定量することによる溶血毒素産生細菌の検出・定量方法 - Google Patents
食中毒細菌の有する耐熱性溶血毒素関連遺伝子（ｔｄｈ関連毒素遺伝子）を網羅的に検出・定量することによる溶血毒素産生細菌の検出・定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ビブリオ属病原菌が産生する耐熱性溶血毒素群
タンパク群［TDH、TRH及び類似する溶血毒素タンパク質
を意味する：以下TDH関連毒素と呼ぶ］の遺伝子を、簡
便迅速、かつ正確に、検出、定量、型別するものであ
り、食品衛生管理上重要なTDH関連毒素産生性の細菌自
体の検出及び定量できる方法を提供すること。 【解決手段】 TDHおよびTRHに共通するアミノ酸配列を
コードする遺伝子配列を含む１組のプライマーを用い
て、TDH関連毒素の遺伝子を網羅的に検出、定量するこ
とにより、TDH関連毒素産生性の細菌自体の検出及び定
量を可能とした。
タンパク群［TDH、TRH及び類似する溶血毒素タンパク質
を意味する：以下TDH関連毒素と呼ぶ］の遺伝子を、簡
便迅速、かつ正確に、検出、定量、型別するものであ
り、食品衛生管理上重要なTDH関連毒素産生性の細菌自
体の検出及び定量できる方法を提供すること。 【解決手段】 TDHおよびTRHに共通するアミノ酸配列を
コードする遺伝子配列を含む１組のプライマーを用い
て、TDH関連毒素の遺伝子を網羅的に検出、定量するこ
とにより、TDH関連毒素産生性の細菌自体の検出及び定
量を可能とした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腸炎ビブリオ(Vib
rio parahaemolyticus)、コレラ菌(Vibrio cholerae)の
一部、ビブリオミミカス (Vibrio mimicus)、ビブリオ
ホリセー(Vibrio hollisae)等のビブリオ属病原菌が産
生する耐熱性溶血毒素タンパク群［TDH（Thermostable
direct hemolysin）、TRH（TDH related hemolysin）及
び類似する溶血毒素タンパク質を意味する。以下TDH関
連毒素と呼ぶ。］の遺伝子を、簡便迅速かつ正確に検出
・定量・型別する方法に係わるもので、水産業、食品
業、公衆衛生分野、及び臨床検査分野等に関する。
rio parahaemolyticus)、コレラ菌(Vibrio cholerae)の
一部、ビブリオミミカス (Vibrio mimicus)、ビブリオ
ホリセー(Vibrio hollisae)等のビブリオ属病原菌が産
生する耐熱性溶血毒素タンパク群［TDH（Thermostable
direct hemolysin）、TRH（TDH related hemolysin）及
び類似する溶血毒素タンパク質を意味する。以下TDH関
連毒素と呼ぶ。］の遺伝子を、簡便迅速かつ正確に検出
・定量・型別する方法に係わるもので、水産業、食品
業、公衆衛生分野、及び臨床検査分野等に関する。
【０００２】
【従来の技術】腸炎ビブリオ (Vibrio parahaemolyticu
s)、コレラ菌 (Vibrio cholerae)の一部、ビブリオミミ
カス (Vibrio mimicus)、ビブリオホリセー (Vibrio ho
llisae)等のビブリオ属病原菌は、経口感染により重篤
な症状を引き起こし、時には患者を死に至らしめる、食
品衛生管理上の重要な細菌種群である。我が国において
は腸炎ビブリオ食中毒の発生件数が特に多く、常に食中
毒原因の上位を占めている。この為、主たる感染原因で
ある生食用魚介類等では、腸炎ビブリオの検査が義務づ
けられている。腸炎ビブリオは、耐熱性溶血毒素タンパ
ク質 (Thermostable direct hemolysin : TDH)、及びそ
の類似毒素タンパク質 (TDH related hemolysin: TRH)
の遺伝子を保有する一部の菌のみが食中毒の原因菌とな
る。食品衛生の現場では、食品（生鮮魚介類等）から単
離される腸炎ビブリオ菌には一定以上の比率で毒素産生
菌が存在するという前提に基づき、食品に存在する腸炎
ビブリオの総菌数に許容値の上限を設定して管理が行わ
れている。即ち、「食品衛生検査指針」に準拠して腸炎
ビブリオと疑われる菌数を計数し、基準値以下（100CFU
/g以下）であれば食用に供して良いとされている。（厚
生労働省通達 食基発第22号）前述の如く、病原性があ
る腸炎ビブリオは、TDH又はTRHの産生能を有する菌のみ
である。また、TDHは、腸炎ビブリオ以外のビブリオ属
細菌にも存在している。故に、広く食中毒予防という観
点からは、腸炎ビブリオの菌数では無く、TDH又はTRHの
産生能を有する菌の有無や菌数を指標とした管理を行い
得る事が望ましい。
s)、コレラ菌 (Vibrio cholerae)の一部、ビブリオミミ
カス (Vibrio mimicus)、ビブリオホリセー (Vibrio ho
llisae)等のビブリオ属病原菌は、経口感染により重篤
な症状を引き起こし、時には患者を死に至らしめる、食
品衛生管理上の重要な細菌種群である。我が国において
は腸炎ビブリオ食中毒の発生件数が特に多く、常に食中
毒原因の上位を占めている。この為、主たる感染原因で
ある生食用魚介類等では、腸炎ビブリオの検査が義務づ
けられている。腸炎ビブリオは、耐熱性溶血毒素タンパ
ク質 (Thermostable direct hemolysin : TDH)、及びそ
の類似毒素タンパク質 (TDH related hemolysin: TRH)
の遺伝子を保有する一部の菌のみが食中毒の原因菌とな
る。食品衛生の現場では、食品（生鮮魚介類等）から単
離される腸炎ビブリオ菌には一定以上の比率で毒素産生
菌が存在するという前提に基づき、食品に存在する腸炎
ビブリオの総菌数に許容値の上限を設定して管理が行わ
れている。即ち、「食品衛生検査指針」に準拠して腸炎
ビブリオと疑われる菌数を計数し、基準値以下（100CFU
/g以下）であれば食用に供して良いとされている。（厚
生労働省通達 食基発第22号）前述の如く、病原性があ
る腸炎ビブリオは、TDH又はTRHの産生能を有する菌のみ
である。また、TDHは、腸炎ビブリオ以外のビブリオ属
細菌にも存在している。故に、広く食中毒予防という観
点からは、腸炎ビブリオの菌数では無く、TDH又はTRHの
産生能を有する菌の有無や菌数を指標とした管理を行い
得る事が望ましい。
【０００３】腸炎ビブリオ以外のビブリオ属において
も、ビブリオコレラ非O1(Vibrio chorelae non-O1)、ビ
ブリオホリセー、ビブリオミミカスの一部の株でTDH産
生遺伝子tdhを有する株が存在することが報告されてい
る（1986年 Infect. Immun., 52, 319-322, 1989年 J.
