CN106222294A - 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法 - Google Patents

多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106222294A
CN106222294A CN201610798383.0A CN201610798383A CN106222294A CN 106222294 A CN106222294 A CN 106222294A CN 201610798383 A CN201610798383 A CN 201610798383A CN 106222294 A CN106222294 A CN 106222294A
Authority
CN
China
Prior art keywords
campylobacter
detection
nucleic acid
kinds
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610798383.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106222294B (zh
Inventor
王晓艳
王彦威
王雷
张志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Original Assignee
Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc filed Critical Beijing Zhuo Chenghui Biological Polytron Technologies Inc
Priority to CN201610798383.0A priority Critical patent/CN106222294B/zh
Publication of CN106222294A publication Critical patent/CN106222294A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106222294B publication Critical patent/CN106222294B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3‑14所示的引物。本发明还提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的多重PCR引物组和DNA聚合酶。通过上述技术方案本发明显著地提高了对五种致病弯曲菌同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法。
背景技术
由弯曲菌属细菌感染引起的一系列疾病称之为弯曲菌病，临床上最常见的是由感染该菌所致的腹泻。弯曲菌广泛分布于自然界，可通过动物、食物、水、牛奶等传播人类发病。近年来，弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。弯曲菌感染人类能引起温和至严重的腹泻。在弯曲菌属中，对人类致病的绝大多数是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种(以下简称“胎儿弯曲菌”)，其次是结肠弯曲菌。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸟弯曲菌和胎儿弯曲菌占所有从人体分离的弯曲菌属细菌的99％(其中空肠弯曲菌占90％)。其它菌种，如乌普萨拉弯曲菌、简明弯曲菌等引起的感染也有报道，但所占比例极小。
国际上对弯曲菌检测采用的标准有ISO 10272-1:2006《食品和动物饲料微生物学弯曲杆菌属检测和计数用水平方法第1部分：检测方法》和FDA/CF-SAN《细菌分析手册》(BAM)(第7章)。国内标准有国家标准GB/T4789.9-2008《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》和出入境检验检疫行业标准SN/T0175-1992《出口食品中弯曲杆菌检验方法》。这些标准均采用细菌分离培养、生化反应和血清学方法鉴定弯曲菌种属及血清型。整个检测获得最终结果需要5天左右，既费时又费力，且受限于数据库信息有限。同时，挑选菌落不全、菌落不纯、菌液浓度过高或过低均会影响最终结果的呈现。生物芯片可以对弯曲菌属、种和亚种进行系统的鉴定，但进行生物芯片检测需要配备昂贵的仪器，稳定性差、重现率低等技术难题和昂贵的成本仍是制约其进一步发展和应用的因素。
分子生物学检测方法提高了检测的灵敏度和特异性，采用单重普通PCR或单重实时荧光PCR可以快速的鉴定弯曲菌种属。但是食品和临床标本成分复杂，提取后的核酸仍有可能带有PCR抑制成分，所以常出现假阴性的结果，造成弯曲菌的漏检。多重PCR技术可以很好的解决这些问题。但是当前普通的多重PCR技术会低于普通单重PCR和单重实时荧光PCR检测的灵敏度，对于微量致病弯曲菌的检测存在着较大的漏检风险；另一方面，普通PCR结果往往使用琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，此方法操作复杂，耗时间长，常常需要用到EB(溴化乙锭)等核酸染料，对实验人员存在安全隐患。
因此有必要对现有的弯曲菌的检测方式进行改进，建立一种快速、特异且敏感地判定弯曲菌属及鉴别弯曲菌亚种的检测技术。
发明内容
本发明的目的在于解决现有致病弯曲菌检测技术中存在的仪器平台昂贵、耗时长、敏感性和特异性差、检出率低和覆盖度差的问题，提供一种新的弯曲菌检测引物和方法。
为达到以上目的，本发明提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、胎儿弯曲菌(C.fetus)、海鸟弯曲菌(Campylobacter laridis)、乌普萨拉弯曲菌(C.upsa liensis)和结肠弯曲菌(C.colic)。
本发明的还提供了五种致病弯曲菌的检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；
(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有425bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有141bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有空肠弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有463bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有胎儿弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有293bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有海鸟弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有205bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有乌普萨拉弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有180bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有结肠弯曲菌。
本发明还提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。
另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测五种致病弯曲菌的试剂盒中的用途；其中，所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
通过上述技术方案，本发明建立了弯曲菌属和各种的多重PCR检测引物组和检测方法，能够将检测时间从传统方法的3-5天缩短到2小时，达到如下的检测效果：
(一)多重检测
