JP5610395B2 - カンピロバクターの種同定のための遺伝的方法 - Google Patents

Description

本発明は、細菌のＤＮＡの負の超らせん形成を触媒するタイプIIトポイソメラーゼであるＤＮＡジャイレースのサブユニットＢタンパク質をコードするジャイレースＢ遺伝子と、カンピロバクターｇｙｒＢ遺伝子における配列多型と、複数のカンピロバクター種を区別するための、種特異的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイ並びに制限酵素Ddel及びXspl、又はMbol及びHind IIIの組合せを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ制限酵素断片長多型）法と、カンピロバクターを種同定する方法とに関する。
［関連技術］

カンピロバクター属菌（Campylobacter spp.）は、米国、日本、及びその他の先進国における、細菌性胃腸感染症の最も一般的な原因である。感染症は、幼児、小児、及び２０〜４０歳の成人の発症率が最も高い。カンピロバクター感染症に罹患する主要なリスク要因は、発展途上国を訪問することである。カンピロバクター属菌によるヒト感染症の大部分は突発性であるか、又は大規模な集団感染というよりは、家庭ごとの小規模な発生である。このため疫学的調査による感染源の特定が困難である。カンピロバクター属菌の保菌動物は多く、例として、ウシ、ヒツジ、家禽、及びブタが挙げられるが、突発性感染症の主な動物源は家禽である（Corry et al. 2001. J. Appl. Microbiol. 90:96S-114S; Manning et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69: 6370-6379; Nielsen, E. M. 2002. Lett. Appl. Microbiol. 35: 85-89）。Friedman et al.による最近の集団症例対照研究（2004. Clin. Infect. Dis 38 (Suppl 3): 285-296）では、家禽、特にレストランで調理される家禽の消費が、米国における突発的なヒトカンピロバクター感染症の主要なリスク要因であることが示されている。イヌ及びネコを含む家庭のペット類もまた、カンピロバクター感染症の原因である（Damborg et al. 2004. J. Clin. Microbiol. 42: 1363-1364; Moser et al. 2001. J. Clin Microbiol. 39: 2548-2557）。動物源の他に、汚染された野菜及び貝類もまた、カンピロバクター感染症と関連性があるといわれている（Altekruse et al. 1994. J. Am. Vet. Assoc. 204:57-61; Jacobs-Reitsma, W. 2000. In: Campylobacter, Nachamkin and Blaser, eds., ASM Press, Washington, D.C., pages 467-481）。そして、汚染された水道水もまた、点流行源（point-source outbreaks）であることが示唆されている(Goossens et al. 1995. J. Infect. Dis. 172: 1298-1305; Hanninen et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1391-1396)。

カンピロバクター属は、１６の種及び６の亜種からなる（On, S. L. W. 2001, J. Appl. Microbiol. 90: 1S-15S）。いくつかの種は、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、及びネコをはじめとする動物の疾患を引き起こす（Lastovica et al. 2000. In: Campylobacter, Nachamkin and Blaser, eds., ASM Press, Washington, D.C., pages 89-120）。好熱性の種であるＣ（カンピロバクター）．ジェジュニ、Ｃ．コリ、Ｃ．ラリ、及びＣ．ウプサリエンシス、その中でも特にＣ．ジェジュニは、大部分のヒト感染症の原因となる。しかしその他の種もヒトの下痢、歯周病（Ｃ．コンシサス、Ｃ．グラシリス、Ｃ．レクタス及びＣ．ショウアエ）、髄膜炎、及び敗血症と関連性があるといわれている（上記Lastovica et al.）。例えばＣ．ラリは、水が媒介する胃腸炎の流行と関連があり（Borczyk et al. 1987. Lancet 1: 164-165）、Ｃ．ウプサリエンシスはブリュッセルの４ヶ所の託児所で集団感染を引き起こし、４４人の子供が感染した（上記Goossens et al.）。Ｃ．ジェジュニ及びＣ．フェタス亜種フェタスでは、ウィスコンシンで晩餐会に出席した人々が摂取した生乳によって集団感染が発生した（Klein et al. 1986. JAMA 255: 361-364）。またその他の多くの種が、下痢患者の便から分離されている（上記Lastovica et al.）。カンピロバクターの検出、分離、及び分類に用いられる現在の培養方法及び表現型識別方法（phenotypic method）の技術的限界により、ジェジュニ以外の種は、臨床試料において過小報告されている可能性が高い。ジェジュニ以外のカンピロバクター種に関し、感染源、感染経路、及び疾患症候群を特定するための、さらなる調査が必要である。

カンピロバクターの検出及び種同定を目的として、数多くの方法が記載されてきた。これらの方法には、１６ＳｒＲＮＡ配列分析（Gorkiewicz et al. 2003. J. Clin Microbiol. 41: 2537-2546）及びＰＣＲアッセイ（Junior et al. 2003. Pesqui. Odontol. Bras. 17: 142-146, 21）を用いた単一の種を検出するための、又はｒＲＮＡ遺伝子に基づく種同定のための方法が含まれる。カンピロバクター属菌の１６ＳｒＲＮＡ配列を標的とする蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイ後に融解ピーク分析を行うことにより、数種の種が検出及び同定された（Logan et al. 2001. J. Clin. Microbiol. 39: 2227-2232）。推定ＧＴＰアーゼを標的とする種特異的プローブを用いることに基づく、逆ハイブリダイゼーション・ラインプローブアッセイ法により、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、Ｃ．ラリ、及びＣ．ウプサリエンシスを識別することができた（van Doorn et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1790-1796）。On及びHarrington（2000. FEMS Microbiol. Lett. 193: 161-169）は、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）法に基づく技術を用い、カンピロバクター種を識別した。しかしこの方法は、生成されるＡＦＬＰのパターンが複雑であるため、結果の解釈が難しい。またＡＦＬＰ法には高価な機器が必要であり、このため多くの研究室においてこの技術の使用が妨げられる可能性がある。近年、Mandrellら（2005. Appl. Environ. Microbiol. 71:6292-6307）は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法を用いたＣ．コリ、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ヘルベティカス、Ｃ．ラリ、Ｃ．スプトルム、及びＣ．ウプサリエンシスの種識別方法について記載した。カンピロバクターの種特異的遺伝子及びｒＲＮＡ領域のＰＣＲ増幅に基づくＰＣＲ−マイクロアレイ法の後に、固定プローブにハイブリダズさせる方法が開発された（Kerama et al. 2003. Mol. Cell Probes 17: 187-196; Volokhov et al. 2003. J. Clin. Microbiol. 41: 4071-4080）。

