CN101815791A

CN101815791A - 微生物种群分析

Info

Publication number: CN101815791A
Application number: CN200880016594A
Authority: CN
Inventors: P·H·M·萨韦尔库尔; A·E·巴丁
Original assignee: Vereniging voor Christelijik Hoger Onderwijs Wetenschappelijk Onderzoek en Patientenzorg
Current assignee: Vereniging voor Christelijik Hoger Onderwijs Wetenschappelijk Onderzoek en Patientenzorg
Priority date: 2007-04-17
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2010-08-25
Also published as: EP2152904B1; WO2008125365A8; AU2008238179A1; US9506109B2; EP1985712A1; AU2008238179B9; US20100129816A1; EP2152904A1; JP2010524443A; IL201577A0; CA2684357C; CA2684357A1; JP5763919B2; AU2008238179B2; WO2008125365A1; IL201577A

Abstract

本发明涉及用于分析在怀疑含有细菌、引物、引物组和适合用于该方法的成对引物组的环境中不同分类群组的微生物种群(例如细菌种群)的方法，和该方法在测定外部因素如药物、营养素和杀虫剂对不同分类群组的细菌种群的效应中的用途。

Description

微生物种群分析

本发明涉及分析微生物种群，像不同分类学群组的细菌种群的方法，所述细菌种群在怀疑含有所述微生物、引物、引物组和适合用于本方法的成对引物组的环境中，和将该方法用于测定外部因子像药物、营养素和杀虫剂对这样的种群的作用。

在最近的文章(Science(2005)Volume 308(5728)：1635-8)中，Eckburg和同事描述了巨大多样性的人类肠微生物菌群。他们报道至少395细菌种系型(phylotype)的存在，其中至少244个是新的，80％代表来自未被培养的物种的序列。

所指微生物大多是硬壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌(Bacteroidetes)门的成员，大多数硬壁菌门序列是梭菌(Clostridia)纲的成员。其它检测到的门是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

通常接受的是：更好地理解肠微生物菌群的组成将对于理解微生物菌群在健康和疾病中(例如在Crohn疾病、免疫、代谢疾病、过敏、益生菌活动中的失调、防止细胞损伤、调节宿主脂肪储存、刺激肠血管发生等等中)的基本作用是决定性重要的，但是这些生态系统的类型仍然是未完全鉴定的并且没有很好地定义其多样性。

一个主要的缺点是为了获得如Eckburg描述的这样的数据，不得不进行非常费力和耗时的实验。虽然提供的信息对科学界是无价的，但是在常规和日常基础上，例如在医学实践中进行这样的分析是太费力和耗时的。另外没有充分地研究与时间、饮食和健康状况相关的微生物组成的变化。

缺少可靠、可重复和耗时较少或较不费力的分析这些微生物种群的方法限制和阻碍了对这样的细菌种群的理解。

另一个人们相信微生物群落的组成是很重要的环境的例子是水。如Ibekwe描述(在J.Appl.Microbiol.102(4)：921-936(2007)中)有50％植物覆盖的湿地可以促进那些帮助在表面水中的化学污染物降解的各种微生物群落的生长，并且改善水质。更好地理解这样的系统和这些系统如何被外部因素影响将帮助改善水质。

然而另一个例子是在食物材料中的细菌生态系统。例如，El-Baradei(在Appl Environ Microbiol.2007Feb；73(4)：1248-55中)描述在传统埃及Domiati奶酪中的细菌生态系统的生物多样性。通过PCR-实时温度凝胶电泳(TTGE)和PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)研究了奶酪中的生物多样性。鉴定出优势的乳酸细菌，但还发现了非乳酸细菌。El-Baradei提出这些细菌在成熟过程中具有重要作用。换句话说，更好地理解涉及奶酪成熟的微生物种群对于进一步的产品改进有用。

但是，由于缺少可靠、可重复和耗时较少的可以适合分析未知组成的这样的复杂微生物群落的方法现在限制了对微生物种群的理解及其使用和研究。

在本领域中描述了几种适合鉴定已知细菌的方法。

WO 00/52203描述了鉴定细菌的方法，包括使用作为一个引物的简并引物组扩增存在于样品中的一部分23S rDNA，引物组含有由基本上具有序列5′GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC的DNA组成的一个或更多DNA分子，另一个引物由具有序列5′TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT的DNA组成；和通过与一个或更多个设计用于鉴定一个或更多细菌的寡核苷酸探针杂交而测试获得的扩增子。该方法限于鉴定已知的细菌并且需要使用特异性针对这样的细菌的探针。

WO 02/090582涉及基于分枝杆菌的23S/5S空间区检测分枝杆菌的方法。其描述为了分析所述分枝杆菌可以选择对该属特异的第一引物，而可以选择种特异性的第二引物。