本发明所建立的检测方法能够在一次PCR反应中鉴定弯曲菌属的同时，筛查空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和胎儿弯曲菌。检测方法涵盖了当今世界发现的弯曲菌流行株和暴发株。2个小时内能快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。
(二)特异性高
本发明所建立检测方法的特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时特异性实验表明本发明的引物能够很好的区分与弯曲种属相近、生存环境相同的细菌，包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌O157、嗜水气单胞菌、河弧菌、炭疽芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌、绵羊李斯特氏菌、百日咳杆菌、军团菌、链球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。
(三)灵敏度高
本发明所建立的检测方法具有与单重实时荧光PCR相当的检测灵敏度，在每一个反应体系中每个检测目标的检测灵敏度可达到103-104CFU/mL。
(四)成本较低
本发明所建立的多重PCR检测方法采用普通PCR原理，减低了使用荧光探针的高成本，同时保证检测效果。与普通单重PCR方法相比较，该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省90％的试剂成本；在操作性上一次反应检测6个目标基因，至少节省了50％的人力成本和时间成本，原来单重检测需要6次人工和6倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1个反应的时间。
(五)预防假阴性结果
本发明反应体系中添加的阳性内对照，除了可以验证操作失误造成假阴性结果外，还可以验证体系中是否含有PCR扩增反应的抑制剂造成的假阴性结果。
本发明为五种弯曲菌快速筛查提供了整体的解决方案，能实现食物中毒事件发生和传染病疫情暴发后的弯曲菌种和亚种的快速鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.15-16所示的引物。SEQ ID NO.15-16所示的引物是以pET28a质粒为模板设计的一对引物，作为阳性内对照引物对。
本发明的PCR引物组检测目标基因包括空肠弯曲菌hipO基因、结肠弯曲菌glyA基因、海鸟弯曲菌glyA基因、乌普萨拉弯曲菌glyA基因、胎儿弯曲菌sapB2基因，(如表1所示)。
表1弯曲菌属和五种常见致病弯曲菌多重PCR检测目标基因
SEQ ID NO.3-16所示的7对引物序列中均含有与之匹配的LHP序列(基于连接序列的同源通用引物based on ligation-sequence homogenous Primer，LHP)，它包括1条同源通用引物序列和6个碱基的连接序列。LHP序列与每条特异性引物连接后使用，同源通用引物单独使用，序列详见表2。
表2弯曲菌属和五种弯曲菌种多重PCR引物汇总表
在本发明的一种实施方式中，涉及多重PCR检测五种致病弯曲菌的检测方法，(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所提供的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有425bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有141bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有空肠弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有463bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有胎儿弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有293bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有海鸟弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有205bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有乌普萨拉弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有180bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有结肠弯曲菌。
其中，优选地，SEQ ID NO.3-14所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。
其中，优选地，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：
a：94-96℃，3-6min；
b：94-96℃，15-60s，
c：50-60℃，15-60s，
d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；
e：94-96℃，15-60s，
f：55-65℃，15-60s，
g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；
h：71-73℃，5-10min。
其中，所述待测样本可以包括但不限于食品、药品、排泄物、呕吐物和体液中的至少一种。优选地，本发明的多重PCR检测五种致病弯曲菌的检测方法不用于诊断。或者说，五种致病弯曲菌的定性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，也就是五种致病弯曲菌的定性与定量结果不属于诊断结果，但是五种致病弯曲菌的定性与定量的检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。
其中，优选地，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。
在本发明的一种实施方式中，采用QIaxcel全自动毛细管电泳分析仪作为结果分析的平台。基于QIaxcel的全自动操作和设定的智能化结果分析程序，从而实现结果的自动判定分析。
本发明的一个方面还提供了一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
优选的，所述试剂盒还包括PCR反应所需的PCR反应试剂，所述反应试剂可以为PCR反应缓冲液和dNTP。
另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测五种致病弯曲菌的试剂盒中的用途；其中，所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
实施例1
1、引物合成：进行SEQ ID NO.1和3-16的引物合成。以物质的量为单位，将SEQ IDNO.3-16的引物各取1份，与4份的SEQ ID NO.1的引物混合，构成本实施例的引物组。引物汇总表见表3。
表3弯曲菌属和五种弯曲菌种多重PCR引物序列汇总表
SEQ ID NO. 引物对序列(5’-3’)
1 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT
2 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT
3 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT GCC ATC TAG YTA TTG GCA CCG CGA
4 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT GAA TGA TTA AAA AAR GGG TTM CGC
5 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT TGA TCA AAA AGG ACT TTT TGT TC
6 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CCT TCA AGT GTC CAG TTG ATT CCA TC