Bacteriol., 171,6859-6861, 1990年 FEMS Microbiol.
Lett.,84,249-254）。即ち、TDH関連毒素タンパク質
は、ビブリオ属病原細菌自体の系統とは無関係に進化し
た物であり、水平伝播により各毒素が独立の過程でビブ
リオ属病原細菌に獲得されてきた事が明らかにされてい
る（1991年 J. Bacteriol.,173,5036-5046）。従って、
既知の毒素産生菌以外の菌種がTDH関連毒素の遺伝子を
獲得・保有している可能性が認められる。この観点から
もTDH関連毒素タンパク質の産生能を有する細菌自体の
検出と定量が、食品衛生管理の現場では、理想的である
と言える。しかしながら、汎用性と信頼性に優れたTDH
関連毒素の検出・定量の手段は存在しておらず、食品衛
生管理の現場で検査を実施する事は不可能であった。
も、ビブリオコレラ非O1(Vibrio chorelae non-O1)、ビ
ブリオホリセー、ビブリオミミカスの一部の株でTDH産
生遺伝子tdhを有する株が存在することが報告されてい
る（1986年 Infect. Immun., 52, 319-322, 1989年 J.
Bacteriol., 171,6859-6861, 1990年 FEMS Microbiol.
Lett.,84,249-254）。即ち、TDH関連毒素タンパク質
は、ビブリオ属病原細菌自体の系統とは無関係に進化し
た物であり、水平伝播により各毒素が独立の過程でビブ
リオ属病原細菌に獲得されてきた事が明らかにされてい
る（1991年 J. Bacteriol.,173,5036-5046）。従って、
既知の毒素産生菌以外の菌種がTDH関連毒素の遺伝子を
獲得・保有している可能性が認められる。この観点から
もTDH関連毒素タンパク質の産生能を有する細菌自体の
検出と定量が、食品衛生管理の現場では、理想的である
と言える。しかしながら、汎用性と信頼性に優れたTDH
関連毒素の検出・定量の手段は存在しておらず、食品衛
生管理の現場で検査を実施する事は不可能であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前述の如く、TDH関連
毒素タンパク質の産生能を有する細菌自体の検出と定量
が、食品衛生管理の現場では理想的である。この目的に
は、TDH関連毒素タンパク質をコードする遺伝子の網羅
的検出と、コピー数の定量が適している。TDH関連毒素
タンパク質を検出・定量するにより、同毒素を有し病原
性を持つ可能性の有る菌を検出・定量することができ
る。
毒素タンパク質の産生能を有する細菌自体の検出と定量
が、食品衛生管理の現場では理想的である。この目的に
は、TDH関連毒素タンパク質をコードする遺伝子の網羅
的検出と、コピー数の定量が適している。TDH関連毒素
タンパク質を検出・定量するにより、同毒素を有し病原
性を持つ可能性の有る菌を検出・定量することができ
る。
【０００５】しかしながら、本法による検査には大きな
技術的問題が存在している。即ち、TDH関連毒素タンパ
ク群の既知遺伝子全タイプを、同時に網羅的に検出する
方法が存在していなかった。この為、PCR法等のプライ
マーを用いた遺伝子増幅・検出を行う場合、各タイプ個
別にプライマーのデザインを行う必要があり、検査に当
たっても複数のプライマーを併用する必要がある為、実
用的ではなかった。また、後述の如く、現在存在するプ
ライマーの組み合わせでは、全てのTDH関連毒素遺伝子
を検出できない可能性が高い。
技術的問題が存在している。即ち、TDH関連毒素タンパ
ク群の既知遺伝子全タイプを、同時に網羅的に検出する
方法が存在していなかった。この為、PCR法等のプライ
マーを用いた遺伝子増幅・検出を行う場合、各タイプ個
別にプライマーのデザインを行う必要があり、検査に当
たっても複数のプライマーを併用する必要がある為、実
用的ではなかった。また、後述の如く、現在存在するプ
ライマーの組み合わせでは、全てのTDH関連毒素遺伝子
を検出できない可能性が高い。
【０００６】TDHは、腸炎ビブリオ食中毒の病原因子と
関連のある神奈川現象（ヒト赤血球を溶血させる現象）
の原因物質として特定された溶血毒素である。精製され
たTDHが生菌を投与した場合と同様の性質を示すという
動物実験の結果から、TDHが病原因子であると認識され
るに至った。一方、TRHは、神奈川現象を示さない食中
毒患者由来株から発見された。 TRHはアミノ酸レベルで
TDHと約68％の相同性を示し、TDHとは異なり易熱性の溶
血毒である（1988年Infect. Immun., 56, 961-965）。
関連のある神奈川現象（ヒト赤血球を溶血させる現象）
の原因物質として特定された溶血毒素である。精製され
たTDHが生菌を投与した場合と同様の性質を示すという
動物実験の結果から、TDHが病原因子であると認識され
るに至った。一方、TRHは、神奈川現象を示さない食中
毒患者由来株から発見された。 TRHはアミノ酸レベルで
TDHと約68％の相同性を示し、TDHとは異なり易熱性の溶
血毒である（1988年Infect. Immun., 56, 961-965）。
【０００７】TRHをコードする遺伝子trhには塩基配列が
16％程度異なる2種類（trh1およびtrh2）の存在が知ら
れている（1992年Appl. Environ. Microbiol.,58,2449-
2457）。また、TDH型毒素群とTRH型毒素群のそれぞれの
アミノ酸配列の整列比較から、両毒素群は長期間の進化
過程を経ており、各毒素群内でも遺伝的多様性を獲得し
たと推定される。したがって、未知の中間型配列を有す
る毒素が存在する可能性が高い。実際、ビブリオホリセ
ーの一部の株が有するtdh遺伝子が腸炎ビブリオ等その
他のビブリオ属が有するtdh遺伝子とは系統的に異なる
ものであることが報告されている（1996年 Microbiol.
