JP5395674B2 - カンピロバクターの種同定のための遺伝的方法 - Google Patents
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Description
[関連技術]
双方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じている位置の数を決定して一致する位置の数を出し、かかる一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、その値に100を掛けて配列同一性の百分率を計算することができる。
[実施例]
各カンピロバクター種について、全部で以下の19菌株由来のgyrB遺伝子の配列を分析した。C.ジェジュニ4株(表1)並びにC.ジェジュニ RM1221 アクセッション番号NC 003912及びC.ジェジュニ亜種ジェジュニ NCTC11168 アクセッション番号NC 002163;C.コリ NADC 5095(アイオワ州、エームズ、国立動物疾患センター);C.コンシサス ATCC33237(バージニア州、マナッサス、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関);C.カーブス ATCC35224;C.ショウアエ ATCC 51146;C.ムコサリス ATCC49352;C.フェタス亜種フェタス ATCC15296及びC.フェタス NADC5513;C.フェタス亜種ベネレアリス NADC5519;C.ハイオインテスティナリス ATCC35217;C.スプトルム生理型スプトルム(C. sputorum biovar suptorum) ATCC33562;C.ヘルベティカスATCC51210;C.ウプサリエンシス ATCC49816;及びC.ラリ ATCC35221。PCRアッセイの特異性を判定するために本研究で用いたこれらの株及びその他の菌株を表1に列挙する。
ATCCから入手したカンピロバクター株を、ATCCが指定する条件に従って増殖させた。これらの株並びに表1に記載のE.コリ株及びサルモネラ株由来のゲノムDNAを、PrepMan Ultra Reagent(カルフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製)を用い、メーカーの使用説明書に従って抽出した。Irene Wesley博士(USDA、ARS、NADC)のご好意によりNADCから入手した、表1に記載した株由来のDNAを塩化セシウム濃度勾配超遠心分離法で精製し、−20℃で保存した。
gyrB配列の違いが、カンピロバクター種間の識別に使用するに足る信頼性を有するかどうか評価するために、gyrB DNA配列の種間変異を定量化する必要があった。12のカンピロバクター種のgyrB配列を、DNASYS Proプログラム(バージョン2.0)(東京、日立)を用いてアラインした。かかるデータを、近隣結合法(Saito and Nei. 1987. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425) 及びDDBJ (DNA Data Bank of Japan)ウェブサイト(www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html)中のCLUSTALWプログラム (Tompson et al. 1994. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) を用いた系統発生分析用の入力データとして用いた。12のカンピロバクターgyrB配列の多重アラインメントを実施し、分析された株間の配列変異を示すマトリックスを算出した。その後、これらのデータから系統樹を構成した(図1)。系統樹を分析したところ、12のカンピロバクター種すべてが、前記構成された系統樹において明確に識別された。gyrB遺伝子の部分配列に基づく前記系統樹の主要な形態(topology)は、16SrDNA遺伝子配列分析に基づく文献(上記Gorkiewicz et al.)で報告されたものに類似していた.
種々のカンピロバクター属菌のgyrB配列データを、最近隣法(nearest-neighbor method)を用いて計算したTm値をプロットすることにより、配列相違マトリックス表から分析した。各々の種のgyrB配列に相補的なプライマーを用いて作製したユニバーサルプライマーミックス(表3)を使用し、各カンピロバクター株由来の900bp gyrB断片を増幅した。