7 CCCGTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT GAA TAT GAG TTT TCT ATA GGA CTT
8 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CCG TTA TGA TAA ACA TGA GCA TAT
9 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CAT TGT AGT YGA TGA TTG TGG TAA
10 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT TAA ACT GAG AAA GMT ATT GAT TAG
11 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT GCA TAG CTT AGA AYA AAG CCT TGC
12 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT TCT TTT ATA TTC GGC GKT TATT TC
13 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CTA GAC TGC GAT AAG MTA CGG GGA
14 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT TCG GAG TTT GAT YGG GTT TGG TAC
15 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CTC TTC CGA CCA TCA AGC A
16 CCC GTC GAT AAA TAT CT GCT CTA TAT CT CAC CGA GGC AGT TCCACTG
*注：Y＝C/T；R＝A/G；M＝A/C；K＝T/G
2、特异性验证：
选择19种无关病原体作为模拟干扰样本：沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、志贺氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为51054)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63303)、单核细胞增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为52201)、阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、大肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为43317)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1109)、大肠杆菌O157(购自中国医学菌种保藏中心，编号为43008)、嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)、河弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为56012)、炭疽芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63001)、韦氏芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为32011)、绵羊李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为65112)、百日咳杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为37011)、军团菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为23014)和链球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为31403)。
上述模拟干扰样本用于特异性评估，分别进行总核酸的提取，每种样本提取得到的总核酸溶解于TE缓冲液中，浓度为1ng/μL。
使用上述得到的每种样本的总核酸与等量的阳性内对照(pET28a质粒)混合，作为模板，用上述得到的引物组进行多重PCR扩增。
按照如下操作配制反应体系：5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，5×PCR buffer(Tris·HCl 100mM(pH8.3)，KCl 250mM，tween-20 0.2％)5μL，10mM的dNTP 0.5μL，25mM的MgCl2 2.5μL，10x引物混合物2.5μL，DNA模板5μL，超纯水补至25μL。引物浓度如表4所示。
表4引物浓度表
引物编号 10×引物混合物
SEQ ID NO.1 8μM
SEQ ID NO.3-16 3μM/每条引物
反应的条件包括如下a-h的步骤：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。
多重PCR产物置于QIAxcel全自动毛细管电泳分析仪中进行分析，结果显示，19种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照混合作为模板所进行的多重PCR全部扩增到了353bp的阳性内对照条带，但除353bp的阳性内对照条带外，均没有扩增出其它条带。由此证明，本实施例的引物组难以被无关病原体所干扰，具有较高的特异性。
实施例2
1、多重PCR检测试剂盒的组建
该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer(Tris-HCl 40Mm(pH 8.3)，KCl 100mM，tween-200.08％，0.0006ng/μL pET28a，1mM dNTP、8mM MgCl2)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC在内的长引物对浓度各2μM，同源通用引物SEQ ID NO.1浓度为8μm)；阳性对照(含有5种弯曲菌的混合模板，每种均为106CFU/ml)。
试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。
2、基因组的提取
取增菌液或划线培养的菌落打散于水中，用浊度计调整细菌悬液浓度至108CFU/ml，取1ml细菌悬液。沸水浴10min后冰浴，13000rpm离心10min，取上清作为试剂盒检测用模板。
3、反应体系的配制
取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。
4、PCR反应
将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。
5、全自动毛细管电泳分析PCR产物
将PCR反应管放入全自动毛细管电泳仪Qiaxcel Advanced(凯捷公司)，使用DNAHigh Resolution Kit卡夹，选择15bp-600bp的Alignment marker，100-500bp的sizemarker，自动分析目标条带的大小。
6、结果判断
根据弯曲菌种属23S rRNA基因425bp、空肠弯曲菌hipO基因141bp、结肠弯曲菌glyA基因180bp、海鸟弯曲菌glyA基因293bp、乌普萨拉弯曲菌glyA基因205bp、胎儿弯曲菌sapB2基因463bp。判定某菌株是否是弯曲菌的同时确定其属/种。
包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照泳道有IAC(353bp)的扩增，其他检测有目标条带和(或)IAC的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。
结果显示，每个泳道都出现2条PCR产物，均扩增出了425bp的弯曲菌种属的扩增条带，各泳道分别扩增出了180bp的结肠弯曲菌glyA基因的扩增条带；463bp的胎儿弯曲菌sapB2基因的扩增条带；141bp的空肠弯曲菌hipO基因的扩增条带；293bp的海鸟弯曲菌glyA基因的扩增条带；205bp是乌普萨拉弯曲菌glyA基因的扩增条带。