ＰＣＲ制限酵素断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法として知られるＰＣＲアンプリコンの制限酵素分析は、好熱性のカンピロバクターの識別を含む食品媒介性病原菌の分子的解析（molecular characterization）に有用なツールである（Engvall et al. 2002. J. Appl. Microbiol. 92: 47-54）。増幅後、１又は複数の制限酵素を用いてＰＣＲ産物を分解し、遺伝子のＤＮＡ配列に基づき特定のサイズの断片を作製する。鞭毛ｆｌａＡ遺伝子及び／又はｆｌａＢ遺伝子に基づくＰＣＲ−ＲＦＬＰ技術を用い、複数のカンピロバクター株の種同定及び細分類（subtyping）が行われた（Harrington et al. 2003. J. Appl. Microbiol. 95: 1321-1333; Koenraad et al. 1995. Epidemiol. Infect. 115: 485-494; Stern et al. 1997. Avian Dis. 41: 899-905）。しかしｆｌａＡ遺伝子及びｆｌａＢ遺伝子のゲノム内組換え及びゲノム間組換えは、この方法を用いるときに見られる変異性（variability）の原因となる場合がある（Harrington et al. 1997. J. Clin. Microbiol. 35: 2386-2392）。環境中の、これらの生物の流行を判定するための有効な監視及び調査、並びにヒト感染症の疫学調査（epidemiology）の明確化のためには、異なるカンピロバクター種を正確に識別する能力を有する遺伝子型分析法の開発が不可欠である。

ジャイレースＢ遺伝子は、細菌ＤＮＡの負の超らせん（negative supercoiling）を触媒するタイプIIトポイソメラーゼの一種である、ＤＮＡジャイレースのサブユニットＢタンパク質をコードする。Yamamoto及びHarayama（1995. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1104-1109）は、シュードモナス・プチダ種では、１６ＳｒＲＮＡよりもｇｙｒＢの方が塩基置換の頻度が高く、したがって任意の属における細菌種を識別する能力は、１６ＳｒＲＮＡよりもｇｙｒＢのほうが高いことを見い出した。バシラス属菌及びビブリオ属菌については、ｇｙｒＢに基づく種同定方法及び種検出方法が開発された（Venkateswaren et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 681-687; Yamada et al. 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1483-1490）。病原性のカンピロバクター種を特異的に同定し、且つ識別することができる方法及び特異的プライマーが必要とされている。

Corry et al. 2001. J. Appl. Microbiol. 90:96S-114S; Manning et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69: 6370-6379; Nielsen, E. M. 2002. Lett. Appl. Microbiol. 35: 85-89 Friedman et al. 2004. Clin. Infect. Dis 38 (Suppl 3): 285-296 Damborg et al. 2004. J. Clin. Microbiol. 42: 1363-1364; Moser et al. 2001. J. Clin Microbiol. 39: 2548-2557 Altekruse et al. 1994. J. Am. Vet. Assoc. 204:57-61 Jacobs-Reitsma, W. 2000. In: Campylobacter, Nachamkin and Blaser, eds., ASM Press, Washington, D.C., pages 467-481 Goossens et al. 1995. J. Infect. Dis. 172: 1298-1305 Hanninen et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1391-1396 On, S. L. W. 2001, J. Appl. Microbiol. 90: 1S-15S Lastovica et al. 2000. In: Campylobacter, Nachamkin and Blaser, eds., ASM Press, Washington, D.C., pages 89-120 Borczyk et al. 1987. Lancet 1: 164-165 Klein et al. 1986. JAMA 255: 361-364 Gorkiewicz et al. 2003. J. Clin Microbiol. 41: 2537-2546 Junior et al. 2003. Pesqui. Odontol. Bras. 17: 142-146, 21 Logan et al. 2001. J. Clin. Microbiol. 39: 2227-2232 van Doorn et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1790-1796 On and Harrington（2000. FEMS Microbiol. Lett. 193: 161-169） Kerama et al. 2003. Mol. Cell Probes 17: 187-196; Volokhov et al. 2003. J. Clin. Microbiol. 41: 4071-4080 Engvall et al. 2002. J. Appl. Microbiol. 92: 47-54 Harrington et al. 2003. J. Appl. Microbiol. 95: 1321-1333; Koenraad et al. 1995. Epidemiol. Infect. 115: 485-494 Koenraad et al. 1995. Epidemiol. Infect. 115: 485-494; Stern et al. 1997. Avian Dis. 41: 899-905 Harrington et al. 1997. J. Clin. Microbiol. 35: 2386-2392 Harayama, 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1104-1109 Venkateswaren et al. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64: 681-687 Yamada et al. 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1483-1490

本発明者らは、簡単かつ迅速な種特異的ＰＣＲアッセイ法及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に用いた場合に、カンピロバクターｇｙｒＢ遺伝子における配列多型を識別でき、且つ病原性のカンピロバクター近縁種を識別することができる複数のオリゴヌクレオチド配列を発見した。

この発見を踏まえた本発明の目的は、病原性のカンピロバクター近縁種を特異的に検出且つ同定するための、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ用の種特異的プライマーを提供することである。

本発明の更なる目的は、前記新規なプライマーを活用するための、種特異的ＰＣＲアッセイ法及び種特異的ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を提供することである。

本発明の更なる目的は、カンピロバクター近縁種の検出及び識別に用いるキットを提供することである。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の記載から直ちに明らかである。

ｇｙｒＢ遺伝子の１０２０ｂｐのデータから算出した、近隣結合法を用いたカンピロバクター株の系統樹を示す。スケールバーは、ヌクレオチド部位あたり０．１変化を示す。 表３に示すプライマーからなるユニバーサルＰＣＲ混合物を用いた、カンピロバクターｇｙｒＢ遺伝子の増幅断片を示す。Ｃ．ジェジュニ（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。 Ｃ．ジェジュニ（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ddel）パターンを示す。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。 Ｃ．ジェジュニ（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Xspl）パターンを示す。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。 Ｃ．ジェジュニ（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Mbol及びHind III）パターンを示す。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。 以下のカンピロバクター種特異的ＰＣＲアッセイから得られた産物を示す。Ｃ．ジェジュニ（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。 カンピロバクター種の種特異的同定を示す。各レーンは、１２の各カンピロバクター属菌に由来する、プライマー１セット及びＤＮＡを用いたＰＣＲアッセイの結果を表している。Ｃ．ジェジュニプライマー（第１レーン）、Ｃ．コリ（第２レーン）、Ｃ．コンシサス（第３レーン）、Ｃ．カーブス（第４レーン）、Ｃ．ショウアエ（第５レーン）、Ｃ．ムコサリス（第６レーン）、Ｃ．フェタス（第７レーン）、Ｃ．ハイオインテスティナリス（第８レーン）、Ｃ．スプトルム（第９レーン）、Ｃ．ヘルベティカス（第１０レーン）、Ｃ．ウプサリエンシス（第１１レーン）、及びＣ．ラリ（第１２レーン）。レーンＭは、１００ｂｐの分子サイズマーカーである。

カンピロバクター種を明確に同定することは困難である。なぜならこれらの病原菌は増殖が遅く、培養しにくい生物であり、差異を表す表現型特性をほとんど示さないからである（On, S. L. W. 1996, Clin. Microbiol. Rev. 9: 405-422）。カンピロバクター種、アーコバクター種、及びヘリコバクター種の従来の分類方法の例としては、抗生物質耐性分析、増殖要件、及び生化学的検査等に基づく表現型試験が挙げられる。これらの試験の結果は曖昧なことが多く、カンピロバクターの新種又は異型種（atypical species）の同定には適用できない。