Immunol.,40,59-65）。更に、その報告の中で、既存のt
dh遺伝子検出用PCRプライマー3組の内2組は試験に供し
たビブリオホリセーが有する全てのタイプのtdh遺伝子
を漏れなく検出することができなかったことが示されて
いる。また、trh遺伝子に関しては、菌株によりtrh1お
よびtrh2遺伝子の塩基配列にばらつきがあることが報告
されている（1992年 Appl.Environ. Microbiol.,58,244
9-2457）が、既存のtrh遺伝子検出用PCRプライマーは設
計の際にtrh1およびtrh2遺伝子の塩基配列のばらつきに
ついて考慮されておらず、trh検出用PCRプライマーとし
て万全であるとは言い難い。事実、本発明の過程で、従
来のプライマーでは増幅し難い新たなTRHに類似する毒
素遺伝子を見いだした。これらの結果は、既知以外のTD
H関連毒素遺伝子が存在する可能性を強く示唆してい
る。
16％程度異なる2種類（trh1およびtrh2）の存在が知ら
れている（1992年Appl. Environ. Microbiol.,58,2449-
2457）。また、TDH型毒素群とTRH型毒素群のそれぞれの
アミノ酸配列の整列比較から、両毒素群は長期間の進化
過程を経ており、各毒素群内でも遺伝的多様性を獲得し
たと推定される。したがって、未知の中間型配列を有す
る毒素が存在する可能性が高い。実際、ビブリオホリセ
ーの一部の株が有するtdh遺伝子が腸炎ビブリオ等その
他のビブリオ属が有するtdh遺伝子とは系統的に異なる
ものであることが報告されている（1996年 Microbiol.
Immunol.,40,59-65）。更に、その報告の中で、既存のt
dh遺伝子検出用PCRプライマー3組の内2組は試験に供し
たビブリオホリセーが有する全てのタイプのtdh遺伝子
を漏れなく検出することができなかったことが示されて
いる。また、trh遺伝子に関しては、菌株によりtrh1お
よびtrh2遺伝子の塩基配列にばらつきがあることが報告
されている（1992年 Appl.Environ. Microbiol.,58,244
9-2457）が、既存のtrh遺伝子検出用PCRプライマーは設
計の際にtrh1およびtrh2遺伝子の塩基配列のばらつきに
ついて考慮されておらず、trh検出用PCRプライマーとし
て万全であるとは言い難い。事実、本発明の過程で、従
来のプライマーでは増幅し難い新たなTRHに類似する毒
素遺伝子を見いだした。これらの結果は、既知以外のTD
H関連毒素遺伝子が存在する可能性を強く示唆してい
る。
【０００８】現在、毒素遺伝子検査用には、既にTDH産
生遺伝子tdh、TRH産生遺伝子trhをそれぞれ別々に検出
するPCRプライマー（tdh遺伝子のみを検出するプライマ
ー、trh1遺伝子のみを検出するプライマーならびにtrh1
・２遺伝子を同時に検出するプライマー）が開発されて
おり（特開平4-293486、1992年, Mol. Cell. Probes,
6:477-487）、腸炎ビブリオ研究用試薬として販売され
ている。しかし、上記のような理由で、これら市販の試
薬はいずれも食品に存在する可能性があるTDH関連毒素
あるいはその毒素遺伝子を網羅的に検出・定量する方法
を提供しない。即ち、食品衛生管理の現場で用いた場合
には、複数の検出系の併用を必用とする上、それでも擬
陰性となる可能性を否定できない。
生遺伝子tdh、TRH産生遺伝子trhをそれぞれ別々に検出
するPCRプライマー（tdh遺伝子のみを検出するプライマ
ー、trh1遺伝子のみを検出するプライマーならびにtrh1
・２遺伝子を同時に検出するプライマー）が開発されて
おり（特開平4-293486、1992年, Mol. Cell. Probes,
6:477-487）、腸炎ビブリオ研究用試薬として販売され
ている。しかし、上記のような理由で、これら市販の試
薬はいずれも食品に存在する可能性があるTDH関連毒素
あるいはその毒素遺伝子を網羅的に検出・定量する方法
を提供しない。即ち、食品衛生管理の現場で用いた場合
には、複数の検出系の併用を必用とする上、それでも擬
陰性となる可能性を否定できない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】発明者らは、上記の問題
点を解決するために研究を重ねた結果、TDH、TRHのタン
パク上に保存性の高い領域が存在することを見いだし
た。即ち、既知のTDH、TRHのアミノ酸配列についてマル
チアライメント解析を行ったところ、TDH、TRHどちらに
も高い相同性を示す領域が存在することを見いだして、
本発明を完成させたものである。
点を解決するために研究を重ねた結果、TDH、TRHのタン
パク上に保存性の高い領域が存在することを見いだし
た。即ち、既知のTDH、TRHのアミノ酸配列についてマル
チアライメント解析を行ったところ、TDH、TRHどちらに
も高い相同性を示す領域が存在することを見いだして、
本発明を完成させたものである。
【００１０】本発明は、この様な配列の異なる2種類の
溶血毒について、両者に高い相同性を示すアミノ酸配列
に対応する塩基配列を用いて混合プライマー（デジェネ
レートプライマー）を設計し、PCR法によりこれら２種
類の溶血毒素をコードする遺伝子tdh及びtrhの両者の断
片の増幅を可能とし、TDH産生株からもTRH産生株からも
プライマーにより挟まれた配列の増幅断片を得ることに
より、溶血毒素遺伝子tdh、trhを一度に検出する事が可
能であることを特徴とする。さらに、同時に検出した毒
素型の同定を行うことも可能であり、TDH、TRHと機能的
に類似する未知の毒素遺伝子断片を検出することも可能
としていることを特徴とする。
溶血毒について、両者に高い相同性を示すアミノ酸配列
に対応する塩基配列を用いて混合プライマー（デジェネ
レートプライマー）を設計し、PCR法によりこれら２種
類の溶血毒素をコードする遺伝子tdh及びtrhの両者の断
片の増幅を可能とし、TDH産生株からもTRH産生株からも
プライマーにより挟まれた配列の増幅断片を得ることに
より、溶血毒素遺伝子tdh、trhを一度に検出する事が可
能であることを特徴とする。さらに、同時に検出した毒
素型の同定を行うことも可能であり、TDH、TRHと機能的
に類似する未知の毒素遺伝子断片を検出することも可能
としていることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、ビブリオ属細菌の一部
が保有するtdh遺伝子及びtrh遺伝子がそれぞれコードす
るTDH及びTRHの両アミノ酸配列に共通する配列部分をコ
ードする混合核酸配列を用いて、溶血毒素産生の可能性
の有るビブリオ属細菌の検出および毒素型の同定を行う
ものである。
が保有するtdh遺伝子及びtrh遺伝子がそれぞれコードす
るTDH及びTRHの両アミノ酸配列に共通する配列部分をコ
ードする混合核酸配列を用いて、溶血毒素産生の可能性
の有るビブリオ属細菌の検出および毒素型の同定を行う
ものである。
【００１２】既知の耐熱性溶血毒素TDH１３種類及びTDH
類似毒素TRH３種類のアミノ酸配列をClustal Wコンピュ
ータプログラムの多重アラインメント解析を行った結果
（図1）、両毒素に保存性の高いアミノ酸配列が存在す
ることを見いだした。続いて、これらアミノ酸配列を核
酸配列に翻訳した混合プライマーを設計し、同一のプラ
イマーによりtdh、trh両遺伝子がPCR法により増幅可能
であるか否かを検討した。
類似毒素TRH３種類のアミノ酸配列をClustal Wコンピュ
ータプログラムの多重アラインメント解析を行った結果
（図1）、両毒素に保存性の高いアミノ酸配列が存在す
ることを見いだした。続いて、これらアミノ酸配列を核
酸配列に翻訳した混合プライマーを設計し、同一のプラ
イマーによりtdh、trh両遺伝子がPCR法により増幅可能
であるか否かを検討した。
【００１３】即ち、高い保存性を有するアミノ酸配列と
しては、例えば、(1) LPS(V 又は I)PFP(A 又は S)PGSD
E(L 又は I)LFVVR、(2) KRKPY、(3)Y(M 又は I)TV(N 又
は S)IN、(4)YTMAA(V 又は L)SGYK、(5) YLDETP(E 又は
S)YFV、(6) VEAYESG、(7) VMCISNKという配列を挙げる
ことができる。これらはそれぞれ、配列表の配列番号１
のアミノ酸位置で（１）は、３〜２１に、（２）は、４
５〜４９に、（３）は６９〜７５に、（４）は７９〜８
８に、（５）は１２６〜１３５に、（６）は１３７〜１
４３に、（７）は１４９〜１５５にそれぞれ相当するも
のである。