WO 01/23606涉及可以鉴定细菌或细菌群组的核酸分子。含有23S/5S rDNA的区域和属于细菌基因组的区域用作检测细菌的靶向序列。根据发明人，仔细考察了16S/23s rDNA关于用于鉴定细菌的区域。通过进行一致性PCR(consensus PCR)，然后通过扩增DNA鉴定细菌群组，所述DNA是通过使用随后鉴定不同分类水平的细菌的更多特异性引物获得的。通过提供在同样的分类水平(例如属，因此在一个PCR中扩增两个属)中不同群组的引物可以进行这样的一致性PCR。缺点是不得不进行随后的反应，引入关于分析的精确度或准确度的不确定性，而不能提供关于例如特定微生物在这样种群中的相对量的数据。

换句话说，当人们已经知道想要什么时上述方法可以是有用的，但是当要研究的种群由于存在许多和/或未知细菌而高度复杂时，该方法的用途较小。另外，不是单个微生物，而是在种群中的复杂相互作用和微生物的相对量的概念获得流行。但是，所述的方法只在这样的理解中具有有限的用途。因此，明显的需要用于分析微生物种群(组成)的不费力的可靠的方法。这样的方法应该适用于常规基础并且提供至少关于种群的全部组成的信息。

本发明人现在已经惊讶地发现可以通过如随附权利要求所述的主题内容解决至少一个上述问题。

更特别的是发现了用于分析微生物种群而解决至少一个上述问题的方法，所述微生物例如在怀疑含有所述微生物的环境中的不同分类群组的细菌种群，该方法包括下列步骤：

a.提供获自所述环境的DNA并至少向其提供：

i.第一引物组P1，其含有至少一个引物p1，p1针对于对选自门、纲、目或科的第一分类群组特异的至少一个保守位置L1；

ii.第二引物组P2，其含有至少一个引物p2，p2针对于对选自门、纲、目或科的第二分类群组特异的至少一个保守位置L2；

iii.第三引物组P3，其含有至少一个引物p3，p3针对于至少对属于第一分类群组的微生物特异的至少一个保守位置L3；

iv.第四引物组P4，其含有至少一个引物p4，p4针对于至少对属于第二分类群组的微生物特异的至少一个保守位置L4；并且

其中引物组P1和P3适于扩增所述保守区L1和L3之间的区域并且其中引物组P2和P4适于扩增所述保守区L2和L4之间的区域；

b.使用所述引物组进行扩增反应，从而产生在大小、数量、核苷酸序列和/或标记方面具有可检测差异的片段；并且

c.检测所述差异。

令人惊讶地发现用该方法现在可能以可靠、不费力的方式检测微生物种群，例如细菌种群的全部组成。

如对本领域技术人员明确的，在根据本发明的方法中使用的引物和引物组，与本领域中已有的方法相反，不是针对于鉴定种群中的个体微生物(细菌)，而是分析全部种群，都是关于特异的分类群组和关于其他差异，如获得的片段的长度、大小和序列的差异。

如技术人员所理解的术语“至少一个引物”不是指引物存在的拷贝数，而是使用的引物的类型(如通过其序列定义的)。

这样的分析现在第一次使得以简单和直接的方式获得微生物种群例如细菌种群的“指纹图谱”成为可能。这样的指纹图谱含有至少关于存在于微生物种群中的不同分类群组的信息，和例如在上述方法中提及的这样分类群组的全部组成(如通过获得片段的长度、序列等等差异而表示)的信息。

如上面明确的，可以使用根据本发明的同时存在于一个样品中的引物组有利地进行实验。换句话说，有利地，对于根据本发明的含有DNA的样品，至少引物组P1、P2、P3和P4(或至少根据本发明的引物p1、p2、p3和p4)存在于(或加入)相同的样品中。因此，并且有利的，在对于所有引物等同的条件下进行PCR。

关于贯穿本公开的不同术语的使用适用下列定义：

-“细菌种群”是占据特定环境的细菌的群组。熟知的例子是胃肠种群、生物被膜、细菌垫、生长于土壤或在植物的根际(rizosphere)中和水环境中如水中的细菌的群组。

-“微生物种群”是，如在本发明上下文中使用的，占据特定环境的微生物群组。

-“分类群组”具有所有其下属分类单元和它们的个体的分类单元。技术人员已知的分类群组的例子是(从总的至更特异的)域、界、门、纲、目和科。属和种也是分类单元。

-“环境”是指其中微生物种群所处的复杂的周围环境、条件或影响。非限制性例子是胃肠道、牙窝、土壤、根际。

-“引物”是作为DNA复制的起始点的核酸链(或相关分子)。特别的引物可以由3-50个核苷酸，通常和优选地由10-30个核苷酸组成。

-“引物组”是含有至少一个引物的组。在本发明的上下文中，所述引物可以针对至少一个保守位置。

-“保守位置”是含有多重核苷酸和在引物针对的分类群组中共享高同源性的序列。总的来说这意味着所述序列基本上与已知属于所述分类群组的微生物具有至少60％同一性，优选70％，更优选80％，甚至更优选90％的同一性，并且其中基本上相同的意思是不多于8，更优选不多于7、6、5、4、3、2或1个核苷酸是不同的。在任何情况下，当其适用于结合引物和可以将微生物从一个分类群组与另一个分类群组区分时(即当其不结合或基本上不结合来自另一个分类群组的已知微生物的大部分序列并且用根据本发明的方法分析时，该引物对于至少一个分类群组是特异的)，该位置在本发明的上下文中被认为是保守的。例如一个引物可以检测门A和B，但不是门C。在这样的情况下，该引物对门A和B是特异的，并且因此针对门A和B中的保守位置，而所述保守位置在门C中缺失。