別法として、分子的技法を用いて微生物の分類及び検出を行うことができる。Gorkiewicz et al.（上記）は、カンピロバクター種の同定における１６ＳｒＤＮＡシークエンシングの有用性について報告している。種の同定にＤＮＡシークエンシングを用いることは、実用的ではない。なぜならＤＮＡシークエンシングはコストが高く、データ分析が多少複雑だからである。したがって本発明者らは、ｇｙｒＢ遺伝子配列分析に基づきカンピロバクター種を明確に同定するため、直接ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰを適用することに焦点をあてた。ＰＣＲ法は迅速で実施が容易であり、実用の費用が比較的安価である。Yamamoto及びHarayama（上記）は、ｇｙｒＢ遺伝子を細菌種の分子的分類マーカー（molecular taxonomic marker）として用いることを提案した。前記ｇｙｒＢ遺伝子はハウスキーピング遺伝子であり、ＤＮＡの複製には必須である。この遺伝子は、細菌ゲノム上に単一のコピーとして存在するが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は通常、細菌中に複数のコピーが存在する。

本研究に用いたｇｙｒＢ遺伝子部分配列から構築した近隣結合系統樹の主要な形態（topology）は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列から構築された、既に報告されているもの（Gorkiewicz et al.、上記）と似ていた。しかしｇｙｒＢは、カンピロバクター種に対する分解能がより高く、種間の配列類似性は、１６ＳｒＲＮＡについて報告されている類似性（８９〜９９％の範囲）（Gorkiewicz et al.、上記）と比較して低い（５８．３〜８９．２％の範囲）。しかしＣ．フェタス亜種フェタス株及びＣ．フェタス亜種ベネレアリス株は、同一のｇｙｒＢ遺伝子配列を有しており、これはカンピロバクターを亜種レベルで同定するには、ｇｙｒＢが適当なマーカーではない場合があることを示している。Gorkiewicz et al.（上記）は、１６ＳｒＤＮＡ分析の限界は、Ｃ．ジェジュニ株及びＣ．コリ株並びに異型Ｃ．ラリ株を識別できないことであると報告した。どちらの種も同じ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を有し、これらの分類群のほぼ全ての株が、同じ集団に分けられた。上記研究者らは、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、及び異型Ｃ．ラリは重要な病原菌であるので、これらの種の識別を可能とすることが重要であると述べた。１６ＳｒＤＮＡ分析はこれらの種の識別に適切ではないので、ＰＣＲ又は表現型特性に基づく方法等の他の方法を用いなければならない。一方、本発明者らのｇｙｒＢ遺伝子配列分析ではこれらの３つの種を識別できた。本研究で調べた複数のＣ．ジェジュニ株は同一の配列を有し、調査したカンピロバクター１２種のうち、Ｃ．ジェジュニとＣ．コリとは類似性が最も高かった（８９.２％）にもかかわらず、Ｃ．ジェジュニとＣ．コリとは明確に識別できた。さらに本系統樹においては、Ｃ．ラリは他の種とは異なる位置に配置された。これらの結果は、カンピロバクター種の同定において、１６ＳリボソームＤＮＡ遺伝子よりもｇｙｒＢ遺伝子のほうが勝っていることをさらに裏づけるものである。試験したＣ．フェタス及びＣ．ハイオインテスティナリス株には、他の種とは異なる３ｂｐの挿入がｇｙｒＢ遺伝子の同じ位置（８２３〜８２５）にあり、この結果かかるタンパク質配列にアミノ酸の付加が生じたことは注目に値する。

Ｔｍ値が必ず高くなり（３０塩基に対して５８℃）且つ、全ての種のｇｙｒＢ遺伝子の９６０ｂｐ領域を増幅するように、カンピロバクター１２種のＰＣＲ−ＲＦＬＰ分類用ｇｙｒＢユニバーサルプライマーセットを設計した。ＲＦＬＰ分析用の標的アンプリコンを十分量で得られるように、ＰＣＲ条件を最適化した（図２）。Ddel及びXsplを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析では、種特異的な差異が示された（図３及び図４）。別法としてMbol及びHind IIIを用いた二重消化によって、全てのカンピロバクター種を識別することもできる（図５）。

ｇｙｒＢシークエンシングのデータは、直接ＰＣＲによりカンピロバクター種を迅速に検出、同定するための種特異的プライマーセットの設計を可能にした。結果として得られた種特異的プライマーにより、標的種由来の、予想したサイズの対応ｇｙｒＢ遺伝子アンプリコンだけが得られた（図６）。前記プライマー配列は、各々の種のｇｙｒＢ領域から選択され、他の種のｇｙｒＢ遺伝子配列との不一致は、少なくとも７塩基であった。最終的に、高いアニーリング温度（６５〜６９℃）を使用しＭｇＣｌ_２濃度を最適化したことにより、ＰＣＲによる極めて種特異的な同定が達成された。

Karenlapi et al.（2004. J. Clin. Microbiol. 42: 5731-5738）は、ｇｒｏＥＬ部分シークエンシング及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析は、１６ＳｒＲＮＡに基づく分析よりも、カンピロバクターの種特異的同定能力が高いことを示した。本研究において本発明者らは、ｇｙｒＢ遺伝子部分シークエンシング、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析、及び種特異的プライマーセットを用いた直接ＰＣＲ分析が、１２のカンピロバクター種の明確な識別に適用できることを示した。前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析は、ＰＣＲで増幅した配列における酵素認識部位の存在に依存している。したがって、ＰＣＲ増幅中に生じる場合がある誤り及び標的遺伝子における突発的な変異の発生が、結果に影響する可能性は常に存在する。将来的に、別のＰＣＲ−ＲＦＬＰの特性パターン（profile pattern）が現れた場合には、直接ＰＣＲ法を用いてカンピロバクター種の同定を裏付けることができる。

結論として、本発明者らは１２のカンピロバクター種のｇｙｒＢ遺伝子領域をシークエンシングし、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法及び直接ＰＣＲアッセイ法を開発した。これは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づく類似した分析法よりも、カンピロバクター種の同定に適しているはずである。ｇｙｒＢ遺伝子配列情報は、カンピロバクターの新種に関する分類学的研究に有用であろう。カンピロバクターの新種が発見されるたびにｇｙｒＢ遺伝子をシークエンシングし、かかる新種用の特異的ＰＣＲプライマーセットを設計することができる。本発明者らは現在、Ｃ．グラシリス、Ｃ．レクタス、Ｃ．ホミニス、及びＣ．ラニエナエのｇｙｒＢ遺伝子のシークエンシングを行っており、これらの種を検出、識別するためのＰＣＲアッセイ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイも開発する。これらの方法は、カンピロバクター種の迅速な検出及び明確な同定のための非常に有用なシステムを提供するものであり、これにより手間のかかる表現型分析及び生化学的分析を用いることが必要な、時間を要する従来の方法にとって代わることができる。食物試料、動物試料、及び環境試料から分離したカンピロバクター種を同定するため、本研究で開発したＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ及び直接ＰＣＲアッセイの実用性を確認するさらなる研究が必要である。

本明細書において、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド配列」なる用語は互換的に用いられる。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドとは、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡポリマー又はＤＮＡポリマーであり、必要に応じて合成された非天然又は改変されたヌクレオチド塩基を含んでいる。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、１又は複数のｃＤＮＡセグメント、ゲノムＤＮＡセグメント、合成ＤＮＡセグメント、又はそれらの混合物からなる。