しては、例えば、(1) LPS(V 又は I)PFP(A 又は S)PGSD
E(L 又は I)LFVVR、(2) KRKPY、(3)Y(M 又は I)TV(N 又
は S)IN、(4)YTMAA(V 又は L)SGYK、(5) YLDETP(E 又は
S)YFV、(6) VEAYESG、(7) VMCISNKという配列を挙げる
ことができる。これらはそれぞれ、配列表の配列番号１
のアミノ酸位置で（１）は、３〜２１に、（２）は、４
５〜４９に、（３）は６９〜７５に、（４）は７９〜８
８に、（５）は１２６〜１３５に、（６）は１３７〜１
４３に、（７）は１４９〜１５５にそれぞれ相当するも
のである。
【００１４】特に好適には、アミノ酸配列(1) LPS(V又
はI)PFP(A又はS)PGSD(L又はI)LFVLRの内DE(L又はI)LFV
V、 (6)VEAYESG 、(3)Y(M又はI)TV(N又はS)INの内YMTVN
IN、(5)YLDETP(E又は S)YFVの内DEPTEYFVを挙げること
ができる。これらアミノ酸配列の全部又は１部をコード
する混合プライマーを作成する。例えば、DEL(Ｌ又はI)
LFVVについて言えば、当該アミノ酸配列をコードするセ
ンスプライマー5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’及びVEAY
ESG をコードするアンチセンスプライマー5’-ccnswytc
rtangcytcnac-3’を挙げることができる（なお、本願明
細書中で、nは、a、t、c、又はgを意味する。）。これ
らプライマーを用いて、サンプルを増幅することによ
り、tdh又はtrh遺伝子を１度に容易に検出することがで
きるものである。
はI)PFP(A又はS)PGSD(L又はI)LFVLRの内DE(L又はI)LFV
V、 (6)VEAYESG 、(3)Y(M又はI)TV(N又はS)INの内YMTVN
IN、(5)YLDETP(E又は S)YFVの内DEPTEYFVを挙げること
ができる。これらアミノ酸配列の全部又は１部をコード
する混合プライマーを作成する。例えば、DEL(Ｌ又はI)
LFVVについて言えば、当該アミノ酸配列をコードするセ
ンスプライマー5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’及びVEAY
ESG をコードするアンチセンスプライマー5’-ccnswytc
rtangcytcnac-3’を挙げることができる（なお、本願明
細書中で、nは、a、t、c、又はgを意味する。）。これ
らプライマーを用いて、サンプルを増幅することによ
り、tdh又はtrh遺伝子を１度に容易に検出することがで
きるものである。
【００１５】また、本件プライマーを用いることによ
り、上記、tdh、trhと類似する未知の溶血毒素遺伝子を
検出することも可能である。この場合、増幅断片より直
接シーケンス反応を行うことができるように、予め各プ
ライマーの５’末端に既知の配列を付加する。この付加
した配列をシーケンスプライマーとして用いることによ
り、増幅断片を直接、クローニングすることなく塩基配
列を決定することも可能である。
り、上記、tdh、trhと類似する未知の溶血毒素遺伝子を
検出することも可能である。この場合、増幅断片より直
接シーケンス反応を行うことができるように、予め各プ
ライマーの５’末端に既知の配列を付加する。この付加
した配列をシーケンスプライマーとして用いることによ
り、増幅断片を直接、クローニングすることなく塩基配
列を決定することも可能である。
【００１６】本発明に於ける増幅DNA断片の解析は、実
施例に示すとおり、塩基配列を決定することなく、リア
ルタイムPCR解析における融解曲線分析等で判定するこ
とも可能である。本件発明は、これらアミノ酸配列に基
づいた混合プライマーを、他の試薬と組み合わせた溶血
毒素遺伝子検出、定量又は同定用のキットを包含するも
のである。
施例に示すとおり、塩基配列を決定することなく、リア
ルタイムPCR解析における融解曲線分析等で判定するこ
とも可能である。本件発明は、これらアミノ酸配列に基
づいた混合プライマーを、他の試薬と組み合わせた溶血
毒素遺伝子検出、定量又は同定用のキットを包含するも
のである。
【００１７】
【実施例】［実施例１］図１に示した保存性の高い領域
において、（１）LPS(V又はI)PFP(A又はS)PGSD(L又はI)
LFVLRの内DEL(I)LFVVをコードするセンスプライマー5’
-gaygarhtnytnttygtngt-3’及び（６）VEAYESG をコー
ドするアンチセンスプライマー5’-ccnswytcrtangcytcn
ac-3’を設計した。それぞれのプライマーは、腸炎ビブ
リオTDHにおけるアミノ酸位置38〜44、161〜167に相当
し、前者は3072通り、後者は2048通りの混合プライマー
である。このプライマーの組み合わせを用いたPCRによ
り、386bpの増幅DNA断片が得られることとなる。しか
し、得られたDNA断片が未知の溶血毒素遺伝子である可
能性もあるため、増幅断片より直接シーケンス反応を行
うことが出来るように、予め各プライマーの5’端に既
知の配列（センス側：5’-caggaaacagctatgacc-3’、ア
ンチセンス側：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’）を付加し
た。この付加した配列をシーケンスプライマーとして用
いる事により、増幅DNA断片をクローニングする事無し
に直接塩基配列を決定することが可能となる。また、増
幅DNA産物はこの配列の付加により422bpとなる。上記の
プライマーを用いて、TDHまたはTRHを産生することが判
明している腸炎ビブリオ８株より定法に従って抽出した
染色体DNAを鋳型としてPCR法による毒素遺伝子断片の増
幅を行った。
において、（１）LPS(V又はI)PFP(A又はS)PGSD(L又はI)
LFVLRの内DEL(I)LFVVをコードするセンスプライマー5’
-gaygarhtnytnttygtngt-3’及び（６）VEAYESG をコー
ドするアンチセンスプライマー5’-ccnswytcrtangcytcn
ac-3’を設計した。それぞれのプライマーは、腸炎ビブ
リオTDHにおけるアミノ酸位置38〜44、161〜167に相当
し、前者は3072通り、後者は2048通りの混合プライマー
である。このプライマーの組み合わせを用いたPCRによ
り、386bpの増幅DNA断片が得られることとなる。しか
し、得られたDNA断片が未知の溶血毒素遺伝子である可
能性もあるため、増幅断片より直接シーケンス反応を行
うことが出来るように、予め各プライマーの5’端に既
知の配列（センス側：5’-caggaaacagctatgacc-3’、ア
ンチセンス側：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’）を付加し
た。この付加した配列をシーケンスプライマーとして用
いる事により、増幅DNA断片をクローニングする事無し
に直接塩基配列を決定することが可能となる。また、増
幅DNA産物はこの配列の付加により422bpとなる。上記の
プライマーを用いて、TDHまたはTRHを産生することが判
明している腸炎ビブリオ８株より定法に従って抽出した
染色体DNAを鋳型としてPCR法による毒素遺伝子断片の増
幅を行った。
【００１８】増幅反応は、耐熱性DNAポリメラーゼ(Ampl
iTaq Gold : Applied Biosystems製)を用い、GENE MATE
サーマルサイクラー(ISC BioExpress)を使用して行っ
た。反応液はDNA 0.1μg、50mM KCl、10 mM Tris-HCl p
H 8.3、2.0 mM MgCl2、0.01%ゼラチン、各0.2 mMのdNT
P、2.5 U のAmpliTaq Gold、プライマー各1μMを含む溶
液を最終体積50μlに調製した。反応条件は、AmpliTaq
Goldの活性化（95℃・10分間）に続いて、95℃・1分
間、45℃・40秒間、72℃・1分30秒間の反応を5サイクル
行った後に、94℃・1分間、46℃・40秒間、72℃・1分30
秒間の反応を35サイクル行い、最後に72℃・10分間の伸
長反応を行った。得られたPCR産物は、1%アガロースゲ
ル(Sea Plaque GTG agarose : BioWhittaker Molecular
Applications製)で電気泳動(0.5xTAE、100V・30分間)
後、臭化エチジウムで10分間染色し紫外線照射下で増幅
産物の存在を確認した。
iTaq Gold : Applied Biosystems製)を用い、GENE MATE
