CN105861666A - 一种测定菌群组成结构的引物设计方法及测定菌群组成结构的方法 - Google Patents

一种测定菌群组成结构的引物设计方法及测定菌群组成结构的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域中的菌群检测方法，尤其是一种测定菌群组成结构的引物设计方法及测定菌群组成结构的方法，引物设计是基于各个纲的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个纲包括的各个物种细胞的详细个数。测定菌群组成结构的方法主要包括纲特异性引物的设计过程；qPCR体系的配置；qPCR条件的设定与运行等步骤。基于纲特异性引物的定量扩增技术可以在纲的层面上快速考察样本中菌群的若干宏观结构及其在不同样本中的差异。

Description

一种测定菌群组成结构的引物设计方法及测定菌群组成结构 的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的菌群操纵方法，尤其是一种测定菌群组成结构的引物设计方法及应用引物测定菌群组成结构的方法。
背景技术
国内外目前常见的近十种菌群结构测定技术简要综述如下:(1)传统培养方法，因受培养条件限制无法获得菌群的全面信息，例如土壤中大部分微生物属于未培养菌，使用传统培养基培养土壤微生物速度慢，鉴定工作量很大；(2)高通量测序方法，这是目前国内外流行的一种群落结构定量测定方法，已经有若干种不同的技术路线，一般通过生物技术公司委托服务来完成，可以返回的测序个数高达几十万条，但是一般只能定性定量到属；(3)基于PCR扩增混合产物的分析方法，如FISH技术；DGGE/TGGE技术；T-RFLP技术；RAPD技术；SSCP技术；AFLP技术等；(9)物种特异性引物测定方法。国际上有些生物技术公司通过对全基因组序列的分析和算法设计，可以找到一些物种特异性的引物，在复杂度有限的实际样本测试中一般具有良好效果。但是这些引物需要经常更新，因为随着越来越多微生物的基因组序列被测定，以前认为的物种特异性序列很可能失去其特异性，需要定期重新设计。
上述菌群结构测定方法中大部分所用到的引物为微生物的通用引物(比如基于核糖体基因的通用引物)，少量是物种特异性引物。它们都不能在某些分类层面上比如纲的分类层面上对菌群结构进行测定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种在纲的分类层面上测定菌群组成结构的引物设计方法及测定菌群组成结构的方法。
本发明测定菌群组成结构的引物设计方法，其引物设计是基于各个纲的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个纲包括的各个物种细胞的详细个数，所述引物设计是基于各个纲的核糖体基因的纲特异性SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配：A-C,T-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配：T-T，T-C,A-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得单碱基识别的纲特异性引物。引物设计的扩增长度一般在80-500碱基，以便于用于qPCR。引物扩增使用的一对引物中其中一个可以是核糖体基因通用引物。
本发明提供了一种测定菌群组成结构的方法，包括以下步骤：
(1)纲特异性引物的设计:通过样本中核糖体基因的扩增(比如16S rDNA扩增引物可以为27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACGACTT-3’))及TA克隆测序，获得一批有效克隆，通过菌落克隆测序，生物信息学序列分析，得到各个克隆对应的分类信息(门纲纲目科属种)。通过对全部有效测序克隆中的核糖体基因序列的多序列比对和反复比较，找出来各自纲的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配：A-C,T-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配：T-T，T-C,A-G；或者是中等强度的错配：A-A，C-C，G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得单碱基识别的纲特异性引物。设计的扩增长度一般在80-500碱基以便于用于qPCR。这些引物对以每个纲的实际核糖体基因序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR扩增(可以使用NPK02试剂盒，山东大正GREDBIO)验证及混合模板验证，以及qPCR(可以使用NPK62试剂盒，山东大正GREDBIO)验证(要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带(不含引物二聚体)，确定各对引物的特异性。每个纲选出最佳扩增特异性的引物各1对，但是最佳引物也可能有好几对。有些在组成上特别复杂的纲有可能暂时找不到令人满意的特异性引物，但是随着基因(组)信息的积累，这类纲的核糖体基因信息更加丰富，假以时日原则上所有的纲都可以找到符合要求的特异性引物。上述设计方法不限于特定的哪个纲，可以适用于任意(天然或人工)菌群样本中任何纲的特异性引物设计。设计的纲特异性引物首先适用于所用样本。如果某个样本中某个纲的物种覆盖面足够大，比如包括了国内外该纲已知物种的95％以上，则设计的纲特异性引物就具备95％的通用性，将还可以适用于很多其他样本。样本核糖体基因序列信息的获得不必局限于TA克隆测序法。
通过上述特定的优化过程得到纲特异性引物序列，之后通过生物技术公司进行合成制备。
(2)qPCR体系的配置：可以使用任何qPCR试剂盒及qPCR仪器。qPCR仪器要求可以检测对应试剂盒包含的荧光物质，如EvaGreen,SYBR green等。
(3)qPCR条件的设定与运行：依据不同菌群和不同的纲进行扩增条件的调整优化；定量识别同一个群落的不同的纲时设计的引物尽量具备相近的Tm值，以便在相同的扩增条件进行测试。
(4)qPCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳即可检测。扩增条件优化后实际进行测定时无需每次再进行产物的检测；qPCR产物的Tm值分析也可以作为扩增质量的判据；扩增产物均一时Tm值分析可以看到单一产物峰。
本发明的优点和有益效果是：