「単離された」ポリヌクレオチドなる用語は、他の染色体並びに染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ等の他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。前記他の核酸配列とは天然に存在する環境では通常、前記ポリヌクレオチドに付随（accompany）する、又は前記ポリヌクレオチドと相互作用する核酸配列である。しかし単離されたポリヌクレオチドは、元来染色体外ＤＮＡとして存在していた可能性のある、前記単離されたポリヌクレオチド内におけるヌクレオチド挿入物（nucleotide insertion）として存在するポリヌクレオチド配列を含む場合がある。単離されたポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドが天然に発生する宿主細胞から精製することができる。当業者に知られている従来の核酸精製方法を用いて、単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。単離されたポリヌクレオチドなる用語はまた、組換えポリヌクレオチド及び化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。

本明細書において、「制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ）」なる語は、生物のＤＮＡ切断（cleavage）に由来するパターンを分析することにより、生物を識別する技術である。２つの生物間で特定の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位間の距離が異なる場合、制限酵素でＤＮＡが消化されて生じる断片の長さが異なる。得られたパターンの類似性を用いて、複数の種又は株を互いに区別することができる。非常に少量のＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＲＦＬＰ分析に必要な水準にまで増幅することができる。本明細書においてこれを、ＰＣＲ−ＲＦＬＰと呼ぶ。

本明細書において「組換え」とは、制限酵素、リガーゼ、及び類似の遺伝子工学技術を用いた遺伝物質の操作により得られた核酸分子を意味する。前記遺伝子工学技術は例えば、Sambrook et at. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYor DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I and II (Ed. D. N. Glover), IRL Press, Oxford, 1985に記載されている。本明細書における「組換え」なる用語は、天然に発生する遺伝子組換えを意味しない。

本明細書において、「発現する」又は「発現」なる用語は、転写のみを意味すると定義される。制御因子は遺伝子のコード配列に操作可能に連結しており、これにより、前記制御因子は、前記遺伝子の発現を制御することができる。

本明細書において、「コードする」、「コード」、又は「コードされた」なる用語が特定の核酸に関して用いられた場合、ヌクレオチド配列が特定のタンパク質へと翻訳されるよう誘導するのに必須の情報を、前記核酸が含むことを意味する。かかる情報はタンパク質をコードするものであり、コドンを用いて特定される。任意のタンパク質をコードする任意の核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えばイントロン）を含む場合もあるが、そのような非翻訳配列が割り込んでいない場合もある（例えばｃＤＮＡの場合）。

「操作可能に連結した」なる用語は、単一の核酸断片上で２以上の核酸断片が結合（association）し、それにより一方の機能が他方の影響を受けることを意味する。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、前記プロモーターは前記コード配列に操作可能に連結している（即ち、前記コード配列は前記プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向、又はアンチセンス方向の制御配列に操作可能に連結させることができる。

「制御配列」とは、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、又はコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード配列）であって、転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。

「プロモーター」とは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。コード配列は通常、プロモーター配列の３’に位置する。

「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写から生じる産物を意味する。前記ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列に完全に相補的なコピーである場合、かかるＲＮＡ転写物を一次転写物という。或いは前記ＲＮＡ転写物が、前記一次転写物の転写後プロセシングにより得られたＲＮＡ配列である場合もあり、これを成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを有さず、細胞によりポリペプチドへと翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型から得られた、かかるｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを意味する。前記ｃＤＮＡは一本鎖であるか、又は例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノー断片（Klenow fragment）を用いて二本鎖へと変換することができる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物であって、したがって細胞によりポリペプチドへと翻訳され得るＲＮＡ転写物である。「アンチセンス」なる用語が特定のヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、言及された転写産物の相補鎖を意味する。

「タンパク質」又は「ポリペプチド」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード配列によって決定される特定の順序で配置されたアミノ酸の鎖である。各タンパク質又はポリペプチドは、固有の機能を有する。

本明細書において、「実質的に純粋な」なる用語は、天然においては連結している他のタンパク質、脂質、糖質、又はその他の物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。当業者であれば、前記タンパク質を標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができる。前記ポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析によって決定することもできる。

本明細書において、「実質的に同様な」なる用語は、１又は複数のヌクレオチド塩基の変化により１又は複数のアミノ酸置換が生じているが、かかるヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの機能的特性が影響を受けていない核酸断片を意味する。「実質的に同様な」なる用語はまた、結果的に生じる転写物の機能的特性に実質的に影響しないヌクレオチドの欠失又は挿入等の、本発明の核酸断片の修飾を意味する。したがって本発明は、特定の例示的なヌクレオチド配列又はアミノ酸配列以上のものを包含し、これらの配列の機能的同等物をも包含すると理解される。所定の部位において化学的に同等なアミノ酸を産生し、コードされたポリペプチドの機能的特性に影響を及ぼさない核酸配列の改変は、当技術分野において周知である。

さらに実質的に同様の核酸断片は、そのハイブリダイズする能力によって特徴づけることもできる。そのような相同性の評価は、当業者であれば十分に理解しているように、ストリンジェントな条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによってもたらされる(1985. Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, U.K.)。本明細書において、「ハイブリダイゼーション」なる用語は、塩基対合により核酸の鎖が相補鎖と結合してハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを用いた、相補的な核酸の対合に関連して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（即ち核酸間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェント性、形成されたハイブリッドの熱融解点（Ｔｍ）、及び核酸内のＧ：Ｃ比率等の要因に影響される。ストリンジェントな条件を調整して、関係の遠い生物由来の相同配列等の、類似性が中程度の断片のスクリーニング及び、関係の近い生物由来の、機能的酵素を複製する遺伝子等の極めて類似している断片のスクリーニングを行うことができる。したがって、本明細書に開示されているｇｙｒＢ配列又はその断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ｇｙｒＢポリペプチドをコードする単離された配列は、本発明に包含される。

本発明の実質的に同様の核酸断片はまた、前記核酸断片がコードするアミノ酸配列と、本明細書に開示されているアミノ酸配列との配列間一致率（percent identity）によって特徴づけることもでき、前記配列間一致率は、当業者が一般的に用いるアルゴリズムで決定される。

比較のための配列アラインメント法は、当技術分野において公知である。上記のように、２つの配列の配列間一致率は数学アルゴリズムを用いて決定することができる。限定するものではないが、かかる数学アルゴリズムの例として、Myers及びMillerのアルゴリズム (1988. CABIOS 4:11-17)、Smithらの局所相同性アルゴリズム（1981. Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman及びWunschの相同性アラインメントアルゴリズム（1970. J. Mol. Biol. 48:443-453)、Pearson及びLipmanの類似性検索法（1988. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448、Karlin 及びAltschul（1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)において改変された、Karlin及び Altschulのアルゴリズム（1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264)が挙げられる。

これらの数学アルゴリズムのコンピューター実装(implementations)を、配列を比較して配列同一性を決定するために利用することができる。限定するものではないが、前記実装の例としては、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中の ＣＬＵＳＴＡＬ （カルフォルニア州、マウンテンビュー、Intelligenetics社製）、ＡＬＩＧＮ プログラム (バージョン２．０) 、及びウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ、バージョン８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、 及びＴＦＡＳＴＡ（米国、ウィスコンシン州、マジソン、サイエンス・ドライブ５７５、Genetics Computer Group (GCG)社製）が挙げられる。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて実施することができる。