サーマルサイクラー(ISC BioExpress)を使用して行っ
た。反応液はDNA 0.1μg、50mM KCl、10 mM Tris-HCl p
H 8.3、2.0 mM MgCl2、0.01%ゼラチン、各0.2 mMのdNT
P、2.5 U のAmpliTaq Gold、プライマー各1μMを含む溶
液を最終体積50μlに調製した。反応条件は、AmpliTaq
Goldの活性化（95℃・10分間）に続いて、95℃・1分
間、45℃・40秒間、72℃・1分30秒間の反応を5サイクル
行った後に、94℃・1分間、46℃・40秒間、72℃・1分30
秒間の反応を35サイクル行い、最後に72℃・10分間の伸
長反応を行った。得られたPCR産物は、1%アガロースゲ
ル(Sea Plaque GTG agarose : BioWhittaker Molecular
Applications製)で電気泳動(0.5xTAE、100V・30分間)
後、臭化エチジウムで10分間染色し紫外線照射下で増幅
産物の存在を確認した。
【００１９】その結果、図2に示す通り、TDHまたはTRH
を産生する全ての株のDNAより422bpのDNA断片の増幅が
認められた。これら増幅断片は、定法によりゲルより切
り出し精製した後、上述したシーケンスプライマーを用
いて、ジデオキシ法によりその塩基配列を決定した。塩
基配列の決定には、ABI PRISM BigDye Terminator
Cycle SequenceingReady Reaction Kit (Applied Bi
osystems製)及びABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER (App
lied Biosystems製) を使用した。得られた塩基配列を
アミノ酸配列に翻訳した結果、TDHまたはTRHをコードす
る遺伝子であることが確認された。
を産生する全ての株のDNAより422bpのDNA断片の増幅が
認められた。これら増幅断片は、定法によりゲルより切
り出し精製した後、上述したシーケンスプライマーを用
いて、ジデオキシ法によりその塩基配列を決定した。塩
基配列の決定には、ABI PRISM BigDye Terminator
Cycle SequenceingReady Reaction Kit (Applied Bi
osystems製)及びABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER (App
lied Biosystems製) を使用した。得られた塩基配列を
アミノ酸配列に翻訳した結果、TDHまたはTRHをコードす
る遺伝子であることが確認された。
【００２０】また、これまで、trh2遺伝子を保有すると
報告されていた（1999年第33回腸炎ビブリオシンポジュ
ウム要旨：2000年臨床と微生物、27、p239）腸炎ビブリ
オタイプストレイン(IFO12711 T)の毒素遺伝子が、trh2
とは配列が異なり（アミノ酸レベルで82％、核酸レベル
で91％の相同性）これまでに知られているものとは異な
る新規なものであることが判明した（図3）。この結
果、TDH、TRHタンパク質の相同性の高い領域のアミノ酸
配列に基づいた混合プライマーにより、tdhおよびtrh遺
伝子を同時に検出する事が可能である事、ならびに未知
のTDH関連毒素遺伝子を検出可能なことが示された。
報告されていた（1999年第33回腸炎ビブリオシンポジュ
ウム要旨：2000年臨床と微生物、27、p239）腸炎ビブリ
オタイプストレイン(IFO12711 T)の毒素遺伝子が、trh2
とは配列が異なり（アミノ酸レベルで82％、核酸レベル
で91％の相同性）これまでに知られているものとは異な
る新規なものであることが判明した（図3）。この結
果、TDH、TRHタンパク質の相同性の高い領域のアミノ酸
配列に基づいた混合プライマーにより、tdhおよびtrh遺
伝子を同時に検出する事が可能である事、ならびに未知
のTDH関連毒素遺伝子を検出可能なことが示された。
【００２１】［実施例２］図1に示した保存性の高い領
域において、YM(I)TVN(S)INの内YMTVNINをコードするセ
ンスプライマー5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’、及び
YLDETPE(S)YFVの内DEPTEYFVをコードするアンチセンス
プライマー5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’を設計し
た。それぞれのプライマーは、腸炎ビブリオTDHにおけ
るアミノ酸位置100〜106、152〜159に相当し、両者とも
512通りの混合プライマーである。このプライマーの組
み合わせを用いたPCRにより、180bpの増幅DNA断片が得
られることとなる。
域において、YM(I)TVN(S)INの内YMTVNINをコードするセ
ンスプライマー5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’、及び
YLDETPE(S)YFVの内DEPTEYFVをコードするアンチセンス
プライマー5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’を設計し
た。それぞれのプライマーは、腸炎ビブリオTDHにおけ
るアミノ酸位置100〜106、152〜159に相当し、両者とも
512通りの混合プライマーである。このプライマーの組
み合わせを用いたPCRにより、180bpの増幅DNA断片が得
られることとなる。
【００２２】TDH産生株1株、1型TRH産生株、及び本発明
により新規のTRHを産生することが判明した腸炎ビブリ
オタイプストレイン（IFO12711 T）由来の染色体DNAを
鋳型として、LightCycler System（ロシュ・ダイアグノ
スティックス株式会社）を使用したリアルタイムPCRに
よる溶血毒素遺伝子の検出・同定を試みた。反応液はLi
ghtCycler - DNA Master SYBR Green Ｉ kit（ロシュ・
ダイアグノスティックス株式会社）を用い、DNA 0.1μg
を加え、最終体積20μlに調製した。自動ホットスター
トを行うために、ライトサイクラーＤＮＡマスターミッ
クスSYBRグリーンIを予め抗Taqポリメラーゼ抗体（Taq
Start Antibody : Clontech）と反応させ不活性化し
た。
により新規のTRHを産生することが判明した腸炎ビブリ
オタイプストレイン（IFO12711 T）由来の染色体DNAを
鋳型として、LightCycler System（ロシュ・ダイアグノ
スティックス株式会社）を使用したリアルタイムPCRに
よる溶血毒素遺伝子の検出・同定を試みた。反応液はLi
ghtCycler - DNA Master SYBR Green Ｉ kit（ロシュ・
ダイアグノスティックス株式会社）を用い、DNA 0.1μg
を加え、最終体積20μlに調製した。自動ホットスター
トを行うために、ライトサイクラーＤＮＡマスターミッ
クスSYBRグリーンIを予め抗Taqポリメラーゼ抗体（Taq
Start Antibody : Clontech）と反応させ不活性化し
た。
【００２３】反応条件は、Taqポリメラーゼの活性化（9
5℃・90秒間）に続いて、95℃・0秒間、44℃・10秒間、
72℃・30秒間の反応を5サイクル行った後に、94℃・0秒
間、45℃・10秒間、72℃・30秒間の反応を35サイクル行
った。増幅反応に引き続き、65℃〜95℃まで毎秒0.1℃
の割合で昇温させ、増幅産物の融解曲線分析を実施し
た。
5℃・90秒間）に続いて、95℃・0秒間、44℃・10秒間、
72℃・30秒間の反応を5サイクル行った後に、94℃・0秒
間、45℃・10秒間、72℃・30秒間の反応を35サイクル行
った。増幅反応に引き続き、65℃〜95℃まで毎秒0.1℃
の割合で昇温させ、増幅産物の融解曲線分析を実施し
た。
【００２４】解析の結果、何れのDNAからも増幅産物が
確認された。また、融解曲線分析の結果、tdh遺伝子断
片、trh1遺伝子断片及び新規のtrh遺伝子断片はそれぞ
れ異なるTm値（特異的融解温度）を示し、容易に判別す
ることが可能であった（図4）。
確認された。また、融解曲線分析の結果、tdh遺伝子断
片、trh1遺伝子断片及び新規のtrh遺伝子断片はそれぞ
れ異なるTm値（特異的融解温度）を示し、容易に判別す
ることが可能であった（図4）。
【００２５】従来のサーマルサイクラーを用いた標的遺
伝子の増幅〜電気泳動による確認を行った場合、およそ