本研究で用いた12のカンピロバクター種に対する種特異的プライマーセットは、異なる種間で相違する領域に基づいて設計された。種特異的プライマーを用いたPCRアッセイを以下のように実施して、各カンピロバクター種を同定した。鋳型DNA(2.5μl)を無菌蒸留水で1/10に希釈し、1×GeneAm PCR Gold緩衝液、AmpliTaq GoldDNAポリメラーゼ(Applied Biosystems社製)を0.5U、4種のdNTPを各200μM、及び種特異的プライマーを各0.2μM含む、25μlの反応体積中で増幅した。C.ジェジュニ、C.ラリ、C.コンシサス、C.ショウアエ、C.カーブス、C.フェタス、及びC.ヘルベティカスのサイクル条件は、次の通りである。95℃で10分間初期変性、95℃で20秒、69℃で20秒を30サイクル、及び72℃で7分間最終伸長。C.ウプサリエンシス、C.ムコサリス、及びC.ハイオインテスティナリスについては、アニーリング温度及び時間はそれぞれ68℃、1分間であり、C.スプトルムではそれぞれ、65℃、20秒であった。最適量のPCR産物を得るために、異なる種由来のDNAの増幅のために複数のサイクル条件を用いた。かかるPCR産物を、上記に記載したように2%アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。表1に記載した各細菌由来のゲノムDNAを用い、12の異なるカンピロバクター属菌に特異的な各々のPCRアッセイを試験することにより、プライマー特異性を評価した。PCR条件は上記と同じであり、アガロースゲル電気泳動(2%)及びエチジウムブロマイド染色後、PCR産物を視覚化した。全ての種特異的プライマーは、同様の融解温度を有するよう、また、長さが500bp未満のPCR産物を生じるように設計し、PCRの効率が高くなるようにした。前記種特異的プライマー配列及び予想されたアンプリコンサイズを表4に示す。
[ヌクレオチド配列アクセッション番号]
Claims (6)
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)制限酵素断片長多型(RFLP)法によりカンピロバクターの種を同定する方法であって、以下のステップを含む方法。
a)カンピロバクターのDNA又は前記カンピロバクターのDNAを含むと推測される被験試料を準備するステップ、
b)以下の特定のカンピロバクター種のgyrB配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセット混合物を用いて前記カンピロバクターのDNAの標的配列を増幅するステップ:
即ちプライマーセットがCGTCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTTATC(配列番号5)及びTATAGCTTGGAAAGATCTTTCCCTACCTTG(配列番号6)を含むC(カンピロバクター).ジェジュニ、プライマーセットがCGCCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTCATC(配列番号7)及びTATAGCTTGAAAAGATCTTTCTCTACCTTG(配列番号8)を含むC.コリ、プライマーセットがAGACAAGAATTTGCAAAAGGTATCCCTCAA(配列番号9)及びAATCGCTTGAAAAGATCTTTCTCTTCCTTG(配列番号10)を含むC.コンシサス、プライマーセットがAGGCAAGAATTTCAAAAAGGTATCCCGGTA(配列番号11)及びTATCGCCTGAAAAACTCTATCACGTCCTTG(配列番号12)を含むC.カーブス、プライマーセットがAGACAAGAATTTTCAAAAGGTATCCCTCAA(配列番号13)及びGATCGCCTGAAATACGCGGTCGCGTCCTTG(配列番号14)を含むC.ショウアエ、プライマーセットがAGGCAAGAATTTGCAAAAGGAATTCCAGTA(配列番号15)及びAATCGCTTGAAATACTCTATCGCGTCCTTG(配列番号16)を含むC.ムコサリス、プライマーセットがCGTCAAGAGTTTTCAAAAGGAATACCCCAA(配列番号17)及びAATCGCTTGAAACACACGGTCACGACCCTG(配列番号18)を含むC.フェタス亜種フェタス、プライマーセットがCGCCAAGAATTCGCCGAAGGCATACCTCAA(配列番号19)及びAATCGCTTGAAACGCTCTATCACGACCTTG(配列番号20)を含むC.ハイオインテスティナリス、プライマーセットがAGACAAGAGTTTTCAAAAGGTGTTCCTACA(配列番号21)及びTATCGCTTGAAATGCTCTATCACGACCTTG(配列番号22)を含むC.スプトルム生理型スプトルム、プライマーセットがAGACAAGAATTTTCTAAAGGTCTAATTGCA(配列番号23)及びGATGGCTTGAAAAACTCTATTTCTACCTTG(配列番号24)を含むC.ヘルベティカス、プライマーセットがCGCCAAGAATTTGCTAAAGGGCAAATAGCT(配列番号25)及びAATCGCTTGAAAAGCCCTTTCACGCCCCTG(配列番号26)を含むC.ウプサリエンシス、並びにプライマーセットがAGACAAGAATTTTCAGAAGGAAAAGTAACA(配列番号27)及びAATAGCTTGAAAAGTTCTTTCTCTACCTTG(配列番号28)を含むC.ラリ