別段の記載がない限り、配列アラインメント及び配列間一致率の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューター・パッケージソフトのメガライン・プログラム （ウィスコンシン州、マジソン、DNASTAR Inc.社製）又はその任意の同等プログラムを用いて実施した。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１．０）を用い、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ アラインメント法（Higgins and Sharp (1989. CABIOS 5:151-153)）を用いて実施した。また、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ アラインメント法を用いた対合アラインメントのデフォルトパラメータは、別段の記載がない限り、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１．０、（Slow-Accurate） であった。

本明細書において、２つの核酸配列又は２つのポリペプチド配列に関連して用いられた場合、「配列同一性」又は「同一性」なる用語は、特定の比較ウインドウ（comparison window）上の最大一致率を調べるためにアラインさせたときの、２つの配列における同一の残基を意味している。タンパク質に関連して配列同一性を百分率で用いる場合、同一ではない残基位置（residue position）の相違は、保存的アミノ酸置換であることが多いことが理解される。この場合、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、そのため分子の機能的特性は変化しない。

本明細書において、「配列同一性の百分率」なる用語は、最適にアラインされた比較ウインドウ上の２つの配列の比較により決定した値を意味する。ここで、前記比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列部分は、前記２つの配列アラインメントの最適化のため、基準配列（付加または欠失を有さない）と比較すると、付加又は欠失（即ちギャップ）を有する場合がある。双方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じている位置の数を決定して一致する位置の数を出し、かかる一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、その値に１００を掛けて配列同一性の百分率を計算することができる。

本明細書において、「基準配列」とは配列比較の基礎として用いる、確定した配列である。基準配列は、特定の配列のサブセットでも全体でもよく、例えば完全長ｃＤＮＡのセグメント若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列であってもよい。

ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」なる用語は、標準パラメータを用いて上記に記載したアラインメント・プログラムの１つを実施した場合、任意のポリヌクレオチド配列と基準配列との配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であることを意味する。最適なアラインメントは好ましくは、Needleman et al. （1970. J. Mol. Biol. 48:443）の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて実施される。

ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう一つの示唆は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズするかどうかということである。ストリンジェントな条件は通常、特定の配列の、規定のイオン強度及びｐＨにおける熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。前記Ｔｍは、二本鎖核酸分子の集団の半分が解離して一本鎖になる温度である（中間点）。核酸のＴｍを計算する方程式は、当技術分野で周知である（上記Nucleic acid Hybridization, 1985参照）。本明細書において「ストリンジェント性」なる用語は、温度、イオン強度、及び有機溶媒等の他の化合物の存在といった、核酸のハイブリダイゼーションを実施する条件に関連して用いられる。上記に記載したように、「ストリンジェント性」は、本明細書に別段の条件を設けない限り、所望するストリンジェント性に応じて典型的には、特定の配列のＴｍよりも約５℃低温からＴｍよりも約２０℃〜２５℃低温の範囲で発生する。当業者であれば理解するように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを用いて同一なポリヌクレオチド配列を同定又は検出するか、或いは同様若しくは関連するポリヌクレオチド配列を同定又は検出することができる。

アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「実質部分」には、かかるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が有するタンパク質又は遺伝子の推定的な同定（putative identification）を可能とするに十分なアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が含まれる。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、当業者が手作業で評価（evaluate）することも、又はＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムを採用したコンピューターに基づく配列比較及び同定ツールを用いて評価することもできる。一般的に、任意のポリペプチド又は核酸配列に、公知のタンパク質又は遺伝子との相同性があると推定的に同定するためには、隣接する１０以上のアミノ酸の配列又は隣接する３０以上のヌクレオチドが必要である。さらにヌクレオチド配列に関していえば、配列依存的な遺伝子同定方法及び単離方法において、３０以上の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのプローブが用いられる場合がある。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、１２以上のヌクレオチドを有する短鎖オリゴヌクレオチドをＰＣＲの増幅プライマーとして用いることができる。本明細書において「プライマー」なる用語は、精製された制限消化物におけるように天然に発生するか、又は合成物であるかにかかわらず、任意の核酸鎖に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下（即ち適切な温度及びｐＨでの、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼ等の誘導物質の存在下）に置かれた場合、合成の開始点として作用することができる任意のオリゴヌクレオチドを意味する。前記プライマーは、増幅において最大効率を得るため好ましくは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーはまず、延長産物の調製に用いる前に処理し、その鎖を分離する。前記プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、及び使用する方法を含む多くの要因に依存する。したがってヌクレオチド配列の「実質部分」は、その配列を含む核酸断片の特異的同定、及び／又、単離を可能にするヌクレオチド配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質を含むポリペプチドをコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。当業者であれば、本明細書に記載の配列を有するという利点により、当業者とって公知の目的のために、開示された配列の全体又は実質部分を用いることができる。

「変異体」なる用語は、実質的に同様の配列を意図する。ヌクレオチド配列の場合の保存的変異体には、遺伝コードの縮重により本発明のｇｙｒＢポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。これらのような天然の対立遺伝子変異（allelic variants）は、例えばＰＣＲのような周知の分子生物学的技術を用いて同定することができる。
［実施例］

本発明の概要を記載したが、本発明は以下の特定の実施例を参照してより詳細に理解される。本明細書に記載の実施例は、単に本発明の詳細な説明を目的としており、特許請求の範囲に定義された本発明の範囲の限定を意図するものではない。

［菌株］
各カンピロバクター種について、全部で以下の１９菌株由来のｇｙｒＢ遺伝子の配列を分析した。Ｃ．ジェジュニ４株（表１）並びにＣ．ジェジュニ ＲＭ１２２１ アクセッション番号ＮＣ ００３９１２及びＣ．ジェジュニ亜種ジェジュニ ＮＣＴＣ１１１６８ アクセッション番号ＮＣ ００２１６３；Ｃ．コリ ＮＡＤＣ ５０９５（アイオワ州、エームズ、国立動物疾患センター）；Ｃ．コンシサス ＡＴＣＣ３３２３７（バージニア州、マナッサス、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）；Ｃ．カーブス ＡＴＣＣ３５２２４；Ｃ．ショウアエ ＡＴＣＣ ５１１４６；Ｃ．ムコサリス ＡＴＣＣ４９３５２；Ｃ．フェタス亜種フェタス ＡＴＣＣ１５２９６及びＣ．フェタス ＮＡＤＣ５５１３；Ｃ．フェタス亜種ベネレアリス ＮＡＤＣ５５１９；Ｃ．ハイオインテスティナリス ＡＴＣＣ３５２１７；Ｃ．スプトルム生理型スプトルム（C. sputorum biovar suptorum） ＡＴＣＣ３３５６２；Ｃ．ヘルベティカス ＡＴＣＣ５１２１０；Ｃ．ウプサリエンシス ＡＴＣＣ４９８１６；及びＣ．ラリ ＡＴＣＣ３５２２１。ＰＣＲアッセイの特異性を判定するために本研究で用いたこれらの株及びその他の菌株を表１に列挙する。