3〜4時間を要するが、本件発明を利用したリアルタイム
PCRでは、標的遺伝子の増幅〜融解曲線分析に要する時
間はおよそ40分間であり、短時間で行えるだけでなく、
同時に毒素の型を判別することが可能となる。
伝子の増幅〜電気泳動による確認を行った場合、およそ
3〜4時間を要するが、本件発明を利用したリアルタイム
PCRでは、標的遺伝子の増幅〜融解曲線分析に要する時
間はおよそ40分間であり、短時間で行えるだけでなく、
同時に毒素の型を判別することが可能となる。
【００２６】
【発明の効果】本発明は、多様なアミノ酸配列を有する
TDH関連毒素タンパク群をコードする多様な遺伝子群
を、共通の方法により網羅的に検査する方法を提供す
る。これにより、食品（特に生食用生鮮魚介類等）中
に、TDH関連毒素タンパク質の遺伝子のいずれかを有す
る細菌が存在するかどうかの迅速な判定が可能となる。
また、毒素遺伝子保有菌が存在する場合には、その存在
数を把握できる事から、食品としての安全性を迅速に評
価する事が可能となる。この様に、食品製造・流通等に
おける食中毒の防止、衛生管理の効率化・高精度化に大
きく貢献する。
TDH関連毒素タンパク群をコードする多様な遺伝子群
を、共通の方法により網羅的に検査する方法を提供す
る。これにより、食品（特に生食用生鮮魚介類等）中
に、TDH関連毒素タンパク質の遺伝子のいずれかを有す
る細菌が存在するかどうかの迅速な判定が可能となる。
また、毒素遺伝子保有菌が存在する場合には、その存在
数を把握できる事から、食品としての安全性を迅速に評
価する事が可能となる。この様に、食品製造・流通等に
おける食中毒の防止、衛生管理の効率化・高精度化に大
きく貢献する。
【００２７】また本発明は、食中毒患者の糞便や食品か
らのTDH関連毒素タンパク質の遺伝子の検出と、その毒
素型の迅速な判別を可能とする。また、糞便や食品から
単離された菌株が、TDH関連毒素タンパク質の遺伝子を
有しているか、有している場合にはどの毒素型かの迅速
な判別する事を可能とする。
らのTDH関連毒素タンパク質の遺伝子の検出と、その毒
素型の迅速な判別を可能とする。また、糞便や食品から
単離された菌株が、TDH関連毒素タンパク質の遺伝子を
有しているか、有している場合にはどの毒素型かの迅速
な判別する事を可能とする。
【００２８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KABUSHIKI KAISHA NICHIREI
<120>
<130> P00-0961
<140>
<141>
<160> 39
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 149
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 1
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Asn
100 105 110
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
130 135 140
Cys Lys His Gln Gln
145
<210> 2
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 2
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln
165
<210> 3
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 3
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Asn Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys Tyr Gln Asn
165
<210> 4
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 4
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln
165
<210> 5
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 5
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln
165
<210> 6
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 6
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln
165
<210> 7
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 7
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Lys Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu His Gln Lys
165
<210> 8
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 8
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu His Gln Lys
165
<210> 9
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio cholerae
<400> 9
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asp Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Lys Tyr Gln Asn
165
<210> 10
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio mimicus
<400> 10
Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Ala Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asp Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Val Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu His Gln Arg
165
<210> 11
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio hollisae
<400> 11
Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp
100 105 110
Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu Glu Gln Gln
165
<210> 12
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio hollisae
<400> 12
Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp
100 105 110
Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu Glu Gln Gln
165
<210> 13
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio hollisae
<400> 13
Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn
20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val His Gly Gln Ser Val Phe Ile Thr Ser Gly Thr Lys
50 55 60
Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val
85 90 95
Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp
100 105 110
Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu
145 150 155 160
Cys Glu Ser Gln Gln
165
<210> 14
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 14
Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn
20 25 30
Ala Ile Val Asn Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Trp Leu Ser Ala Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr
85 90 95
Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn
130 135 140
Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu
145 150 155 160
Cys Met Ser Gln Asn
165
<210> 15
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 15
Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn
20 25 30
Ala Ile Val Asp Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys
50 55 60
Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr
85 90 95
Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp
100 105 110
Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn
130 135 140
Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu
145 150 155 160
Cys Met Ser Gln Asn
165
<210> 16
<211> 165
<212> PRT
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 16
Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu
1 5 10 15
Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Lys
20 25 30
Ala Ile Val Glu Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Thr Ile Lys Arg Lys Pro
35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ala Gly Ser Lys
50 55 60
Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly His Asn Tyr Thr
65 70 75 80
Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys His Gly Thr Ser Thr Val Phe Thr
85 90 95
Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asp Phe Tyr Ser Val Lys Ser
100 105 110
Phe Val Asp Asp Ser Glu Glu Ser Ile Pro Ser Ile Asn Tyr Leu Asp
115 120 125
Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Thr Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn
130 135 140
Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Leu Ser Phe Gly Glu
145 150 155 160
Cys Lys Ser Gln Ile
165
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 17
Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 18
Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 19
Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 20
Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 21
Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 22
Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 23
Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Phe Val Val Arg
20
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 24
Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Val Val Arg
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 25
Lys Arg Lys Pro Tyr
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 26
Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 27
Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 28
Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 29
Tyr Ile Thr Val Ser Ile Asn
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 30
Tyr Thr Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 31
Tyr Thr Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 32
Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 33
Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 34
Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:fragment of TDH
or TRH
<400> 35
Val Met Cys Ile Ser Asn Lys
1 5
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer for gene
coding TDH, TRH, or similar haemolysin
<220>
<221>
<222> 9,12,18
<223> n represents a,g,c or t
<400> 36
gaygarhtny tnttygtngt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer for gene
coding TDH, TRH, or similar haemolysin
<220>
<221>
<222> 3,12,18
<223> n represents a,g,c or t
<400> 37
ccnswytcrt angcytcnac 20
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer for gene
coding TDH, TRH, or similar haemolysin
<220>
<221>