-术语“门”、“纲”、“目”或“科”的术语和结果对本领域技术人员是已知的。

-在上面方法中使用的“针对”涉及与引物预期用于的特定分类群组的微生物已知基因组的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％杂交的引物或引物组(还见上面的“保守位置”下的内容)。

-如上述方法中所述的“区”是指两个保守位置之间的核苷酸序列。通常所述序列可以含有10-1500个核苷酸。

-“扩增反应”是指适用于扩增本文所述的两个保守位置之间区域的DNA序列的任何过程。适合的例子包括PCR。

-“大小差异”或“长度差异”是指不同核苷酸长度的片段，例如由于在不同微生物如细菌(见例如Gurtler等人，Microbiology.1995；141：1255-65)之间扩增长度多态性。

-“量的差异”是指在微生物种群中发现的片段拷贝数的差异，所述差异是特定种群中微生物相对量的指征。

-“核苷酸序列的差异”是指在例如将获得的片段测序后，观察到的扩增片段的差异。

-“检测所述差异”可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法。

-如在本发明的上下文中使用的术语“微生物”包括细菌、古菌、原生生物、真菌还有病毒。在本发明的上下文中，当使用术语细菌的、细菌种群或细菌时，还可以包括上述微生物的种群或物种，除非另外声明。

-如本文给定的引物和寡核苷酸的序列用标准的IUB/IUPAC核酸代码表示。

-贯穿本公开使用的术语“指纹图谱”是指如应用根据本发明的方法获得的关于分析微生物的一套实验结果。通常这样的“指纹图谱”含有关于微生物种群如门、微生物的相对量的信息并且可以例如在图1和图2中显示的显像密度计曲线(densiometric curves)中图解表现。因此这样的指纹图谱描述微生物种群并且本身不用于描述这样种群中的个体细菌，虽然明确的是例如通过比较含有特定个体细菌物种的参考样品可以获得这样的信息。

在优选的具体实施方式中，第一和/或第二分类群组是门。

已经发现，当第一和/或第二分类群组是门时，可以有利地应用根据本发明的方法。已经发现当引物组P1或P2分别针对保守位置L1或L2时，并且对门是特异的，现在不仅可能检测具有大小、数量和/或核苷酸序列方面的可检测差异的片段，还通过应用合适的检测方法(见下面)区分不同的门。

通过进行这样的方法，极大地增强了分析微生物种群，例如细菌种群的敏感度。例如，现在不仅可以就大小、数量的差异区分扩增片段，还可以将特定的片段归于特定的门。换句话说，当不使用对不同门特异的所述引物时，只有在例如获得片段的大小差异的水平上的分析是可能的，现在，在同样的方法中，人们还可以在同样的样品中区分不同的门。这提供了关于存在于环境中的微生物种群如细菌种群(组成)，和因此关于所述种群的“指纹图谱”的另外的和重要的信息。另外，人们现在可以将未知的微生物，如未知细菌物种直接分配至特定分类群组，例如未知物种所属的门。

在本发明的另一个优选的具体实施方式中，引物组P3和P4是相同的。

在本发明上下文中的术语“相同的”是指针对于对第一分类群组特异的至少一个保守位置L3的引物组P3由至少一个引物组成，其中所述引物组P3的引物同时对第二分类群组是特异的，换句话说，可以用作两个被检测的分类群组的引物。

已经发现当所述引物组P3和P4相同时，相对于当所述引物组P3和P4不相同的时候，可以获得分析(“指纹图谱”)微生物种群如细菌种群的方法的进一步改进。

不限于或受制于任何理论，相信当所述引物组P3和P4相同时，似乎在样品中较少有非特异性或假的片段扩增。因此获得更可靠和可重复的种群的分析。

另外，已经发现当引物组P3和P4相同时，当涉及种群中存在的微生物的量时，用该方法获得的信息增进可靠性。相信这主要是由于以下事实：当所述组相同时，去除了引物组P3和P4结合至保守位置的效率的可能差异。

在另一个优选的具体实施方式中，提供了一种检测存在于环境中的微生物种群如(例如)细菌种群的改变的方法，包括下列步骤：

a.在第一时间点t0在获自所述环境的DNA上进行根据本发明的方法；和

b.在第二时间点t1在获自所述环境的DNA上进行根据本发明的方法；和

c.比较在步骤a和b获得的结果。

如贯穿本说明书解释的，通过进行所述方法，现在可以检测存在于环境中的微生物种群(例如细菌种群)的改变。特别地现在例如可以有效地和可靠地监测例如在婴儿胃肠道中，例如由于饮食(例如母乳相对于人工婴儿营养素和配方奶)或用药物治疗发生的改变。