［カンピロバクターｇｙｒＢ遺伝子のＰＣＲ増幅及びシークエンシング］
ＡＴＣＣから入手したカンピロバクター株を、ＡＴＣＣが指定する条件に従って増殖させた。これらの株並びに表１に記載のＥ．コリ株及びサルモネラ株由来のゲノムＤＮＡを、PrepMan Ultra Reagent（カルフォルニア州、フォスターシティ、Applied Biosystems社製）を用い、メーカーの使用説明書に従って抽出した。Irene Wesley博士（ＵＳＤＡ、ＡＲＳ、ＮＡＤＣ）のご好意によりＮＡＤＣから入手した、表１に記載した株由来のＤＮＡを塩化セシウム濃度勾配超遠心分離法で精製し、−２０℃で保存した。

ＰＣＲ産物の直接シークエンシング用のｇｙｒＢ遺伝子のＰＣＲ増幅を、GeneAmp9700サーマルサイクラー（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。全ての株のｇｙｒＢ遺伝子領域のｃａ．１，２５０ｂｐ（１２５３又は１２５６ｂｐ）のＰＣＲ増幅のためのユニバーサルプライマーセットは、5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TCG ACC AYG CNG GNG GNA ART TYG A-3'（配列番号１；Ｔ７−ＦＷＤ；５’末端に付着させたＴ７プロモーター配列に下線を付した）及び5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA GCT CGA GCC RTC NAC RTC NGC RTC NGT CAT-3'（配列番号２；ＳＰ６−ＲＥＶ；５’末端に付着させたＳＰ６プロモーター配列に下線を付した）であった。１×ＰＣＲ緩衝液、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６２５ＵのｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（滋賀県、タカラバイオ社製）、４種のｄＮＴＰを各０．２ｍＭずつ、及び各プライマーを０．４μＭずつ含む１００μｌ反応体積中で、１μｌの核酸試料をＰＣＲ増幅した。サイクル条件は次の通りである。９５℃で５分間初期変性後９５℃で１分間、６０℃で１分間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長というサイクルを３０サイクル実施した。１．０（ｗ／ｖ）％のアガロース（滋賀県、タカラバイオ社製）ゲル電気泳動の後、メーカー（カルフォルニア州、バレンシア、Qiagen社）が推奨するQIAquick Gel Extractionキットを用いてＰＣＲ産物をゲル精製した。ABI PRISM dye terminator cycle sequencingキット（Applied Biosystems社製）を用い、精製ＰＣＲ産物の両方の鎖を、サイクル・シークエンシング反応させた。ABI Prism 310自動シークエンサー（Applied Biosystems社製）によって産物を決定した。ＤＮＡシークエンシングに用いたプライマーは、5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TCG AC-3'（配列番号３；Ｔ７ｋａｉ）及び5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA GCT CGA G-3'（配列番号４；ＳＰ６ｋａｉ）である。付着プロモーター（Ｔ７ｋａｉプライマー及びＳＰ６ｋａｉプライマー）配列からの伸長及びプライマーウオーキング法により、両方の鎖のＤＮＡ配列を決定した。

他のカンピロバクター種の同一領域と比較すると、Ｃ．フェタス亜種フェタス（ＡＴＣＣ１５２９６）、Ｃ．フェタス（ＮＡＤＣ５５１３）、Ｃ．フェタス亜種ベネレアリス（ＮＡＤＣ５５１９）、及びＣ．ハイオインテスティナリス（ＡＴＣＣ３５２１７）のｇｙｒＢ配列には、８２３〜８２５位に３塩基の挿入があった。ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース由来のヘリコバクター種のｇｙｒＢ ＤＮＡ配列を、多重アラインメント分析により前記カンピロバクター配列のデータと比較したところ、顕著な相違が観察された（データは示さず）。例えば、カンピロバクター種とヘリコバクター・ピロリとの間のｇｙｒＢ遺伝子配列の類似性は、３８〜４８％の範囲であった。これらのデータは、種の識別のためには１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子よりもカンピロバクターのジャイレースＢ遺伝子のほうが優れていることを示している。

［ＤＮＡ配列の系統発生分析］
ｇｙｒＢ配列の違いが、カンピロバクター種間の識別に使用するに足る信頼性を有するかどうか評価するために、ｇｙｒＢ ＤＮＡ配列の種間変異を定量化する必要があった。１２のカンピロバクター種のｇｙｒＢ配列を、ＤＮＡＳＹＳ Ｐｒｏプログラム（バージョン２．０）（東京、日立）を用いてアラインした。かかるデータを、近隣結合法（Saito and Nei. 1987. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425) 及びＤＤＢＪ (DNA Data Bank of Japan)ウェブサイト(www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html)中のＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム (Tompson et al. 1994. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) を用いた系統発生分析用の入力データとして用いた。１２のカンピロバクターｇｙｒＢ配列の多重アラインメントを実施し、分析された株間の配列変異を示すマトリックスを算出した。その後、これらのデータから系統樹を構成した（図１）。系統樹を分析したところ、１２のカンピロバクター種すべてが、前記構成された系統樹において明確に識別された。ｇｙｒＢ遺伝子の部分配列に基づく前記系統樹の主要な形態（topology）は、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列分析に基づく文献（上記Gorkiewicz et al.）で報告されたものに類似していた.

カンピロバクター種間のｇｙｒＢ遺伝子の部分配列類似性の分析を表２に示す。ｇｙｒＢ ＤＮＡ配列の種間の類似性は５８．３〜８９．２％であったが、６株のＣ．ジェジュニのｇｙｒＢ遺伝子配列は同一であった（データは示さず）。１０２０ｂｐ配列領域でのカンピロバクター種間のｇｙｒＢ配列変異を調べたところ、少なくとも１０％であった。かかるｇｙｒＢ遺伝子ＤＮＡ変異は、Ｃ．フェタスの亜種間の変異を識別するには十分でなかった。Ｃ．フェタス亜種フェタスとＣ．フェタス亜種ベネレアリスとの間には配列の違いがなかった。しかし、Ｃ．フェタス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３３０１０６）とＣ．フェタス亜種フェタス（ＡＴＣＣ１５２９６）との間にはアミノ酸配列の変化を伴わない４塩基の相違が存在した。

［ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる種特異的同定］
種々のカンピロバクター属菌のｇｙｒＢ配列データを、最近隣法（nearest-neighbor method）を用いて計算したＴｍ値をプロットすることにより、配列相違マトリックス表から分析した。各々の種のｇｙｒＢ配列に相補的なプライマーを用いて作製したユニバーサルプライマーミックス（表３）を使用し、各カンピロバクター株由来の９６０ｂｐ ｇｙｒＢ断片を増幅した。