c)カンピロバクター種の存在を示すものとして、DNAの標的配列の増幅産物を得るステップ、
d)PCRによって得たDNA増幅産物「C.フェタス亜種フェタス」や「C.スプトルム生理型スプトルム」を、制限酵素Ddel又はXsplで消化するステップ、
e)前記消化ステップで得られた制限酵素断片長多型を、ゲル電気泳動によって分析するステップ、並びに
f)カンピロバクター種及び株を、そのRFLPパターンによって識別するステップ - ステップd)のDNA増幅産物が、二重消化として、制限酵素Mbol及びHind IIIの組合せにより消化される、請求項1記載の方法。
- 以下のステップを含む、直接ポリメラーゼ連鎖反応によりカンピロバクターの種を同定する方法。
a)カンピロバクターのDNA又は前記カンピロバクターのDNAを含むと推測される被験試料を準備するステップ、
b)以下の特定のカンピロバクター種のgyrB配列に相補的な種特異的プライマーセットを用いて前記カンピロバクターのDNAの標的配列を増幅するステップ:
即ちプライマーセットがAGAATGGGTTTAACTCGTGTGATAAGT(配列番号29)及びTACCACGCAAAGGCAGTATAGCT(配列番号30)を含むC.ジェジュニ、プライマーセットがAAATGCTAGTGCTAGGGAAAAAGACTCT(配列番号31)及びTGAGGTTCAGGCACTTTTACACTTACTAC(配列番号32)を含むC.コリ、プライマーセットがAGCGGGCCTAACAAGAGTTATTACA(配列番号33)及びTGTAAGCACGTCAAAAACCATCTTT(配列番号34)を含むC.コンシサス、プライマーセットがCTGCCAAAGTAAGGACGCAAGTATA(配列番号35)及びGGCAAGATCGCCTGAAATACG(配列番号36)を含むC.カーブス、プライマーセットがAGGGTTTAAGCATAGGAACGCTG(配列番号37)及びCACCAGATAAAGCTCGCTGATCG(配列番号38)を含むC.ショウアエ、プライマーセットがTGCGATTATGAACAAGGCCCTA(配列番号39)及びTCGCTTGAAACACACGGTCA(配列番号40)を含むC.ムコサリス、プライマーセットがAGAGCTGGGCTTACAAGAGCTATTACA(配列番号41)及びGGTAAAATCGCTTGAAACGCTCTAT(配列番号42)を含むC.フェタス亜種フェタス、プライマーセットがCGGTCAAAAGATGACTTTTGAAGTACTT(配列番号43)及びGCTTCCCTGCCACGAGCT(配列番号44)を含むC.ハイオインテスティナリス、プライマーセットがAGCTTTACTTGCTGCAAGAGGAAGA(配列番号45)及びAGGAAGCGTTCCAACAGAAAAGTT(配列番号46)を含むC.スプトルム生理型スプトルム、プライマーセットがCAATAACATACGCACACCAGATGGA(配列番号47)及びCAGGCACTTTAACGCTCACTATGG(配列番号48)を含むC.ヘルベティカス、プライマーセットがGCTTACGCGTGTAATTACAAACTATGTC(配列番号49)及びAATTGCCTTAGCCTCGATAGGG(配列番号50)を含むC.ウプサリエンシス、並びにプライマーセットがCTATGTTCGTCCTATAGTTTCTAAGGCTTC(配列番号51)及びCCAGCACTATCACCCTCAACTAAATAA(配列番号52)を含むC.ラリ
及び
c)DNAの標的配列の増幅産物の存在を迅速に検出して、特定のカンピロバクター種の存在を直接特定するステップ - 増幅を、リアルタイムPCR条件下で実施し、リアルタイム分析により増幅産物を検出及び定量する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 直接PCRによりカンピロバクターの種を同定するためのキットであって、プライマーセットの混合物と制限酵素Ddel若しくはXspl又は二重消化としてMbol及びHind IIIの組合せとを備え、前記混合物が、特定のカンピロバクター種のgyrB配列に相補的であり、かつPCR−RFLP後にカンピロバクターの種を同定することができるオリゴヌクレオチドプライマー:
即ちC.ジェジュニに対するCGTCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTTATC(配列番号5)及びTATAGCTTGGAAAGATCTTTCCCTACCTTG(配列番号6)を含むプライマーセット混合物、C.コリに対するCGCCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTCATC(配列番号7)及びTATAGCTTGAAAAGATCTTTCTCTACCTTG(配列番号8)を含むプライマーセット、C.コンシサスに対するAGACAAGAATTTGCAAAAGGTATCCCTCAA(配列番号9)及びAATCGCTTGAAAAGATCTTTCTCTTCCTTG(配列番号10)を含むプライマーセット、C.