现在还可以监测例如在用例如抗生素治疗后微生物种群的再生。

如在例子中显示的，现在甚至可以检测在不同地方或在相同的器官(例如结肠或皮肤或口腔)中微生物种群组成的变化，而同时经典的方法如培养取样于这样的组织的细菌不能实现这样的检测(例如由于在收集样品后微生物不存活的事实)。

通过比较在第一时间点获自环境的扩增片段与在较后的时间点获自环境的结果，可以确定是否在这两个时间点之间和例如由于外部因素如药物的结果而发生了种群的改变。

同样地，通过应用所述方法可以例如及时监测微生物种群是否稳定、波动或在特定的方向发展，例如向着已知健康的或有益的微生物种群(例如细菌种群)(组成)的方向发展。换句话说，比较获得的结果还可以是微生物种群(例如涉及已知的情况如疾病或污染)的特定“指纹图谱”。

特别地已经发现比较可以在门、纲、目、科、属或种的水平上，优选在门的水平上进行。

在本发明的上下文中术语“在水平上”意思是所获得结果之间的比较是通过比较关于提及的分类群组获得的信息而进行，例如通过在时间点t0和t1就特定分类群组的不同片段的数目、数量和大小的差异而比较不同的门。

通过根据本发明的方法，通过比较在不同时间点获得的“指纹图谱”所述比较现在成为可能。

通过在特定的分类群组中，优选门中的比较，并且无需知道存在于种群中的个体微生物(例如细菌物种)的细节，现在可以有利地和在常规的基础上测定是否例如发生了种群的改变，无需详细知道哪种特异的微生物(例如细菌)是增加或变化。

通过将所述信息与已知涉及这样的有益情况的微生物种群(例如细菌种群)(组成)比较，现在可以容易地将例如门的水平上的信息用于分析是否例如有益的改变及时发生。

例如，现在可以容易地监测是否在用药物如抗生素治疗后，微生物种群(例如细菌种群)(组成)是否正在恢复并且向着健康或有益种群发展。

根据本发明的优选的方法，引物组P1由一个引物组成和/或引物组P2由一个引物组成。

如上面所述，引物组P1和/或引物组P2可以含有针对于对特定的第一分类群组特异的至少一个保守位置的多个引物(但是还可以含有多个引物或含有针对不同保守位置的引物)。虽然当所述引物组含有多个引物时获得有益的结果，已经发现当引物组P1和/或引物组由一个引物组成时，获得特别有益的结果。

本领域技术人员将理解的是明显地引物组P1和引物组P2是不相同的(与引物组P3和P4的情况不同)。

已经发现当引物组P1由一个引物组成时，相对于当引物组P1包含一个以上的引物，根据本发明的方法就所获得的结果获得改进。如上面解释的，相信这是由于去除了存在于引物组中的不同引物对存在于样品中的不同DNA中的保守位置L1的结合效率的可能差异，可能将不确定性引入例如关于存在于样品中的特定扩增片段的数量/浓度的结果。当引物组由一个引物组成时，所述不确定性减少。

在本方法的另一个优选的具体实施方式中，本方法的特征是以引物组P3和/或P4由至少两个，优选至少三个不同的引物组成。

已经发现当引物组含有针对至少一个保守位置的至少两个，优选至少三个引物时，改进了对微生物种群(例如细菌种群)的分析。

已经发现通过应用这样的引物组，与当引物组由一个引物组成时相比，引物组可以在存在于样品中的更多不同微生物(如细菌)中结合不同的保守位置(见上面关于“保守位置”)。

如上面解释的，术语“针对保守位置”意思是包含在特定引物组中的引物可以有效地用于检测至少60％，优选至少70％，甚至更优选80％，甚至更优选90％的已知属于特定分类群组，例如门的不同微生物。换句话说，可以检测至少提及到的百分比的已知属于某种分类群组的微生物种类。

现在已经发现通过结合上述的至少两个，优选至少三个不同引物，可以增加可检测的属于一个分类群组的微生物的百分比。

例如，可以发现第一引物p3可以应用于检测达75％的不同种类的属于特定分类群组的细菌，但是不能应用于检测未被检出的25％细菌的至少一部分，这是由于例如下列的事实：引物核苷酸序列中的错配造成引物不有效地结合存在于所述细菌中的保守位置。

通过将所述第一引物p3与第二引物p3，优选与第三引物p3结合，现在引物组P3可以检测至少90％种类的在种群中属于特定分类群组的不同细菌(微生物)。

为此，在引物组中含有的不同引物的序列将关于至少一个核苷酸(A、T、C或G)而彼此不同。通过拥有在引物组中这样的引物，引物组现在还可以有效地结合含有至少对特定分类群组特异的保守位置的微生物，但是当与另一个属于相同分类群组的另一种微生物比较时，引物组在例如一个、两个、三个的更多核苷酸中不同。