１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．６２５ＵのｒＴａｑ（タカラ社製）ＤＮＡポリメラーゼ、４種のｄＮＴＰを各４００ｍＭずつ、及び前記１２のプライマーセット中のそれぞれのプライマー各１０ｎＭからなるユニバーサルプライマー混合物を含む１００μｌ反応体積中で、１μｌのＤＮＡテンプレートを増幅した（表３）。サイクル条件は次の通りである。９５℃で１０分間初期変性を実施後、変性（９５℃で１５秒）、アニーリング（６０℃で１分間）、及び伸長（７２℃で１分間）というサイクルを５０サイクル実施し、最後に７２℃で７分間伸長を行った。得られた９６０ｂｐＰＣＲ産物を、前記のように１％アガロースゲルで電気泳動した後、ゲル精製した。ＲＦＬＰ分析用に、前記ＰＣＲ産物を、Ddel（大阪府、東洋紡社製）又はXspl（タカラ社製）を各々５Ｕ又は１０Ｕ含む総体積２０μｌ中で消化した。１×トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液中に調製した６．０％アガロース（アガロースＸ、東京、ニッポンジーン社製）を用いて得られた断片を分離した。SYBR Green I dye（カルフォルニア州、カールズバッド、Invitrogen社製）で、メーカーの記載通りに前記ゲルを染色し、紫外線下でＰＣＲ産物を視覚化した。

ユニバーサルプライマーミックスを用いたＰＣＲ増幅により、各カンピロバクター株から、サイズが９６０ｂｐと予想される産物を得た（図２）。コンピューターを用いた９６０ｂｐ増幅領域の制限断片長分析では、Ddel、Hpy188III、及びXsplといった酵素が種特異的消化パターンを生じることが予測された。しかし、Hpy188IIIは、dam（ＤＮＡアデニンメチラーゼ）及びＤＮＡのＣｐＧメチル化に影響される可能性があるので、この酵素は本研究では用いなかった。実際、Hpy188IIIの消化条件を調整するのが困難だったため、この制限酵素を用いて再現性のあるＲＦＬＰ分析データを得るのは困難であった。Hpy188IIIでは酵素安定性に必要なウシ血清アルブミンが要求されるため、反応には低塩濃度が要求された。したがって本研究におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析には、Ddel及びXsplのみを選択した。これら２つの酵素のいずれかを用いた消化により、２００ｂｐ未満の断片が多く生じることが予想された。したがってＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析には６％アガロースゲルの電気泳動を用いた。Ddel及びXsplを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果をそれぞれ、図３及び図４に示す。６％アガロースゲルを用いたところ８０ｂｐという小さな断片を得るポリアクリルアミドゲルに相当する分解能が示された。これらの結果に基づけば、調べたカンピロバクター種すべてが種特異的Xspl及びDdel消化パターンを有していた。したがって、酵素Ddel及びXsplのいずれか又は両方を用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析は、カンピロバクター種の正確な識別のための有用なツールである。さらにＤＮＡＳＩＳプログラムを用いたコンピューター分析では、制限酵素Mbol及びHind IIIの組合せを二重消化として用いたｇｙｒＢ ９６０ｂｐ領域の消化により、１２のカンピロバクター種の明確な同定を予測した。これにより、９６０ｂｐのＰＣＲ産物が実験的に確認された（図５）。

［カンピロバクター種特異的プライマーを用いたＰＣＲ及び特異性試験］
本研究で用いた１２のカンピロバクター種に対する種特異的プライマーセットは、異なる種間で相違する領域に基づいて設計された。種特異的プライマーを用いたＰＣＲアッセイを以下のように実施して、各カンピロバクター種を同定した。鋳型ＤＮＡ（２．５μｌ）を無菌蒸留水で１／１０に希釈し、１×GeneAm PCR Gold緩衝液、AmpliTaq GoldＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems社製）を０．５Ｕ、４種のｄＮＴＰを各２００μＭ、及び種特異的プライマーを各０．２μＭ含む、２５μｌの反応体積中で増幅した。Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、Ｃ．コンシサス、Ｃ．ショウアエ、Ｃ．カーブス、Ｃ．フェタス、及びＣ．ヘルベティカスのサイクル条件は、次の通りである。９５℃で１０分間初期変性、９５℃で２０秒、６９℃で２０秒を３０サイクル、及び７２℃で７分間最終伸長。Ｃ．ウプサリエンシス、Ｃ．ムコサリス、及びＣ．ハイオインテスティナリスについては、アニーリング温度及び時間はそれぞれ６８℃、１分間であり、Ｃ．スプトルムではそれぞれ、６５℃、２０秒であった。最適量のＰＣＲ産物を得るために、異なる種由来のＤＮＡの増幅のために複数のサイクル条件を用いた。かかるＰＣＲ産物を、上記に記載したように２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。表１に記載した各細菌由来のゲノムＤＮＡを用い、１２の異なるカンピロバクター属菌に特異的な各々のＰＣＲアッセイを試験することにより、プライマー特異性を評価した。ＰＣＲ条件は上記と同じであり、アガロースゲル電気泳動（２％）及びエチジウムブロマイド染色後、ＰＣＲ産物を視覚化した。全ての種特異的プライマーは、同様の融解温度を有するよう、また、長さが５００ｂｐ未満のＰＣＲ産物を生じるように設計し、ＰＣＲの効率が高くなるようにした。前記種特異的プライマー配列及び予想されたアンプリコンサイズを図４に示す。

種々のカンピロバクター属菌由来のＤＮＡを増幅後、これらのプライマーを用いたＰＣＲアッセイにより、８６〜４９３ｂｐの範囲のサイズの産物が得られた。これらのプライマーセットは特異的であり、各々の標的カンピロバクター種においてのみ、予期されたＰＣＲ産物を増幅させ（図６）、非標的カンピロバクター種由来のＤＮＡを用いても偽陽性の結果は出なかった（図７）。さらに、試験した非カンピロバクター株由来のＤＮＡでは、非特異的なバンドは観察されなかった（表１に記載の株）。したがって、ｇｙｒＢ配列に基づく種特異的プライマーセットは、ＰＣＲによるカンピロバクター種の迅速な検出及び直接的な同定に非常に有用な可能性がある。

［ヌクレオチド配列アクセッション番号］
本研究で決定されたｇｙｒＢ遺伝子配列は、ＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに以下のアクセッション番号で寄託されている：Ｃ．ジェジュニ ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４６６；Ｃ．コリ ｇｒｙＢ、ＡＢ２９２４６７；Ｃ．コンシサス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４６８；Ｃ．カーブス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４６９；Ｃ．ショウアエ ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７０；Ｃ．ムコサリス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７１；Ｃ．フェタス亜種フェタス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７２；Ｃ．フェタス亜種ベネレアリス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２６１８；Ｃ．ハイオインテスティナリス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７３；Ｃ．スプトルム生理型スプトルム ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７４；Ｃ．ヘルベティカス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７５；Ｃ．ウプサリエンシス ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７６；及びＣ．ラリ ｇｙｒＢ、ＡＢ２９２４７７。

本明細書で言及した刊行物及び特許は全て参照により本明細書に援用されるが、その程度は、上記の各刊行物又は特許が、参照により特に個別に本明細書に援用される旨記載された場合と同一である。

上記の記載並びに本発明の特定の代表的な実施形態及び詳細は、本発明の説明及び記述を目的として示されたものであり、本発明を網羅すること、又は開示された形態に厳密に限定することを意図するものではない。本発明の範囲から逸脱することなく前記実施形態及び記載の様々な改変又は変更が可能であることは、当業者に明らかである。

Claims (3)

1. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法によりカンピロバクターの種を同定する方法であって、以下のステップを含む方法：
   ａ）カンピロバクターのＤＮＡ又は前記カンピロバクターのＤＮＡを含むと推測される被験試料を準備するステップ、
   ｂ）以下の特定のカンピロバクター種のｇｙｒＢ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセット混合物を用いて前記カンピロバクターのＤＮＡの標的配列を増幅するステップ：
   即ちプライマーセットがCGTCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTTATC（配列番号５）及びTTTTAAAATTTTATCTAGTCTTGCTTTTTC（配列番号６）を含むＣ（カンピロバクター）．ジェジュニ、プライマーセットがCGCCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTCATC（配列番号７）及びTTTTAAAATTTTATCTAATCTTGCTTTTTC（配列番号８）を含むＣ．コリ、プライマーセットがAGACAAGAATTTGCAAAAGGTATCCCTCAA（配列番号９）及びCTTTAAAATTTTATCCAGTCTTGCTTTTTC（配列番号１０）を含むＣ．コンシサス、プライマーセットがAGGCAAGAATTTCAAAAAGGTATCCCGGTA（配列番号１１）及びTTTTAAAATTTTATCGAGGCGCGATTTTTC（配列番号１２）を含むＣ．カーブス、プライマーセットがAGACAAGAATTTTCAAAAGGTATCCCTCAA（配列番号１３）及びTTTTAAAATTTTATCTAGTCTTGCTTTTTC（配列番号１４）を含むＣ．ショウアエ、プライマーセットがAGGCAAGAATTTGCAAAAGGAATTCCAGTA（配列番号１５）及びTTTTAAAATTTTATCTAATCTTGATTTTTC（配列番号１６）を含むＣ．ムコサリス、プライマーセットがCGTCAAGAGTTTTCAAAAGGAATACCCCAA（配列番号１７）及びTTTTAAAATTTTATCAAGTCTACTTTTTTC（配列番号１８）を含むＣ．フェタス亜種フェタス、プライマーセットがCGCCAAGAATTCGCCGAAGGCATACCTCAA（配列番号１９）及びTTTAAGAATTTTATCAAGCCTACTTTTTTC（配列番号２０）を含むＣ．ハイオインテスティナリス、プライマーセットがAGACAAGAGTTTTCAAAAGGTGTTCCTACA（配列番号２１）及びTTTTAAAATTTTTTCAAGACCTGCTTTTTC（配列番号２２）を含むＣ．スプトルム生理型スプトルム、プライマーセットがAGACAAGAATTTTCTAAAGGTCTAATTGCA（配列番号２３）及びTTTTAAAATTTTATCCAGCCTTGCTTTTTC（配列番号２４）を含むＣ．ヘルベティカス、プライマーセットがCGCCAAGAATTTGCTAAAGGGCAAATAGCT（配列番号２５）及びTTTTAAAATTTTATCCAGTCTTGCTTTTTC（配列番号２６）を含むＣ．ウプサリエンシス、並びにプライマーセットがAGACAAGAATTTTCAGAAGGAAAAGTAACA（配列番号２７）及びTTTTAAAATTTTATCAAGTCTTGCTTTTTC（配列番号２８）を含むＣ．ラリ
   ｃ）カンピロバクター種の存在を示すものとして、ＤＮＡの標的配列の増幅産物を得るステップ、
   ｄ）ＰＣＲによって得たＤＮＡ増幅産物を、制限酵素Ddel又はXsplで消化するステップ、
   ｅ）前記消化ステップで得られた制限酵素断片長多型を、ゲル電気泳動によって分析するステップ、並びに
   ｆ）カンピロバクター種及び株を、そのＲＦＬＰパターンによって識別するステップ。
2. ステップｄ）のＤＮＡ増幅産物が、二重消化として、制限酵素Mbol及びHind IIIの組合せにより消化される、請求項１記載の方法。
3. 直接ＰＣＲによりカンピロバクターの種を同定するためのキットであって、プライマーセットの混合物と、制限酵素Ddel若しくはXspl又は二重消化としてMbol及びHind IIIの組合せとを備え、前記混合物が、特定のカンピロバクター種のｇｙｒＢ配列に相補的であり、かつＰＣＲ−ＲＦＬＰ後にカンピロバクターの種を同定することができるオリゴヌクレオチドプライマー：
   即ちＣ．ジェジュニに対するCGTCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTTATC（配列番号５）及びTTTTAAAATTTTATCTAGTCTTGCTTTTTC（配列番号６）を含むプライマーセット混合物、Ｃ．コリに対するCGCCAAGAATTTTCAGAAGGTAAAGTCATC（配列番号７）及びTTTTAAAATTTTATCTAATCTTGCTTTTTC（配列番号８）を含むプライマーセット、Ｃ．コンシサスに対するAGACAAGAATTTGCAAAAGGTATCCCTCAA（配列番号９）及びCTTTAAAATTTTATCCAGTCTTGCTTTTTC（配列番号１０）を含むプライマーセット、Ｃ．カーブスに対するAGGCAAGAATTTCAAAAAGGTATCCCGGTA（配列番号１１）及びTTTTAAAATTTTATCGAGGCGCGATTTTTC（配列番号１２）を含むプライマーセット、Ｃ．ショウアエに対するAGACAAGAATTTTCAAAAGGTATCCCTCAA（配列番号１３）及びTTTTAAAATTTTATCTAGTCTTGCTTTTTC（配列番号１４）を含むプライマーセット、Ｃ．ムコサリスに対するAGGCAAGAATTTGCAAAAGGAATTCCAGTA（配列番号１５）及びTTTTAAAATTTTATCTAATCTTGATTTTTC（配列番号１６）を含むプライマーセット、Ｃ．フェタス亜種フェタスに対するCGTCAAGAGTTTTCAAAAGGAATACCCCAA（配列番号１７）及びTTTTAAAATTTTATCAAGTCTACTTTTTTC（配列番号１８）を含むプライマーセット、Ｃ．ハイオインテスティナリスに対するCGCCAAGAATTCGCCGAAGGCATACCTCAA（配列番号１９）及びTTTAAGAATTTTATCAAGCCTACTTTTTTC（配列番号２０）を含むプライマーセット、Ｃ．スプトルム生理型スプトルムに対するAGACAAGAGTTTTCAAAAGGTGTTCCTACA（配列番号２１）及びTTTTAAAATTTTTTCAAGACCTGCTTTTTC（配列番号２２）を含むプライマーセット、Ｃ．ヘルベティカスに対するAGACAAGAATTTTCTAAAGGTCTAATTGCA（配列番号２３）及びTTTTAAAATTTTATCCAGCCTTGCTTTTTC（配列番号２４）を含むプライマーセット、Ｃ．ウプサリエンシスに対するCGCCAAGAATTTGCTAAAGGGCAAATAGCT（配列番号２５）及びTTTTAAAATTTTATCCAGTCTTGCTTTTTC（配列番号２６）を含むプライマーセット、並びにＣ．ラリを検出するためのAGACAAGAATTTTCAGAAGGAAAAGTAACA（配列番号２７）及びTTTTAAAATTTTATCAAGTCTTGCTTTTTC（配列番号２８）を含むプライマーセット
   を含むキット。