1.天然菌群样本中相当一部分或大多数菌往往为未知微生物，直接在种或属等较低分类层面上同时定量识别一批菌种还比较困难，而本发明测定菌群组成结构的引物是基于纲特异性引物，通过引物的定量扩增可以在纲的层面上快速考察样本菌群的宏观结构及其在不同条件下的结构变化，既简单又实用。
2.本发明的实施所涉及的耗材都是常见的分子生物学试剂，方便易得。所述的qPCR体系配置可以使用任何常见的试剂盒。以山东大正(GREDBIO)的NPK62试剂盒为例，qPCR体系的组成见表格2。
3.与已有方法相比，本发明可以定量样本菌群的主要纲的含量，且成本低廉。
具体实施方式
以下通过对土壤中的菌群组成结构测定为例，对本发明进一步详述，但本发明不局限于下述实施例。
实施例1纲特异性引物的设计：
通过某土壤样本中16S rDNA的扩增，其扩增引物为27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3’)和1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’)，扩增模板为某土壤样本样品及TA克隆测序，获得近800个有效克隆，除了未知菌类占60.78％，已知菌类对应的克隆数目为318个。通过对这318个16S序列的多序列比对和反复比较，找出来各自纲的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位点共221多个。以这些SNP位点作为引物的3’最末端位置尝试设计引物。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间形成一个错配，与非靶序列也形成一个错配。这样一来，引物与靶序列只有一个3’倒数第二位的错配，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配。扩增长度在100-300碱基以便于用于qPCR。这些引物对经过上海生工合成后以每个纲的实际16S序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR(使用NPK02试剂盒，山东大正GREDBIO)验证及混合模板验证，以及qPCR(使用NPK62试剂盒，山东大正GREDBIO)验证(要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带(不含引物二聚体)，确定各对引物的特异性。每个纲选出最佳扩增特异性的引物各1对，其中经过优化的7个纲的特异性引物如表1。
表格1实施例1中7个纲的特异性引物
实施例2基因组样本提取
某土壤样本样品新鲜称取200毫克，采用Solarbio土壤基因组试剂盒或上海生工EZUP柱式土壤基因组抽提试剂盒方法提取基因组，最后洗脱体积为100μL。基因组模板样品(10-50ng/ul)-80℃冷藏备用。土壤土样可以塑料袋密封在-80度冰箱保存1-2年。
实施例3qPCR体系的配置
所述的qPCR体系可以使用多数商业DNA聚合酶或qPCR试剂盒。以GREDBIO的NPK62试剂盒(含2×buffer)为例，qPCR体系的组成参见表格2。
表格2NPK62试剂盒(GREDBIO)qPCR体系组成
2×PCR缓冲液(含荧光染料和PCR增效剂) 6μL
引物1(2μM) 1μL
引物2(2μM) 1μL
模板+H2O 3.8μL
Taq酶(5U/μL) 0.2μL
总体积为12μL
实施例4qPCR定量标准
每个纲的定量标准物质是16S rDNA经过F27-R1492扩增产物TA克隆(使用TaKaRa基于pMD-19T的TA克隆系统)得到的纯质粒原液样本，测定其准确浓度，并按10倍稀释至10-10次。因为上述质粒的大小分子量唯一，质量浓度和摩尔浓度都可以精确测定，对于单一qPCR产物来讲，使用质量浓度和摩尔浓度都可以；而对于本技术中qPCR反应中，标准样品扩增的是单一产物，而被测样品扩增的是某个纲的许多种属的长度非常接近的混合产物，所以标准样品的浓度必须使用摩尔浓度(或分子个数)，被测样品测定出来的结果也是摩尔浓度(或分子个数)。7个纲的纯质粒样本(从各自TA克隆菌株中任意选择1株即可)按照生工SanPrep柱式质粒DNA提取试剂盒SK8191的要求提取，洗脱体积100微升，上样10微升跑琼脂糖电泳检查质量并定量测定其浓度。质粒经过OD260、OD280测定浓度并换算成copy/L(每升多少个分子)。质粒的分子量是pMD-19T的2692bp+(1492-27)bp＝4157bp的总分子量。实际上每个TA克隆的质粒的分子量相互之间略有差异，因为毕竟插入的不都是1492-27＝1465碱基长度，各个纲都会略有不同，会有几个到几十个碱基的差异，但是这里统一把插入的16S序列记为1465碱基，既方便又不会带来明显的误差。质粒原液进行倍比稀释(每次稀释10倍)作为各个纲qPCR定量的标准。特异性的扩增保证qPCR产物的融解曲线只有一个单峰或融解温度非常接近(相差一般不超过5度)的一组峰；按照本发明的纲特异性引物设计，通过对使用纲特异性引物扩增产物的克隆测序可以看到扩增产物都是目标纲的种属。扩增产物的特异性和纲特异性标准样品的配置将可以保证qPCR定量的有效性。每个纲的定量由每个纲自己的质粒作为定量标准，而纲特异性引物保证扩增产物为目标纲的种属序列，如此便可以保障qPCR定量的有效性。
实施例5
利用上述7对纲特异性引物对某企业2种土壤样本(标记为U1，U2)进行7个纲的定量比较。分别将各个纲的质粒原液进行等比例稀释，稀释倍数为10，共8个浓度梯度稀释，分别从10-1稀释到10-8，作为各自纲QPCR中的标准曲线点。使用ABI公司的StepOne仪器进行定量测定，循环条件为94℃-3分钟+(94℃-30秒-59℃-30秒-72℃-30秒)×45循环+72℃-2分钟。待测样本的输出结果为各个纲目标产物的最终浓度，再取对数(log10)得到相对copy丰度，见表格3。
表格3实施例5的定量结果
本发明测定菌群结构组成的方法，其实质是一种基于纲特异性引物的实时定量聚合酶链式反应扩增的优化方法。扩增靶序列是核糖体基因序列。虽然本发明提供的引物特异性非常高，但是核糖体基因在各个纲中所包括的各个菌种基因组中的拷贝数并非全都清楚，计算的是某个纲包括的全部物种的核糖体基因的总拷贝数，所以，本发明是针对各个纲的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个纲包括的各个物种细胞的详细个数。该方法通过在PCR反应体系中使用纲特异性引物达到任意样本中对具体某个纲的微生物菌群的特异扩增，并使用qPCR进行扩增。由于国内外的qPCR技术从样本处理到定量结果出来已经可以控制在2-3小时以内，引物设计并验证后，实际应用起来将具备定量识别效果显著、过程快捷、成本低廉的效果。