与当引物组P3由一个引物组成时比较，因此获得的结果更有代表性和可靠。

可以想象在对本领域技术人员明确的环境下，这也可以适用于引物组P1和P2，即在条件下同样可以应用含有至少两个引物的引物组P1和P2。

进一步，从本说明书中明确的是在更优选的具体实施方式中，引物组P3和P4是相同的，但是含有至少两个，优选至少三个不同的引物。

虽然本发明如此不限于特定环境中的微生物种群(例如细菌种群)，根据本发明的方法优选在来自环境的DNA上进行，所述环境选自存在于人类、植物、动物、水、食物(如乳产品)、酵母培养物(例如用于工业)或土壤中的环境，更优选选自来源于胃肠道、皮肤、肺、唾液、结肠、口、牙窝、腹水、排泄物、脓、溃疡、伤口液体、创伤、血或心血管系统的环境。

本领域技术人员理解这些环境包括什么，并且其本身不需要任何进一步的阐明。

已经发现现在通过在来自所述环境的DNA上进行根据本发明的方法，无需非常详细地分析可以存在于这样样品中的不同物种，可以提供存在于所述环境的微生物种群(例如细菌种群)(组成)的有用的、可靠的和可重复的数据。但是如本领域技术人员清楚的，还可以通过使用根据本发明的方法合适地和优选地进行这样的分析。

例如因此获得的“指纹图谱”可以有效地用于研究微生物种群(例如细菌种群)的改变或发展之间的差别，所述研究通过比较涉及特定情况(例如感染的疾病)以前获得的结果(指纹图谱)或通过及时监视变化而进行。

或者，通过一次确定例如在环境中的病原性细菌的存在(通过进一步应用针对鉴定个体细菌的技术领域中已知的方法)，人们可以将这样的数据与新获得的指纹图谱比较以便确定这样的病原性细菌是否存在，无需(至少最初需要)通过本领域中现在已知的方法证明所述细菌的存在。

在另一个优选的具体实施方式中，所述第一和第二引物组P1和P2被标记并且含有选自荧光标记、优选FAM、TET、HEX、Cy 5、Cy 5.5、Cy 3、Cy 3.5、Cy 7、Tamra、ROX、JOE、FITC、TRITC或放射性标记，优选3H、14C、32P或33P、35S的标记。

在进行了根据本发明的扩增反应后，获得具有大小、数量和/或核苷酸序列方面可检测差异的片段。可以通过本领域技术人员已知的不同方法检测所述差异。

例如，可以通过对单个获得的片段测序确定核苷酸序列的不同。或者，可以通过用核酸内切酶处理而分析片段，因此提供例如含有部分获得的片段的特异性模式。然后这些模式可以与已知模式比较以便进一步分析片段。或者，可以使用由对例如某种分类群组(例如门)特异的特定序列组成的探针。例如在获得不同片段后，可以向样品中加入放射性或荧光探针并且其特异性结合一个分类群组。然后可以通过不仅分析探针杂交(结合；连接)至哪个片段，还分析因此标记的片段的大小的差异而获得这个特定分类群组的指纹图谱。同样，可以对任何其它存在于样品中的分类群组进行所述的检测并且通过使用不同的引物扩增。其它的检测方法包括质谱。

但是，这些方法可以引入关于分析的可重复性和可靠性的不确定性。相反，已经发现当在引物组P1和/或引物组P2中含有的引物用例如放射性标记或都用荧光标记标记时(并且在两个引物都被标记的情况下，明显地引物组用可以彼此区分的标记而标记；见实施例)上面的问题不出现。

可以通过使用例如这些荧光基团标记的引物标记扩增的DNA，只需要非标记核苷酸用于标准的酶的掺入。用标记的引物标记可以保证有效的和无偏向的掺入核苷酸，因为庞大的染料分子不干扰核苷酸的掺入，而另外极大改善了后来的检测，最可能是由于在检测中需要较少的步骤，因为可以通过使用Applied Biosystems的ABI Prism 3130xl遗传分析仪、Genescan分析软件(Applied Biosystems)和软件包BioNumerics 4.61(Applied Maths)，容易地分析标记获得的DNA片段，虽然可选的方法对技术人员是已知的和可以获得的。

上述的标记对本领域技术人员是已知的并且可以例如从Invitrogen(Carlsbad、California)获得。如本领域技术人员所理解的，优选引物组P1和引物组P2都用不同的标记而标记，使得容易地区分扩增的片段。

因此，根据本发明的另一个优选的具体实施方式，引物组P1的标记与引物组P2的标记不同。例如引物组P1的标记是荧光的，引物组P2的标记是放射性的。更优选两个标记都是荧光的，但是可以彼此区分。

如上面解释的，根据本发明的方法不限于对一个分类群组例如门特异的引物组P1和引物组P2，但是在方法中可以引入另外的引物组P。

例如，第一引物组P1针对第一个门，第二引物组P2针对第二个门，另外的引物组P-另1针对另一个门，以及当然合适的引物组P3和P4和另外的引物组P-另2以便允许扩增保守位置L1-L3、L2-L4之间的区域和保守L-另外位置P-另1和P-另2之间的区域。

在根据本发明方法的进一步具体实施方式中，并且当第一或第二分类群组是门时，该门选自硬壁菌门(firmicutes)、梭杆菌门(fusobacterium)、脱铁杆菌门(deferribacteres)、螺旋体门(spirochaetes)、蓝细菌门(cyanobacteria)、乳杆菌门(acidobacteria)、硝酸刺菌门(nitrospina)、消化螺旋菌门(nitrospirae)、暖发菌门(caldithrix)、卤素厌氧细菌门(haloanaerobiales)，疣微菌门(verrucomicrobia)、衣原体(chlamydiae)、浮霉菌门(planctomycetes)、芽单胞菌门(gemmimonas)、纤维杆菌门(fibrobacteres)、绿菌门(chlorobi)、拟杆菌门(bacteroidetes)、变性菌门(proteobacteria(、热孢菌门(thermotogae)、嗜热粪杆菌门(corprothermobacter)、联合菌门(synergites)、热脱硫杆菌门(thermodesulfobacteria)、脱硫杆菌门(desulfurobacterium)、产水菌门(aquificae)、异常球菌-栖热菌门(deinococcus-thermus)、绿弯菌门(chloroflexi)或放线菌门(actinobacteria)。特别地，硬壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和放线菌门是优选的门。

这些门对本领域技术人员是已知的并且已经例如被Schloss在Microbiology and Molecular Biology Reviews，Dec 2004，volume68(4)：686-91)中或在有名的Bergey Manual，Second Edition 2004，Release 5.0中有描述。

例如拟杆菌门由三个大类的广泛分布于环境，包括在土壤中、在沉淀物、海水中和在动物的胆中的细菌组成。到目前为止，最好地研究了拟杆菌类，包括拟杆菌属(在包括人类的温血动物排泄物中的丰富的生物；包括例如生酸拟杆菌(B.acidifaciens)、吉氏拟杆菌(B.distasonis)、股薄肌拟杆菌(B.gracilis)、脆弱拟杆菌(B.fragilis)、奥利斯拟杆菌(B.oris)、卵形拟杆菌(B.ovatus)、腐败拟杆菌(B.putredinis)、化脓拟杆菌(B.pyogenes)、便拟杆菌(B.stercoris)、猪拟杆菌(B.suis)、扭柱螺拟杆菌(B.tectus)、多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)、普通拟杆菌(B.vulgatus))和紫单胞菌属(Porphyromonas)，其是生长于人类口腔的生物群组。拟杆菌属的成员是条件病原体。另外两种的成员极少对人类是致病的。

例如，现在在硬壁菌门中有274个以上的属，硬壁菌值得注意的属包括：杆菌、杆菌目(杆菌属、李斯特菌属、葡萄球菌属)；杆菌，乳(酸)杆菌目(肠道球菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、梳状菌属(Pectinatus)、足球菌属(Pediococcus)、链球菌属)；梭菌(嗜酸菌属(Acetobacterium)、梭状芽孢杆菌属、真细菌属、日光杆菌(Heliobacterium)属、日光螺旋菌属(Heliospirillum)、鼠孢菌属(Sporomusa)；柔膜体(支原体属、螺原体属、脲原体属、丹毒丝菌属)。

已经发现，特别地，根据本发明的方法可以适合用于分析其中所述门预期存在的微生物种群(例如细菌种群)(组成)。已经发现，特别地，在不同门的水平，该方法提供实验结果/数据，其可以有利地用于研究例如外部因素对微生物种群(例如细菌种群)，例如在人类胃肠道中发展的作用。相信无需详细研究在样品中存在的多种不同的物种，在门水平的分析提供足够的、可靠的和有用的数据。

根据本发明的方法，因此现在可以通过简单的过程获得详细的关于存在于环境中的微生物种群(例如细菌种群)的组成的信息，无需在属或种的水平上的详细分析，因此减少了实验步骤的量和所需引物，强劲地改进了关于微生物种群(例如细菌种群)获得的定量和定性数据的可靠性、可重复性。根据本发明的方法不仅允许分析微生物种群(例如细菌种群)(组成)，另外还允许分析在种群中(鉴定的或未鉴定的)微生物(如细菌)的相对存在。

进一步公开了根据本发明的方法，其特征是如下面所述设计的成对的引物组P1-P3和/或成对的引物组P2-P4。

特别地，提供了一种根据本发明的方法，其特征是通过提供下列物质设计成对的引物组P1-P3和/或成对的引物组P2-P4：

a)含有至少一个引物A和一个引物B的第一对引物组P1-P3，其中

i)所述引物A是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，并且其中所述引物针对于对第一分类群组特异的保守位置；

ii)所述引物B是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，其中在引物A和引物B之间的区域是属于第一分类群组的微生物中的10-5000个核苷酸；

b)含有至少一个引物C和一个引物D的第二对引物组P2-P4，其中，

i)所述引物C是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，并且其中所述引物针对于对第二分类群组特异的保守位置；

ii)所述引物D是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，并且其中在引物C和引物D之间的区域是属于第二分类群组的微生物中的10-5000个核苷酸。