实施例3试剂盒的最低检出限试验
评估用检测样本：选择5个特定检测的弯曲菌菌株：空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、海鸟弯曲菌、胎儿弯曲菌。将5个模板的浓度分别调整至108CFU/mL，等比例混合成综合模板。将综合模板梯度稀释成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL的检测样品。
使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板。根据实施例2的方法进行操作和结果判断，试剂盒检测6个目标基因(不含IAC)的敏感性试验结果如表5所示：
表5试剂盒检测弯曲菌6个目标基因敏感性试验结果
所含目标基因 105CFU/mL 104CFU/mL 103CFU/mL 102CFU/mL
空肠弯曲菌特异性条带 + + + -
结肠弯曲菌特异性条带 + + + -
乌普萨拉弯曲菌特异性条带 + + + -
海鸟弯曲菌特异性条带 + + + -
胎儿弯曲菌特异性条带 + + + -
弯曲菌属 + + + -
从表5看出，试剂盒检测空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、结肠弯曲菌的敏感度均可以达到103CFU/mL，试剂盒总体的检测敏感性为103CFU/mL。
对比例1试剂盒检测与文献方法的比较
按照文献(Gehua Wang，2002)中所提供的方法进行敏感性试验，结果表明，普通多重PCR技术对于不同检测目标弯曲菌达到的灵敏度不同。对空肠弯曲菌的检测灵敏度为108CFU/mL，对结肠弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的检测灵敏度为106CFU/mL，对海鸟弯曲菌的检测灵敏度为107CFU/mL，对胎儿弯曲菌的检测灵敏度为102CFU/mL，整体灵敏度偏低。
对比例2
制备对比引物17-26，见表6。
表6对比引物序列表
*注：Y＝C/T；R＝A/G；M＝A/C
按照实施例1的方法进行检测区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.17-18所示的引物获得对比引物组1。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.19-20所示的引物获得对比引物组2。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID NO.21-22所示的引物获得对比引物组3。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.23-24所示的引物获得对比引物组4。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQ ID NO.25-26所示的引物获得对比引物组5。
将实施例1的引物组中SEQ ID NO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.27-28所示的引物获得对比引物组6。
实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-14所示的引物替换为SEQ ID NO.17-28所示的引物获得对比引物组7。
其中，用对比引物组1扩增空肠弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组2扩增胎儿弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组3扩增海鸟弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组4扩增乌普萨拉弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组5扩增结肠弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组6分别扩增五种弯曲菌标准品质粒样品；
用对比引物组7扩增弯曲菌标准品质粒与阳性内对照混合物样品；。
用对比引物组7扩增19种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本。
分别按照与实施例1和2相同的方法进行特异性和敏感性试验，结果显示本对比例的引物17-28的特异性、敏感性和覆盖率均差于实施例1-3的引物。
虽然各实验组都检测出了弯曲菌属；但仅有对比引物组1、3和5扩增出了对应目标的条带，在对19种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本的特异性展示中，除了阳性内对照外还有其余的杂带，说明其特异性较差。
与本发明所提供的方法比较可知本发明所提供的的多重PCR检测方法具有高度的敏感性和重复性。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种多重PCR检测五种致病弯曲菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-14所示的引物；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.15-16所示的引物。
3.五种致病弯曲菌的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；
(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有425bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有141bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有空肠弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有463bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有胎儿弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有293bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有海鸟弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有205bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有乌普萨拉弯曲菌；
如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有180bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有结肠弯曲菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，SEQ ID NO.3-14所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：
a：94-96℃，3-6min；
b：94-96℃，15-60s，
c：50-60℃，15-60s，
d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；
e：94-96℃，15-60s，
f：55-65℃，15-60s，
g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；
h：71-73℃，5-10min。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。
7.一种多重PCR检测五种致病弯曲菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组和DNA聚合酶；所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液和dNTP。
