CN108486228A - 预判断脓毒症感染情况的荧光定量pcr检测试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法。所述试剂盒包括：拟杆菌门正向引物和反向引物、厚壁菌门正向引物和反向引物、变形菌门正向引物和反向引物、放线菌门正向引物和反向引物，和PCR预混液以及荧光定量PCR检测方法用试剂。本发明通过检测人体肠道菌群门分类水平结构，为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的病原学类型，可用于临床脓毒症的辅助诊断，为患者采取相关的抗生素治疗提供有效的依据，临床应用前景良好。

Description

预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法。

背景技术

脓毒症是感染引起的宿主反应失调而导致的致死性器官功能障碍的临床综合症，其发病率和病死率一直居高不下，是全球医学界面临的突出难题。虽然国际上对脓毒症的指南一直在不断地更新和完善，但临床医生在诊断脓毒症时仍然面临许多困境。其中，病人的情况是不是感染，或者说出现的器官功能不全是不是因感染所致，对于这样的问题根据现有的技术并不能很好解释。目前，有多达40％的被诊断为脓毒症的ICU患者事实上并不是感染，因而并不是真正的脓毒症。因此，如何有效判断脓毒症的感染情况，对于脓毒症的诊断和治疗来说十分关键。

目前，对于脓毒症病原学的诊断方法主要包括：(1)血培养：血培养结果阳性是诊断脓毒症的“金标准”，但并非所有脓毒症患者都有引起感染的病原微生物的阳性血培养结果，仅约45％的脓毒性休克患者可获得阳性血培养结果。同时，血培养阳性率会受到例如采血量、采血时间、采血次数等因素的影响，对于脓毒症的血培养阳性率会有一定干扰。此外通过血培养来诊断脓毒症耗时长，通常需要48～72小时。(2)血常规：目前临床上认为白细胞<5×10⁹/L或大于>20×10⁹/L应高度怀疑感染，然而有研究表明50％的新生儿脓毒症患儿白细胞可在正常范围内，而且异常白细胞计数在其他病理条件下也可出现，因而白细胞计数对于脓毒症感染的诊断缺乏敏感性和特异性。(3)炎性指标：C反应蛋白和降钙素原是目前临床上用得最多的诊断脓毒症的生物标志物，它们被看作是细菌感染的特异性标志物，但在一些非感染的情况(如手术后、创伤等)下其水平也会升高。(4)白细胞介素6水平由于在脓毒症发生时变化非常敏感，故在ICU常被作为脓毒症的早期诊断标志物，但它在急性炎症反应综合症和脓毒症区分中的价值一直存在争议，因为在创伤、手术或自身免疫性疾病等情况下白细胞介素6水平会发生改变。

发明内容

本申请人经研究发现脓毒症会引起肠道菌群结构的改变，虽然脓毒症发生时如何改变肠道菌群的机制仍不清楚，但肠道菌群结构的改变可以预示脓毒症的发生发展并为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的的病原学类型，并且不同的肠道菌群结构可以预示患者所感染病原体的类型(革兰阳性菌、格兰阴性杆菌)。因此，通过检测可疑脓毒症患者肠道菌群的结构，不仅可以明确该患者是否有感染，而且可以确定具体感染的病原学类型，以指导后续抗生素的合理使用。由于脓毒症进展十分迅速，因此，快速的肠道菌群结构检测手段对可疑脓毒症患者肠道菌群检测十分重要。目前，国内外所采用的肠道菌群结构定量检测方法主要为高通量测序，虽然它对肠道菌群信息可进行全面的分析，但检测过程往往长达一个月，这远远不能满足对肠道菌群快速检测的要求。本发明针对现有技术中脓毒症诊断难的技术问题，目的在于提供一种预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒包括：

用于检测人体肠道菌群门分类水平的引物组，所述引物组包括：拟杆菌门正向引物5'-ACGCACGGGTGAGTAACACGTAT-3'和反向引物5'-AGG GGATAAATCCTCTCAGTTCCCCT-3'；厚壁菌门正向引物5'-GGAGYATGT GGTTTAATTCGAAGCA-3'和反向引物5'-AGCTGACGACAACCATGCAC -3'；变形菌门正向引物5'-GCTGATCATCCTCTCAGACAA-3'和反向引物 5'-AGAACGAACGCTGGCGTAA-3'；放线菌门正向引物5'-GCTGATCTGC GATTACTAGCGTC-3'和反向引物5'-ATGTCTTGGGCTTCACGCA-3'；

和PCR预混液。

所述试剂盒还包括：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和/或放线菌门的定量标准物质。所述定量标准物质分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门或放线菌门的16S rDNA扩增后的克隆得到纯质粒原液或稀释液。

所述试剂盒还包括：荧光定量PCR检测方法用试剂。

所述PCR预混液为含荧光物质(如SYBR Green)的DNA聚合酶预混液(SYBR PremixEx Taq)。

本发明的另一目的在于提供一种预判断脓毒症感染情况的方法，所述方法包括如下步骤：

S1，提取样本基因组；

S2，用权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量qPCR 扩增；

S3，同时分别与拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的定量标准物质进行对比，得出相应的拷贝数。

其中，步骤S1中的样本为粪便样本。

其中，步骤S2中的qPCR扩增条件是：

拟杆菌门和放线菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，60℃1min，40 个循环，95℃5s；

厚壁菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，70℃30s，40个循环，95℃5s；

变形菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，50℃1min，40个循环，95℃ 5s；

拟杆菌门和放线菌门、厚壁菌门、变形菌门的熔解曲线均是65℃～95℃，每5s上升0.5℃。

本发明的积极进步效果在于：本发明预判断脓毒症感染情况的荧光定量 PCR检测试剂盒是通过检测人体肠道菌群门分类水平结构，为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的病原学类型，可用于临床脓毒症的辅助诊断，为患者采取相关的抗生素治疗提供有效的依据，临床应用前景良好。据此，本发明提供了一种判断脓毒症感染情况的试剂盒，以及所检测的不同肠道菌群的结构在判断脓毒症感染情况中的具体意义。

本发明试剂盒通过检测可疑脓毒症患者肠道菌群结构并与正常对照进行比较，可以判断患者感染情况，并了解患者所感染病原体的类型：若患者肠道菌群中以拟杆菌门和厚壁菌门为主(即指相对百分比之和大于50％，且拟杆菌门不低于30％)，则其感染可能性较低；若患者肠道菌群内变形菌门显著升高(如相对百分比大于50％)，则为革兰阴性菌感染；若患者肠道菌群内厚壁菌门显著升高(相对百分比大于50％)，则为革兰阳性菌感染，可用于临床脓毒症的辅助诊断，为患者采取相关的抗生素治疗提供有效的依据，临床应用前景良好。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1A～1D分别为拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、变形菌门的标准曲线结果；

图2为确诊为脓毒症的患者和正常对照的粪便样本进行肠道菌群门水平的定量分析对比图，其中纵坐标阿拉伯数字代表样本编号。

具体实施方式

实施例1

步骤S1采用QIAamp Fast DNAStool Mini Kit(51604)试剂盒提取粪便基因组样本

在2mL离心管中称量200mg新鲜或冰冻(-80℃保存)粪便样本并置于冰上，加入1mLInhibitEx Buffer，震荡1min。将上述悬液置于70℃金属浴中加热5min，8000rpm室温离心1min得到上清液。于新的1.5mL离心管底部加入15uL蛋白酶K，加入上清液200μL；加入200μLBuffer AL，震荡15s； 70℃金属浴加热10min，短时离心以除去管盖内沿液体。上述离心管中加入 200μL乙醇(浓度为96％～100％)，震荡15s并短时离心。小心将以上混合液加入到QIAamp spin column中，将离心柱放入2mL收集管中，盖紧离心管盖，以8000rpm离心1min，将离心管取出放入一支洁净的2mL收集管中。加入500μL Buffer AW1到离心管中，盖紧离心管盖，以8000rpm离心1min，将离心管取出放入一支洁净的2mL收集管中。加入500μL BufferAW2到离心管中，盖紧离心管盖，以13800rpm离心3min。将离心管放入一支新的2mL 收集管中，以13800rpm离心3min。将离心管置入一支洁净的1.5mL收集管, 在离心管中加入60μLBuffer AE，室温下静置1min后8000rpm离心1min。检测粪便菌群基因组DNA浓度，基因组DNA模板样品-80℃冷藏备用。

步骤S2qPCR扩增

表1所示的TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(RR420A)试剂盒的成分以及荧光物质(SYBR green)添加到Bio-Rad CFX Connect的qPCR仪器上进行扩增，不同门分类水平的引物的qPCR反应条件参见表2所示。

其中，拟杆菌门正向引物5'-ACGCACGGGTGAGTAACACGTAT-3'和反向引物5'-AGGGGATAAATCCTCTCAGTTCCCCT-3'；

厚壁菌门正向引物5'-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3'和反向引物5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'；

变形菌门正向引物5'-GCTGATCATCCTCTCAGACAA-3'和反向引物 5'-AGAACGAACGCTGGCGTAA-3'；

放线菌门正向引物5'-GCTGATCTGC GATTACTAGCGTC-3'和反向引物5'-ATGTCTTGGGCTTCACGCA-3'。

表1TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(RR420A)试剂盒qPCR体系组成。

SYBR Premix Ex Taq	10μL
		PCR正向引物(10μM)	0.4μL
PCR反向引物(10μM)	0.4μL
		粪便菌群基因组DNA模板	1μL
ddH2O	8.2μL
			总体积为20μL

表2不同门分类水平的引物qPCR反应条件

步骤S3qPCR定量标准

拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的各个门群的定量标准物质是16SrDNA经过引物(正向引物5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增产物约1500bp)扩增。扩增的PCR反应体系为(TaKaRa Ex Hot Start Version,RR006A)： TaKaRa Ex Taq Hs 0.2μL、dNTP Mixture 2μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、正向引物(10μM)1μL、反向引物(10μM)1μL、粪便菌群基因组DNA模板1μL 和ddH₂O 17.3μL。扩增条件为：94℃，3min；94℃，30s；54℃，30s；72℃， 1min；35个循环；72℃，5min；得到扩增产物。

扩增产物继续进行TA克隆(使用TaKaRa基于pMD-20T的TA克隆系统)。将pMD 20-T质粒0.2μL、16S rDNA片段4.8μL和ligation solution I 5μL 的体系混匀后，室温下连接约1个小时得到DNA连接产物。将制备好的 10μLDNA连接产物加入100μLDH5α菌株感受态细胞中，混合均匀，同时设置对照组，均在冰浴中放置30min；在42℃水浴锅中预热45s，之后在冰浴中放置1min，然后加入300μL的LB液体培养基，37℃培养45min；取100μL 上述液体培养基，涂布到凝固好的平板上，同时涂布40μL 20mg/mL的X-gal 溶液、70μL 20mg/mL的IPTG溶液、90μL无菌水，待液体全部渗入培养基中，将平板倒置在37℃生化培养箱中过夜培养。挑选白斑到含有1mL的LB 液体培养基的摇菌管，置于摇床上摇菌3h，吸取100μL菌液进行单克隆测序，测序结果在NCBI上利用Blast功能获得该序列相对应种属信息；剩余菌液加入80％甘油后保存于-80℃冰箱。

从各自TA克隆菌株中分别挑选1株作为4个门的纯质粒样本，按照天根质粒小提试剂盒(DP103天根生化科技(北京)有限公司)的要求提取。具体步骤为：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液 BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取1～5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min，收集上清液。将上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心 30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；重复1次。将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，以去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50～100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min将质粒溶液收集到离心管中，得到洗脱体积60μL，测定其浓度并换算成 copy/L，并按10倍稀释至10^-8次。

因为上述质粒的分子量唯一，质量浓度和摩尔浓度都可以精确测定。对于本技术的qPCR反应中，标准品扩增的是单一产物，被测样品扩增的是某个门的许多种属的长度非常接近的混合产物，因而标准品的浓度需使用摩尔浓度，被测样品测定结果也是摩尔浓度。质粒分子的质量为pMD-20T的 2736bp+1500bp＝4326bp的总分子量。实际上每个TA克隆的质粒的分子量相互之间略有差异，因为插入的不一定均为1500bp碱基长度，各个门都会略有不同，会有几个到几十碱基的差异，但是这里统一把插入的16S序列记为1500 碱基，既方便也不会带来明显的误差。质粒原液进行倍比稀释作为各个门 qPCR定量的标准。特异性扩增保证qPCR产物的熔解曲线只有一个单峰或熔解温度非常接近(相差一般不超过5度)的一组峰。扩增产物的特异性和门特异性标准样品的配制可以保证qPCR定量的有效性。每个门的定量由每个门自己的质粒作为定量标准，而门特异性引物保证扩增产物为目标门的种属序列，如此可以保证qPCR定量的有效性。

实施例2

对确诊为脓毒症的患者和正常对照的粪便样本进行肠道菌群门水平的定量分析，实验步骤和条件同实施例1。分别将各个门的质粒原液(即经TA 克隆得到的纯质粒原液样本)用蒸馏水等比稀释，稀释倍数为10，共8个浓度梯度稀释，分别从10^-1稀释到10^-8，作为各自门qPCR中的标准曲线点，标准曲线结果见图1。使用Bio-Rad CFX Connect仪器进行qPCR反应，循环条件见上述表2。待测样本的输出结果为各个门目标产物的最终浓度，再取对数(log10)得到相对丰度。将所得的菌群结构与16S高通量测序进行比较，结果见图2。