Claims (9)

1.一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，其引物设计是基于各个纲的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个纲包括的各个物种细胞的详细个数。
2.根据权利要求1所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，所述引物设计是基于各个纲的核糖体基因的纲特异性SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)位点，该位点作为引物的3’最末端位置使用，如此引物的最后一个碱基与非靶序列形成1个错配；引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配，而与非靶序列再形成1个错配。
3.根据权利要求2所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，引物的3’倒数第二位的碱基与靶序列间的错配分为弱错配和中等强度的错配，弱错配：A-C、T-G，中等强度的错配：A-A、C-C、G-G。
4.根据权利要求2所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，引物的3’倒数第二位的碱基与非靶序列间的错配分为弱错配和中等强度的错配，强错配：T-T、T-C、A-G，中等强度的错配：A-A、C-C、G-G。
5.根据权利要求1-3任一项所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，引物设计的扩增片段长度为80-500碱基。
6.根据权利要求1-3任一项所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，PCR扩增使用的一对引物中其中一个可以是核糖体基因通用引物。
7.根据权利要求1-3任一项所述的一种测定菌群组成结构的引物设计方法，其特征在于，获得的引物可以用于常规的qPCR(quantitative polymerase chain reaction)定量体系，qPCR定量所需的标准扩增模板是每个纲已知浓度的含有核糖体基因序列的克隆质粒。
8.一种测定菌群组成结构的方法，包括以下步骤：
(1)纲特异性引物的设计，按照权利要求1-7所述的引物设计方法设计引物；
(2)基因组样本提取，利用基因组抽提试剂盒提取样品基因组；
(3)qPCR体系的配置；
(4)qPCR条件的设定与运行，依据不同菌群和不同的纲进行扩增条件的调整优化；定量识别同一个群落的不同的纲时设计的引物尽量具备相近的Tm值，以便在相同的扩增条件进行测试；
(5)qPCR产物检测，通过琼脂糖凝胶电泳即可检测，扩增条件优化后实际进行测定时无需每次再进行产物的检测；qPCR产物的Tm值分析也可以作为扩增质量的判据；扩增产物均一时Tm值分析可以看到单一产物峰；
(6)qPCR定量，qPCR定量所需的标准扩增模板是每个纲已知浓度的含有核糖体基因序列的克隆质粒，标准样品的浓度使用摩尔浓度或分子个数。
9.一种根据权利要求1-7任一项引物设计方法所得到的引物，其特征在于，土壤中常见7个纲的引物如下表所示：
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Application publication date: 20160817

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