9.权利要求1或2所述的引物组在制备检测五种致病弯曲菌的试剂盒中的用途；其中，所述五种致病弯曲菌包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸟弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和结肠弯曲菌。
CN201610798383.0A 2016-08-31 2016-08-31 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法 Active CN106222294B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610798383.0A CN106222294B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610798383.0A CN106222294B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106222294A true CN106222294A (zh) 2016-12-14
CN106222294B CN106222294B (zh) 2019-07-12

Family

ID=58075182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610798383.0A Active CN106222294B (zh) 2016-08-31 2016-08-31 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106222294B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695585A (zh) * 2016-03-16 2016-06-22 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种弯曲菌六重pcr检测试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695585A (zh) * 2016-03-16 2016-06-22 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种弯曲菌六重pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEHUA WANG: "Colony Multiplex PCR Assay for Identification and Differentiation of Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, and C. fetus subsp. fetus", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
WATARU YAMAZAKI-MATSUNE等: "Development of a multiplex PCR assay for identification of Campylobacter coli,Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis,Campylobacter jejuni, Campylobacter lari and Campylobacter upsaliensis", 《JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》 *
张茂俊等: "空肠弯曲菌多重聚合酶链反应基因鉴定及其毒力相关基因分析", 《中华流行病学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106222294B (zh) 2019-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources
Douidah et al. Identification of five human and mammal associated Arcobacter species by a novel multiplex-PCR assay
CN106191316B (zh) 多重pcr检测七种腹泻病毒用引物组和试剂盒及其检测方法
CN110791590A (zh) 非洲猪瘟病毒vp72和cd2v基因的双重实时荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
Moreno et al. Direct detection of thermotolerant campylobacters in chicken products by PCR and in situ hybridization
CN104946749B (zh) 一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用型引物与探针以及试剂盒
CN110229932B (zh) 非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒
CN106434902B (zh) 多重pcr检测蜡样芽孢杆菌毒力基因用引物组和试剂盒及其检测方法
CN110699489B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN102367475B (zh) 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法
Wang et al. Visual and multiplex detection of nucleic acid sequence by multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor
JP2015039320A (ja) 複数細菌の同時検出及び／又は定量方法
CN106399486A (zh) 用于多重pcr检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒
CN106434901A (zh) 多重pcr检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的方法
Zang et al. Can a visual loop-mediated isothermal amplification assay stand out in different detection methods when monitoring Campylobacter jejuni from diverse sources of samples?
KR20170003403A (ko) 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법
Xin et al. Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay
KR101156719B1 (ko) 병원성 대장균 검출방법 및 검출세트
CN103451305B (zh) 检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒
WO2017009198A1 (en) Listeria monocytogenes clonogrouping and assessment of infectivity
JP2017136019A (ja) 病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法
CN106755553B (zh) 鉴定或辅助鉴定食源性致病菌的GeXP多重PCR方法的成套试剂与应用
US9234248B2 (en) Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile
CN106222294B (zh) 多重pcr检测五种致病弯曲菌用引物组和试剂盒及其检测方法
WO2019221219A1 (ja) 細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセット

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant