CN105695585A - 一种弯曲菌六重pcr检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测弯曲菌的六重PCR检测试剂盒，属于细菌PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有6对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-12所示，本发明的试剂盒能够同时鉴定待检测菌株是否为弯曲菌，并进一步鉴定弯曲菌五种常见菌种，包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。本发明试剂盒对上述五种弯曲菌检测的灵敏度、特异度均为100％，且操作简单，大大降低了检测成本以及操作难度，具有较好的临床应用价值。

Description

一种弯曲菌六重PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，具体地说涉及检测空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的六重PCR检测试剂盒。
背景技术
弯曲菌是主要的食源性病原菌，其感染导致的疾病称为弯曲菌病，属于人类新发传染病之一。目前，欧美国家弯曲菌的感染被列为食源性病原菌感染的首位，其感染率显著超过其他食源性病原菌。除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可以导致格林-巴利综合征(GBS)。GBS是一种自身免疫导致急性神经肌肉瘫痪，残疾率7～15％，死亡率3％～10％，目前没有特效药物，疾病负担严重。美国将可导致GBS空肠弯曲菌列为生物恐怖病原之一。
目前研究发现导致人类弯曲菌病的弯曲属的主要菌种是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。此外，胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌同样可以导致人类的感染病引起疾病。弯曲菌属内不同菌种鉴定技术的建立对于弯曲菌的研究具有重要意义。
目前无论腹泻患者以及动物的粪便标本以及不同的食物标本中，不仅可以检测到空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，还同时可以检出弯曲菌属的其它菌种，最常见的是胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。研究发现弯曲菌属内不同菌种的耐药特征及致病特点各有不同，属内菌种的鉴定对于弯曲菌感染的防控和治疗具有重要的意义。目前关于弯曲菌属内不同菌种的鉴定大多依赖于生化反应的特点以及针对不同菌种的PCR技术，鉴定过程复杂繁琐。为保障人民食品健康安全，针对不同食源性弯曲菌感染采取积极有效的防控措施，迫切需要一种能够快速、准确、广谱鉴定弯曲菌属内菌种的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弯曲菌六重PCR检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种检测五种弯曲菌的方法，所述五种弯曲菌分别为：空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。
本发明的技术方案主要包括以下两个方面：(1)通过16sRNA基因的DNA序列的比对，获得弯曲菌属内特异核酸片段；(2)利用BLASTn与vectorNITsuite6.0软件对所有特异基因的DNA序列进行比对，NCBI数据库筛查，确定DNA序列特异性，确定6条特异序列片段；(3)通过引物设计软件以及多种PCR优化技术优化PCR条件，建立六重PCR技术，一次PCR完成包括弯曲菌属及属内五种菌种的鉴定。
具体地，本发明提供了检测弯曲菌的引物组合，含有6对引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-12所示。
本发明提供了上述引物组合在制备弯曲菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示的引物对在检测弯曲菌中的应用或在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示的引物对在检测空肠弯曲菌中的应用或在制备检测空肠弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示的引物对在检测结肠弯曲菌中的应用或在制备检测结肠弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示的引物对在检测胎儿弯曲菌中的应用或在制备检测胎儿弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.9-10所示的引物对在检测海鸥弯曲菌中的应用或在制备检测海鸥弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.11-12所示的引物对在检测乌普萨拉弯曲菌中的应用或在制备检测乌普萨拉弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供一种弯曲菌检测试剂盒，含有SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10和/或SEQIDNO.11-12所示的引物对。
进一步地，本发明提供一种弯曲菌检测试剂盒，含有SEQIDNO.1-12所示引物。
更进一步地，本发明提供的弯曲菌检测试剂盒能够鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。
本发明的试剂盒，使用本发明提供的上述引物组合对待测细菌DNA进行PCR检测，
当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。
所述PCR的反应程序为：
94℃5min；
94℃1min，64℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，62℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，60℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，58℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，56℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环；