<222> 12,15
<223> n represents a,g,c or t
<400> 38
acraartayt cnggngtytc rtc 23
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Primer for gene
coding TDH, TRH, or similar haemolysin
<220>
<221>
<222> 9,12
<223> n represents a,g,c or t
<400> 39
tayatgacng tnaayathaa yg 22
【図面の簡単な説明】
【図１】既知のTDHおよびTRHアミノ酸配列によるアライ
メント解析結果
メント解析結果
【図２】PCR法により得られた増幅DNA産物のアガロース
電気泳動による解析結果
電気泳動による解析結果
【図３】PCR法により得られた増幅DNA産物のアミノ酸配
列に基づいた分子系統解析結果
列に基づいた分子系統解析結果
【図４】融解曲線分析による増幅遺伝子産物の解析結果
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 伊藤 武
東京都中央区日本橋箱崎町44−１ 財団法
人東京顕微鏡院 日本橋研究所内
(72)発明者 中川 弘
東京都中央区日本橋箱崎町44−１ 財団法
人東京顕微鏡院 日本橋研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA13 CA03 CA09 HA14
4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR55
QR62 QS12 QS25 QX01 QX04
Claims (11)
- 【請求項１】 ビブリオ属病原菌に広く分布する耐熱性
溶血毒素タンパク群［TDH（Thermostable direct hemol
ysin）、TRH（TDH related hemolysin）及び類似する溶
血毒素タンパク質を意味する。以下TDH関連毒素と呼
ぶ。］のアミノ酸配列上に存在する共通アミノ酸配列を
コードする遺伝子配列を用いる事により、TDH関連毒素
の遺伝子を広く網羅的に検出・定量する事を特徴とする
これら溶血毒素遺伝子を有する病原細菌の検出・定量方
法。 - 【請求項２】 請求項１記載の共通アミノ酸配列である
下記（1）〜（7）のアミノ酸配列から選択される最低2
つのアミノ酸配列の一部又は全部をコードし、実質的な
プライマーとしての機能を有する複数のオリゴヌクレオ
チドを１組のPCRプライマーとして、ビブリオ属病原菌
に広く分布する溶血毒素群の遺伝子を網羅的に増幅する
事により、TDH関連毒素遺伝子を有する細菌を網羅的に
検出・判別する方法。 (1) LPS(V 又は I)PFP(A 又は S)PGSDE(L 又は I)LFVV
R、(2) KRKPY、(3)Y(M 又は I)TV(N 又は S)IN、(4)YTM
AA(V 又は L)SGYK、(5) YLDETP(E 又は S)YFV、(6) VEA
YESG、(7) VMCISNK - 【請求項３】 請求項１項記載の共通アミノ酸配列であ
る下記（1）〜（7）のアミノ酸配列から選択される１つ
のアミノ酸配列の一部又は全部をコードするオリゴヌク
レオチドを含むTDH関連毒素遺伝子の増幅用プライマ
ー。(1) LPS(V 又は I)PFP(A 又は S)PGSDE(L 又は I)L
FVVR、(2) KRKPY、(3)Y(M 又は I)TV(N 又は S)IN、(4)
YTMAA(V 又は L)SGYK、(5) YLDETP(E 又は S)YFV、(6)
VEAYESG、(7) VMCISNK - 【請求項４】 アミノ酸配列(1) LPS(V 又は I)PFP(A
又は S)PGSD(L 又はI)LFVLRの内DE(L 又は I)LFVVをコ
ードする5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’及び対応する相
補鎖を含むTDH関連毒素遺伝子の増幅用プライマー。 - 【請求項５】 アミノ酸配列(6)VEAYESG をコードする
塩基配列の相補鎖である5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’
及び対応する相補鎖を含むTDH関連毒素遺伝子の増幅用
プライマー。 - 【請求項６】 アミノ酸配列(3)Y(M 又は I)TV(N 又は
S)INの内YMTVNINをコードする5’-tayatgacngtnaayatha
ayg-3’及び対応する相補鎖を含むTDH関連毒素遺伝子の
増幅用プライマー。 - 【請求項７】 アミノ酸配列(5)YLDETP(E 又は S)YFVの
内DEPTEYFVをコードする塩基配列の相補鎖である5’-ac
raartaytcnggngtytcrtc-3’及び対応する相補鎖を含むT
DH関連毒素遺伝子の増幅用プライマー。 - 【請求項８】 請求項3-7のいずれか一項に記載のプラ
イマーを用いるTDH関連毒素遺伝子を検出することによ
るTDH関連毒素を産生する細菌を網羅的に検出・定量す
る方法。 - 【請求項９】 TDH及びTRHのアミノ酸配列上に存在する
共通アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を遺伝子増幅
系に用いる事によって溶血毒素遺伝子を網羅的に増幅
し、得られた増幅産物のTm値（特異的融解温度）を解析
する事を特徴とする、被検毒素遺伝子のコードする毒素
型の判別を行う方法。 - 【請求項１０】 請求項3-7のいずれか1項に記載のプラ
イマーを用いるTDH関連毒素タンパク質産生細菌が産生
する毒素の型判別を行う方法。 - 【請求項１１】 請求項3-7のいずれか1項に記載のプラ
イマーを含むTDH関連毒素タンパク質の遺伝子、及びTDH
関連毒素タンパク質を産生する細菌の検出・定量、ある
いは毒素型判定の検査を行うキット。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP2001320403A JP2003116579A (ja) | 2001-10-18 | 2001-10-18 | 食中毒細菌の有する耐熱性溶血毒素関連遺伝子（ｔｄｈ関連毒素遺伝子）を網羅的に検出・定量することによる溶血毒素産生細菌の検出・定量方法 |
| US10/492,942 US20050239067A1 (en) | 2001-10-18 | 2002-10-17 | Method of detecting and quantifying hemolysin-producing bacteria by overwhelmingly detecting and quantifying thermostable hemolysin-related genes (tdh-related hemolysin genes) of food poisoning bacteria |
| KR10-2004-7005760A KR20040045871A (ko) | 2001-10-18 | 2002-10-17 | 식중독세균이 보유하는 내열성 용혈독소 관련유전자(ｔｄｈ 관련 독소 유전자)를 총체적으로검출·정량함으로써 용혈독소 생산균을 검출·정량하는 방법 |
| EP02801592A EP1445313A4 (en) | 2001-10-18 | 2002-10-17 | PROCESS FOR DETECTING AND QUANTIFYING HEMOLYSIN-PRODUCING BACTERIA BY MEANS OF IDENTIFICATION AND QUANTIFICATION MOST OF GENES (Tdh-RELATED HEMOLYSIN GENES) RELATED TO TEMPERATURE-STABLE HEMOLYSIN) FOOD-POISONING CAUSING BACTERIA |
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| CNA028255658A CN1606622A (zh) | 2001-10-18 | 2002-10-17 | 通过全面检测和定量食物中毒细菌的热稳定直接溶血素相关的基因 ( t d h ) 相关溶血素基因)对产溶血素细菌进行检测和定量的方法 |
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|---|---|---|---|
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