カーブスに対するAGGCAAGAATTTCAAAAAGGTATCCCGGTA(配列番号11)及びTATCGCCTGAAAAACTCTATCACGTCCTTG(配列番号12)を含むプライマーセット、C.ショウアエに対するAGACAAGAATTTTCAAAAGGTATCCCTCAA(配列番号13)及びGATCGCCTGAAATACGCGGTCGCGTCCTTG(配列番号14)を含むプライマーセット、C.ムコサリスに対するAGGCAAGAATTTGCAAAAGGAATTCCAGTA(配列番号15)及びAATCGCTTGAAATACTCTATCGCGTCCTTG(配列番号16)を含むプライマーセット、C.フェタス亜種フェタスに対するCGTCAAGAGTTTTCAAAAGGAATACCCCAA(配列番号17)及びAATCGCTTGAAACACACGGTCACGACCCTG(配列番号18)を含むプライマーセット、C.ハイオインテスティナリスに対するCGCCAAGAATTCGCCGAAGGCATACCTCAA(配列番号19)及びAATCGCTTGAAACGCTCTATCACGACCTTG(配列番号20)を含むプライマーセット、C.スプトルム生理型スプトルムに対するAGACAAGAGTTTTCAAAAGGTGTTCCTACA(配列番号21)及びTATCGCTTGAAATGCTCTATCACGACCTTG(配列番号22)を含むプライマーセット、C.ヘルベティカスに対するAGACAAGAATTTTCTAAAGGTCTAATTGCA(配列番号23)及びGATGGCTTGAAAAACTCTATTTCTACCTTG(配列番号24)を含むプライマーセット、C.ウプサリエンシスに対するCGCCAAGAATTTGCTAAAGGGCAAATAGCT(配列番号25)及びAATCGCTTGAAAAGCCCTTTCACGCCCCTG(配列番号26)を含むプライマーセット、並びにC.ラリを検出するためのAGACAAGAATTTTCAGAAGGAAAAGTAACA(配列番号27)及びAATAGCTTGAAAAGTTCTTTCTCTACCTTG(配列番号28)を含むプライマーセット
を含むキット。 - ポリメラーゼ連鎖反応により少なくとも12のカンピロバクター種を検出及び種同定するためのキットであって、以下の特定のカンピロバクター種のgyrB配列に相補的であり、かつ特定のカンピロバクター種の存在を検出することができるプライマー:
即ちC.ジェジュニに対するAGAATGGGTTTAACTCGTGTGATAAGT(配列番号29)及びTACCACGCAAAGGCAGTATAGCT(配列番号30)を含むプライマーセット、C.コリに対するAAATGCTAGTGCTAGGGAAAAAGACTCT(配列番号31)及びTGAGGTTCAGGCACTTTTACACTTACTAC(配列番号32)を含むプライマーセット、C.コンシサスに対するAGCGGGCCTAACAAGAGTTATTACA(配列番号33)及びTGTAAGCACGTCAAAAACCATCTTT(配列番号34)を含むプライマーセット、C.カーブスに対するCTGCCAAAGTAAGGACGCAAGTATA(配列番号35)及びGGCAAGATCGCCTGAAATACG(配列番号36)を含むプライマーセット、C.ショウアエに対するAGGGTTTAAGCATAGGAACGCTG(配列番号37)及びCACCAGATAAAGCTCGCTGATCG(配列番号38)を含むプライマーセット、C.ムコサリスに対するTGCGATTATGAACAAGGCCCTA(配列番号39)及びTCGCTTGAAACACACGGTCA(配列番号40)を含むプライマーセット、C.フェタス亜種フェタスに対するAGAGCTGGGCTTACAAGAGCTATTACA(配列番号41)及びGGTAAAATCGCTTGAAACGCTCTAT(配列番号42)を含むプライマーセット、C.ハイオインテスティナリスに対するCGGTCAAAAGATGACTTTTGAAGTACTT(配列番号43)及びGCTTCCCTGCCACGAGCT(配列番号44)を含むプライマーセット、C.スプトルム生理型スプトルムに対するAGCTTTACTTGCTGCAAGAGGAAGA(配列番号45)及びAGGAAGCGTTCCAACAGAAAAGTT(配列番号46)を含むプライマーセット、C.ヘルベティカスに対するCAATAACATACGCACACCAGATGGA(配列番号47)及びCAGGCACTTTAACGCTCACTATGG(配列番号48)を含むプライマーセット、C.ウプサリエンシスに対するGCTTACGCGTGTAATTACAAACTATGTC(配列番号49)及びAATTGCCTTAGCCTCGATAGGG(配列番号50)を含むプライマーセット、並びにC.ラリに対するCTATGTTCGTCCTATAGTTTCTAAGGCTTC(配列番号51)及びCCAGCACTATCACCCTCAACTAAATAA(配列番号52)を含むプライマーセット
を含むキット。
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