72℃10min。
本发明还提供了用于检测弯曲菌的靶基因组合，含有6条特异性靶基因，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.13-18所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO.19-24所示。
本发明提供了上述靶基因组合在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用。
本发明提供了弯曲菌靶基因在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用，所述靶基因为SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和/或SEQIDNO.18。
本发明进一步提供了检测食品、粪便中弯曲菌的方法，使用核苷酸序列如SEQIDNO.1-12所示的引物，对待测食品、粪便中分离的菌株进行PCR检测，
当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。
本发明以弯曲菌的特异DNA序列以及五种弯曲菌菌种(包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌)特异的DNA序列及引物序列，建立了高特异度、并且稳定的六重PCR检测弯曲菌的方法，进一步建立检测五种常见弯曲菌的试剂盒。本发明方法灵敏度高、特异性强，灵敏度和特异度均达到100％。本发明所用到的6对引物的设计均通过在NCBI数据库中大量数据比对获得，具有高度的种类保守性和种间特异性。本发明方法无需分别采用属内不同的弯曲菌特异引物分别进行PCR，通过六重PCR方法，一步法实现对空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌，极大地缩短了检测时间，降低检测成本。
附图说明
图1为本发明六重PCR方法检测弯曲菌电泳结果图。其中泳道从左到右依次：marker(DL2000)，空肠弯曲菌(816bp+300bp)，结肠弯曲菌(816bp+500bp)，胎儿肠弯曲菌(816bp+435bp)，海鸥肠弯曲菌(816bp+250bp)，乌普萨拉肠弯曲菌(816bp+200bp)以及阴性对照。
图2为空肠弯曲菌引物特异性及灵敏性筛查结果图，其中泳道从左到右依次：Marker(DL2000)，阳性：C.jejuni，阴性：Escherichiacoli大肠埃希菌，Microbacterium微杆菌，Stenotrophomonasmaltophilia嗜麦芽寡养单胞菌,Dysgonomonas递送诺莫司菌，Enterococcusfaecium(1)屎肠球菌(临床分离株1)，Enterobacteraerogenes产气肠杆菌，Enterococcusfaecalis粪肠球菌，Leifsoniasoli雷夫宋尼亚索里菌，Lactococcusgarvieae格氏乳球菌，Enterococcusfaecium(2)屎肠球菌(临床分离株2)，Streptococcuspasteurianus链球菌。
图3为结肠弯曲菌引物特异性及灵敏性筛查结果图，其中泳道从左到右依次：Marker(DL2000)，阳性：C.coli，阴性：Escherichiacoli大肠埃希菌，Microbacterium微杆菌，Stenotrophomonasmaltophilia嗜麦芽寡养单胞菌,Dysgonomonas递送诺莫司菌，Enterococcusfaecium(1)屎肠球菌(临床分离株1)，Enterobacteraerogenes产气肠杆菌，Enterococcusfaecalis粪肠球菌，Leifsoniasoli雷夫宋尼亚索里菌，Lactococcusgarvieae格氏乳球菌，Enterococcusfaecium(2)屎肠球菌(临床分离株2)，Streptococcuspasteurianus链球菌。
图4为胎儿弯曲菌引物特异性及灵敏性筛查结果图，其中泳道从左到右依次：Marker(DL2000)，阳性：C.fetus，阴性：Escherichiacoli大肠埃希菌，Microbacterium微杆菌，Stenotrophomonasmaltophilia嗜麦芽寡养单胞菌,Dysgonomonas递送诺莫司菌，Enterococcusfaecium(1)屎肠球菌(临床分离株1)，Enterobacteraerogenes产气肠杆菌，Enterococcusfaecalis粪肠球菌，Leifsoniasoli雷夫宋尼亚索里菌，Lactococcusgarvieae格氏乳球菌，Enterococcusfaecium(2)屎肠球菌(临床分离株2)，Streptococcuspasteurianus链球菌。
图5为海鸥弯曲菌引物特异性及灵敏性筛查结果图，其中泳道从左到右依次：Marker(DL2000)，阳性：C.lari，阴性：Escherichiacoli大肠埃希菌，Microbacterium微杆菌，Stenotrophomonasmaltophilia嗜麦芽寡养单胞菌,Dysgonomonas递送诺莫司菌，Enterococcusfaecium(1)屎肠球菌(临床分离株1)，Enterobacteraerogenes产气肠杆菌，Enterococcusfaecalis粪肠球菌，Leifsoniasoli雷夫宋尼亚索里菌，Lactococcusgarvieae格氏乳球菌，Enterococcusfaecium(2)屎肠球菌(临床分离株2)，Streptococcuspasteurianus链球菌。
图6为乌普萨拉弯曲菌引物特异性及灵敏性筛查结果图，其中泳道从左到右依次：Marker(DL2000)，阳性：C.upsaliensis，阴性：Escherichiacoli大肠埃希菌，Microbacterium微杆菌，Stenotrophomonasmaltophilia嗜麦芽寡养单胞菌,Dysgonomonas递送诺莫司菌，Enterococcusfaecium(1)屎肠球菌(临床分离株1)，Enterobacteraerogenes产气肠杆菌，Enterococcusfaecalis粪肠球菌，Leifsoniasoli雷夫宋尼亚索里菌，Lactococcusgarvieae格氏乳球菌，Enterococcusfaecium(2)屎肠球菌(临床分离株2)，Streptococcuspasteurianus链球菌。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1特异性把序列的确定与引物的筛选