由图2可见，正常人的肠道菌群中，以拟杆菌门和厚壁菌门为主；被诊断为脓毒症而病原学结果为阴性的患者中，其肠道菌群组成与正常对照相似；革兰阴性菌感染的患者肠道菌群中以变形菌门为主；革兰阳性菌感染患者肠道菌群中以厚壁菌门为主。因此，对可疑脓毒症患者进行肠道菌群结构的检测，可以为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的病原学类型，可用于临床脓毒症的辅助诊断。

综上，本发明试剂盒通过检测可疑脓毒症患者肠道菌群结构，可以为脓毒症的诊断提供可靠的感染证据以及感染的的病原学类型：若患者肠道菌群中以拟杆菌门和厚壁菌门为主，则其感染可能性较低；若肠道菌群中以变形菌门为主，则判断为革兰阴性菌感染；若肠道菌群中以厚壁菌门为主，则判断为革兰阳性菌感染。

序列表

<120>预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法

<160>8

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>拟杆菌门(Bacteroidetes)

<400>1

acgcacgggt gagtaacacg tat

23

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>拟杆菌门(Bacteroidetes)

<400>2

aggggataaa tcctctcagt tcccct

26

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>厚壁菌门(Firmicutes)

<400>3

ggagyatgtg gtttaattcg aagca

25

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>厚壁菌门(Firmicutes)

<400>4

agctgacgac aaccatgcac

20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>变形菌门(Proteobacteria)

<400>5

gctgatcatc ctctcagaca a

21

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>变形菌门(Proteobacteria)

<400>6

agaacgaacg ctggcgtaa

19

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>放线菌门(Actinobacteria)

<400>7

gctgatctgc gattactagc gtc

23

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>放线菌门(Actinobacteria)

<400>8

atgtcttggg cttcacgca

19

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

<120> 预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟杆菌门(Bacteroidetes)

<400> 1

acgcacgggt gagtaacacg tat 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟杆菌门(Bacteroidetes)

<400> 2

aggggataaa tcctctcagt tcccct 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 厚壁菌门(Firmicutes)

<400> 3

ggagyatgtg gtttaattcg aagca 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 厚壁菌门(Firmicutes)

<400> 4

agctgacgac aaccatgcac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 变形菌门(Proteobacteria)

<400> 5

gctgatcatc ctctcagaca a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 变形菌门(Proteobacteria)

<400> 6

agaacgaacg ctggcgtaa 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 放线菌门(Actinobacteria)

<400> 7

gctgatctgc gattactagc gtc 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 放线菌门(Actinobacteria)

<400> 8

atgtcttggg cttcacgca 19

Claims (8)

1.一种预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

用于检测人体肠道菌群门分类水平的引物组，所述引物组包括：拟杆菌门正向引物如SEQ ID NO:1所示和反向引物如SEQ ID NO:2所示；厚壁菌门正向引物如SEQ ID NO:3所示和反向引物如SEQ ID NO:4所示；变形菌门正向引物如SEQ ID NO:5所示和反向引物如SEQID NO:6所示；放线菌门正向引物如SEQ ID NO:7所示和反向引物如SEQ ID NO:8所示；

和PCR预混液。

2.如权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和/或放线菌门的定量标准物质。

3.如权利要求2所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述定量标准物质为16S rDNA扩增后的克隆得到纯质粒原液或稀释液。

4.如权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括：荧光定量PCR检测方法用试剂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR预混液为含荧光物质的DNA聚合酶预混液。

6.一种预判断脓毒症感染情况的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

S1，提取样本基因组；

S2，用权利要求1所述的荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量qPCR扩增；

S3，同时分别与拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的定量标准物质进行对比，得出相应的拷贝数。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于S1中的样本为粪便样本。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于S2的qPCR扩增条件是：

拟杆菌门和放线菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，60℃1min，40个循环，95℃5s；

厚壁菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，70℃30s，40个循环，95℃5s；

变形菌门的扩增曲线是95℃30s，95℃5s，50℃1min，40个循环，95℃5s；

拟杆菌门和放线菌门、厚壁菌门、变形菌门的熔解曲线均是65℃～95℃，每5s上升0.5℃。