获得弯曲菌属16s以及空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌五种弯曲菌菌种种内特异基因及特异核酸序列，利用BLASTn与vectorNITsuite6.0软件对所有特异基因的DNA序列进行比对，确定6条特异序列片段，NCBI数据库筛查，确定DNA序列特异性(包括所有测序菌株)。
1、弯曲菌属特异DNA序列及引物的筛选：
通常细菌的属内共有的核酸多为16srRNA或者23srRNA的序列，可以作为细菌属内特异核酸片段的主要靶基因，通过对弯曲菌属16srRNA的核酸序列的比对，获得针对弯曲菌属的特异核酸片段，序列名称为CAMPY16S(SEQIDNO.13)，并在片段内利用primerpremier5设计引物，引物特异序列为CAMPY16SF1(SEQIDNO.1)和CAMPY16SR1(SEQIDNO.2)，建立弯曲菌属内鉴定PCR技术。
2、空肠(C.jejuni)特异DNA序列及引物的筛选：
通过比对，获得空肠弯曲菌共有基因HipO基因，通过HipO基因序列与弯曲菌属内其它菌种的序列进行比对，获得空肠弯曲菌HipO基因引物区不同于其它菌种的特异序列，根据序列特征设计引物，特异序列命名为CJH(SEQIDNO.14)，上下游引物序列分别为CJHF1(SEQIDNO.3)和CJHR1(SEQIDNO.4)。
利用NCBI的blastn进行序列比对，获得特异DNA片段，并用premier5设计引物，引物避开序列的突变点。
3、结肠弯曲菌(C.coli)特异DNA序列及引物的筛选：
通过比对，获得结肠弯曲菌共有基因Aspartokinase基因，通过Aspartokinase基因序列与弯曲菌属内其它菌种的序列进行比对，获得结肠弯曲菌该基因引物区不同于其它菌种的特异序列，根据序列特征设计引物，特异序列命名为CCA(SEQIDNO.15)，上下游引物序列分别为CCAF1(SEQIDNO.5)和CCAR1(SEQIDNO.6)。
利用NCBI的blastn进行序列比对，获得特异DNA片段，并用premier5设计引物，引物避开序列的突变点。
4、胎儿弯曲菌(C.fetus)特异DNA序列及引物的筛选：
通过比对，获得胎儿弯曲菌共有基因sapB5基因，通过sapB5基因序列与弯曲菌属内其它菌种的序列进行比对，获得胎儿弯曲菌sapB5基因引物区不同于其它菌种的特异序列，根据序列特征设计引物，特异序列命名为CFS(SEQIDNO.16)，上下游引物序列分别为CFSF1(SEQIDNO.7)和CFSR1(SEQIDNO.8)。
利用NCBI的blastn进行序列比对，获得特异DNA片段，并用premier5设计引物，引物避开序列的突变点。
5、海鸥弯曲菌(C.lari)特异DNA序列及引物的筛选：
通过比对，获得弯曲菌共有基因glyA基因，通过glyA基因序列与弯曲菌属内其它菌种的序列进行比对，获得海鸥弯曲菌glyA基因引物区不同于其它菌种的特异序列，根据序列特征设计引物，特异序列命名为CLG(SEQIDNO.17)，上下游引物序列分别为CLGF1(SEQIDNO.9)和CLGR1(SEQIDNO.10)。
利用NCBI的blastn进行序列比对，获得特异DNA片段，并用premier5设计引物，引物避开序列的突变点。
6、乌普萨拉弯曲菌(C.upsaliensis)特异DNA序列及引物的筛选：
通过比对，获得乌普萨拉弯曲菌共有基因glyA基因，通过glyA基因序列与弯曲菌属内其它菌种的序列进行比对，获得乌普萨拉弯曲菌glyA基因引物区不同于其它菌种的特异序列，根据序列特征设计引物，特异序列命名为CUG(SEQIDNO.18)，上下游引物序列分别为CUGF1(SEQIDNO.11)和CUGR1(SEQIDNO.12)。
利用NCBI的blastn进行序列比对，获得特异DNA片段，并用premier5设计引物，引物避开序列的突变点。
实施例2弯曲菌六重PCR检测方法的建立
以实施例1筛选得到的6对特异性引物为六重PCR扩增引物，以细菌DNA为模板，建立针对空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌五种弯曲菌的六重PCR检测方法。
1、培养基及试剂准备
1.1Columbia基础培养基：称取13.85gColumbia琼脂置于300mL蒸馏水中混匀后，121℃高压15分钟备用。冷却至50～54℃，加入5％脱纤维羊血，混匀，倾注90mm平皿经无菌检测后备用。
1.22％琼脂糖凝胶：称取2g琼脂糖加入20ml5×TBEbuffer加蒸馏水至100ml,混匀，微波炉加热沸腾待琼脂糖完全溶解，冷却至60℃,加入2μlGel-Red染料混匀，倒入模具待凝固后取出使用。
1.3电泳液:加入200ml5×TBEbuffer加蒸馏水至1000ml,混匀，倒入电泳槽中待用。
2、菌株复苏及核酸提取
2.1取标准菌株空肠弯曲菌(ATCC49349)、结肠弯曲菌(ATCC33559)、胎儿弯曲菌(ATCC27374)、海鸥弯曲菌(ATCC35221)、乌普萨拉弯曲菌(ATCC43954)以及临床分离株大肠埃希菌Escherichiacoli，微杆菌Microbacterium，嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia，Dysgonomonas，屎肠球菌Enterococcusfaecium，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，Enterococcusfaecium，Leifsoniasoli，格氏乳球菌Lactococcusgarvieae，Enterococcusfaecium，链球菌Streptococcuspasteurianus复苏后进行增菌传代，收集足量菌体备用。
2.2核酸提取：建议使用商用试剂盒提取(使用QiagenDNA提取试剂盒提取)
1)取1菌环新鲜培养物于1.5ml的EP管中，先用1ml生理盐水(NS)洗菌，使管内抗原在NS中充分混匀，8000rpm，3min离心，弃上清，只留沉淀。
2)向管中加180μl的ATL和20μl的蛋白酶K，混匀，放入56℃金属浴(带摇匀功能的金属浴箱)1-3h，具体时间根据细菌是否消化完全决定。
3)向样品中加200μl的AL，震荡混匀，在金属浴(70℃)中放置10min之后短暂离心。
4)加200μl的乙醇(96％～100％)，混匀后短暂离心，使管壁及管盖不留液体,全部体系包括沉淀全加到试剂盒中提供的柱子上。注意不要碰到管的边缘，盖好管盖，8000rpm离心1min，弃管留柱，之后将柱子转移到新的管中(试剂盒提供)，
5)向柱子中加500μl的AW1，盖好管盖8000rpm离心1min，弃管留柱，之后将柱子转移到新的管中(试剂盒提供)。
6)向柱子中加500μl的AW2，盖好管盖最大转速13800rpm离心3min，弃管留柱。
7)将柱子转移到普通的EP管中，最大转速13800rpm空离3min，确保杂质都不留在柱子上。
8)再换普通EP管，开盖晾5～10min，向柱子加200μl的AE，室温放置1min，8000rpm离心1min，作为PCR模板DNA。
3、弯曲菌六重PCR反应体系见下表1。
表1
4、PCR反应程序：
94℃5min；
94℃1min，64℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，62℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，60℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，58℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，56℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环；
72℃10min。
5、2％琼脂糖凝胶电泳
5.1将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极。
5.2将样品按照规定的顺序加样(2μl)，上样顺序应与电泳槽上的标记一致。
5.3确认已经正确上样后，双手盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，设置电泳参数：电压：120V时间：60min；注意确认电极、电泳参数完全正确之后，最后按RUN键开始电泳。
实验结果见图1。当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。
本发明方法的特异度实验分别见图2-图6。利用单菌落PCR的验证，获得相同的扩增结果，表明本发明方法的灵敏度可以做到纯菌培养的单菌落扩增。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.检测弯曲菌的引物组合，其特征在于，含有6对引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-12所示。
2.权利要求1所述的引物组合在制备弯曲菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。
3.一种弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合。
4.如权利要求3所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，其能够鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。
5.如权利要求3所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组合，对待测细菌DNA进行PCR检测，
当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。
6.如权利要求3-5任一所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，所述PCR的反应程序为：
94℃5min；
94℃1min，64℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，62℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，60℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，58℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，56℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环；
72℃10min。
7.一种用于检测弯曲菌的靶基因组合，其特征在于，含有6条特异性靶基因，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.13-18所示。
8.权利要求7所述的靶基因组合在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用。
9.弯曲菌靶基因在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用，其特征在于，所述靶基因为SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和/或SEQIDNO.18。
10.检测食品、粪便中弯曲菌的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组合，对待测食品、粪便标本中分离的菌株进行PCR检测，
当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222294A (zh) * 2016-08-31 2016-12-14 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法
CN108913794A (zh) * 2018-08-17 2018-11-30 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 弯曲菌细胞膨胀致死毒素a型，b型和c型三重pcr检测引物及试剂盒
CN110423828A (zh) * 2019-08-15 2019-11-08 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒
CN112899379A (zh) * 2020-12-30 2021-06-04 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的空肠弯曲菌标准菌株及其检测和应用
CN113151415A (zh) * 2021-05-18 2021-07-23 六安市康恒生物科技有限公司 一种基于生物基因的pcr检测方法
CN115679007A (zh) * 2022-11-24 2023-02-03 贵州省畜牧兽医研究所 一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化rpa-lfd快速检测试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060051752A1 (en) * 2002-01-23 2006-03-09 Gehua Wang One-step multiplex pcr for the identifiation and differentiation of campylobacter species
WO2009100008A2 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Genetic methods for speciating campylobacter
CN101624625A (zh) * 2009-03-20 2010-01-13 徐君怡 食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法
EP2358908A1 (en) * 2008-11-14 2011-08-24 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection campylobacter nucleic acid
CN203238265U (zh) * 2013-02-05 2013-10-16 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060051752A1 (en) * 2002-01-23 2006-03-09 Gehua Wang One-step multiplex pcr for the identifiation and differentiation of campylobacter species
WO2009100008A2 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Genetic methods for speciating campylobacter
EP2358908A1 (en) * 2008-11-14 2011-08-24 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection campylobacter nucleic acid
CN101624625A (zh) * 2009-03-20 2010-01-13 徐君怡 食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法
CN203238265U (zh) * 2013-02-05 2013-10-16 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEHUA WANG等: "Colony Multiplex PCR Assay for Identification and Differentiation of Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis,and C. fetus subsp. fetus", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
WATARU YAMAZAKI-MATSUNE等: "Development of a multiplex PCR assay for identification of Campylobacter coli,Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis,Campylobacter jejuni, Campylobacter lari and Campylobacter upsaliensis", 《JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222294A (zh) * 2016-08-31 2016-12-14 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法
CN106222294B (zh) * 2016-08-31 2019-07-12 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法
CN108913794A (zh) * 2018-08-17 2018-11-30 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 弯曲菌细胞膨胀致死毒素a型，b型和c型三重pcr检测引物及试剂盒
CN108913794B (zh) * 2018-08-17 2023-08-22 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 弯曲菌细胞膨胀致死毒素a型，b型和c型三重pcr检测引物及试剂盒
CN110423828A (zh) * 2019-08-15 2019-11-08 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒
CN110423828B (zh) * 2019-08-15 2023-11-03 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒
CN112899379A (zh) * 2020-12-30 2021-06-04 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的空肠弯曲菌标准菌株及其检测和应用
CN112899379B (zh) * 2020-12-30 2022-05-20 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的空肠弯曲菌标准菌株及其检测和应用
CN113151415A (zh) * 2021-05-18 2021-07-23 六安市康恒生物科技有限公司 一种基于生物基因的pcr检测方法
CN115679007A (zh) * 2022-11-24 2023-02-03 贵州省畜牧兽医研究所 一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化rpa-lfd快速检测试剂盒

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