显然，第一和第二分类群组彼此不同。

已经发现，可以用如下面所述设计的引物组获得特别有利的结果。

这样的引物的特性在于其形成两对引物组P1-P3和P2-P4，每个对一个分类群组特异，即可以区分不同的分类群组。可以通过拥有每个对不同分类群组特异的引物组P1和引物组P2而实现，而引物组P3和P4不必对特异的分类群组特异(例如P3可以与P4相同)。另外，可以通过直接比较属于特定分类群组的已知微生物的序列和比较用于第二分类群组而获得的引物组而确定成对的引物组。在用于根据本发明的方法中的特定成对的引物组之间的区域可以例如在10至5000个核苷酸之间，而引物通常有3-50个核苷酸的长度，优选10-30个核苷酸。通过设置引物的长度和一对引物组(例如P1-P3)中的两个引物之间区域的长度，通过例如计算机分析微生物的已知序列，并且如果需要随后分析区域(例如关于长度、大小或序列的差异)，本领域技术人员可以用本文提供的公开确定合适的用于根据本发明方法中的引物组中的引物。

这样的引物，引物组、成对的引物组和其用途因此明确地包括在本发明中。

通常，合适的成对的引物组可以如下设计：

如所述的，在引物组P1中，至少含有针对保守位置L1的第一引物p1(在本发明的上下文中的引物A)。这个保守位置L1对第一分类群组，例如对于特定的门是特异的。因此，在设计合适的引物组的第一步中，基于从序列数据库中获得的序列信息，确定在至少第一个门的绝大部分已知物种中保守的位置和引物可以针对的位置。例如在至少3、4、5，优选至少10个或更多已知的属于第一分类群组的物种中确定所述序列。

如已经在本发明中发现的，优选的是引物优选是至少3-50个核苷酸，更优选10-30个核苷酸的长度。换句话说，需要确定的保守位置(在本发明的上下文中)优选也是至少3-50个核苷酸，更优选是10-30个核苷酸的长度。

例如在如下显示的核苷酸序列情况下，可以确定合适的引物：

门X、3个细菌物种X1、X2、X3

X1 acg tta act tcg gcc ggg aaa ggg ggg ttt

X2 tac acg gtg agc cat cat cat ggg ttt

X3 acg tca tca ctg ttc ccc ccc ggg ttt

一个合适的引物的例子是这样的情况因此是针对如在序列X1、X2和X3中发现的保守位置L1acg-的引物。

同样，可以通过分析已知的细菌X1、X2和X3的序列发现第二引物(在本发明的上下文中是引物B；因此是位置L3)。关于本发明已经发现优选地在L1和L2之间的区域应该至少是约10并且最多是约5000个核苷酸。本领域技术人员知道例如，在长度多态性情况下，这样的区域对于不同微生物，例如对于不同的细菌X1、X2和X3将具有不同长度。换句话说，已经发现对于适合于根据本发明的引物组的第二引物，足够分析在第一引物的上游或下游的最多约5000个核苷酸。

与第一引物一起可以形成用于根据本发明方法的合适引物组的合适第二引物的例子显示如下：

门X、3个细菌物种X1、X2、X3

X1 acg tta act tcg gcc ggg aaa ggg ggg ttt

X2 tac acg gtg agc cat cat cat ggg ttt

X3 acg tca tca ctg ttc ccc ccc ggg ttt

在这种情况下合适的引物的例子将因此是针对在序列X1、X2和X3中发现的保守位置L3ttt的引物。

如可以从上面的例子中所证实的，当使用这样的用于扩增位置L1和L3之间的区域的引物时，获得大小不同的区域。在现在的例子中区域是24、18和21个核苷酸的长度。如可以被本领域技术人员所理解的，所述引物组可以合适地检测相同分类群组的微生物，以及在这样的分类群组中的不同的物种。

为了将一个分类群组与另一个区分，但是在下一步需要确定一个针对保守区域的特定的引物组是否对第一个门是特异性的。

如上述的，在任何情况下，当其适合用于结合引物从而允许将来自一个分类群组的细菌与另一个分类群组的细菌区分开时，位置在本发明的上下文中是保守的，即当其不结合或基本上不结合绝大部分另一个需要用根据本发明的方法分析的分类群组时(或不能获得扩增产物时)，引物对于至少一个分类群组是特异性的。例如一个引物可以检测门A和B，但不是门C。在这样的情况下，引物对门A和B是特异的，并且因此针对于门A和B中的保守位置，而所述保守位置在门C中缺失。

为了确立如上面设计的引物组是否可以合适用于将一个分类群组的微生物与另一个分类群组的微生物区分开，必须确定的是至少一个保守位置L1或L3在大多数(如果不是全部)第二分类群组的已知序列中是缺失的，或保守区L1和L3之间的区域具有不适合进行根据本发明方法的扩增反应的长度(例如在10000个核苷酸以上)。

例如当确定细菌X1、X2、X3和X4的第一个门的合适的引物组时，可以鉴定下列候选(F-引物＝正向引物，R-引物是反向引物)：

F-引物	R-引物	长度
F-引物	R-引物	长度						X1	X2	X3	X4
ttgatcgat	agtcatat	100	120	150	200			X1	X2	X3	X4
ttgatcgat	agtcatat	100	120	150	200	gtacaagg	tacgcgga	250	200	150	75
acatcgac	atagatag	200	150	250	300	gtacaagg	tacgcgga	250	200	150	75

如可以见证的，因此在例子中的引物组可以适合用于分析属于所述门的物种。在给定的例子中，可以获得长度上不同的片段并且因此可以用于提供需要分析的微生物种群的部分指纹图谱。

同样，当确定合适的对于含有细菌Z1、Z2、Z3和Z4的第二个门的引物组(在本发明这个方面的上下文中的引物C和D)时，可以鉴定下列候选(F-引物＝正向引物，R-引物是反向引物)：

F-引物	R-引物	长度
F-引物	R-引物	长度						Z1	Z2	Z3	Z4
gtagagag	cgtcgaaa	200	150	120	300			Z1	Z2	Z3	Z4
gtagagag	cgtcgaaa	200	150	120	300	aagtcgctg	gtacgtcg	80	70	180	100
tgatcgatg	atagatag	140	160	200	250	aagtcgctg	gtacgtcg	80	70	180	100

可以基于引物因此容易地确立在现在的例子中，在两个门中都可以发现反向引物atagatag。另外，来自第一个门的正向引物Acatcgac对所述第一个门特异，并且正向引物tgatcgatg对第二位置特异。换句话说，含有引物acatcgac和atagatag的一对引物组P1-P3和含有引物tgatcgatg和atagatag的一对引物组P2-P4，将在本实施例中是适合用于根据本发明方法的引物，因为通过使用这样的引物，可以区别不同的门，而另外，可以获得基于长度(大小)差异可以容易地区分的片段。应该注意到，在现在的实施例中，引物组P3与引物组P4是相同的(即atagatag)，虽然在其它的实施例中P3和P4可以是不相同的。

通过上面的公开，本领域技术人员将理解他如何可以设计适合用于本发明的引物，或确定特定的引物是否是用于根据本发明方法的引物组中合适的引物。

虽然如上文解释的，本领域技术人员可以容易地确立用于根据本发明方法的引物，或确定特定的引物或引物组是否可以成功地应用于根据本发明的方法，特别地当引物组P1或P2含有基本上由具有选自Seq ID No 1-2序列的DNA组成的引物时，已经获得好的结果。

具有Seq Id No.1的第一正向引物对硬壁菌门和放线菌门是特异的并且可以例如用荧光标记FAM标记。所述引物的核苷酸序列是：

FirISf：5’-CTGGATCACCTCCTTTCTAWG-3’(SEQ ID No 1)

具有Seq Id No.2的第二引物对拟杆菌门是特异的并且可以例如用荧光标记HEX标记。所述引物的核苷酸序列是：

BacISf：5’-CTGGAACACCTCCTTTCTGGA-3’(SEQ ID No 2)

如可以被本领域技术人员理解的，还包括的是基本上具有所述序列的引物。换句话说，与提供的序列相比引物中例如1、2、3或4个核苷酸被改变了，或例如引物具有比上面提供的引物长度长或短1、2、3、4或5个核苷酸的长度。

在另一个优选的具体实施方式中方法的特征在于引物组P3或引物组P4含有基本上由具有选自SEQ ID No 3，4或5(3-5)序列的DNA组成的引物。

这些反向引物可以是非标记的。

DUISr1：5’-AGGCATCCACCGTGCGCCCT-3’(SEQ ID No 3)

DUISr2：5’-AGGCATTCACCRTGCGCCCT-3’(SEQ ID No 4)

DUISr3：5’-AGGCATCCRCCATGCGCCCT-3’(SEQ ID No 5)

如将被本领域技术人员理解的，还包括的是基本上具有所述序列的引物。换句话说，与提供的序列相比引物中例如1、2、3或4个核苷酸被改变了，或例如引物具有比上面提供的引物长度长或短1、2、3、4或5个核苷酸的长度。

如将被本领域技术人员理解的，特别地，可以有利地应用多个包含在引物组P3或P4中的引物的组合，如上面详细讨论的。

特别地，优选的是当引物组P1含有基本上由具有Seq ID No.1序列的DNA组成的引物并且和当引物组P2含有基本上由具有Seq ID No.2序列的DNA组成的引物时，引物组P3或引物组P4含有基本上由具有选自SEQ ID No.3、4或5序列的DNA组成的引物。

通过这样的组合，可以获得对微生物种群(例如细菌种群)组成的好的分析，例如如在实施例中显示的。

作为进一步的例子，可以给出适于检测属于肠杆菌科的成员组成的引物(Seq Id No 6)。通过使用上述方法设计这个引物以用于发现适合用于根据本发明方法中的引物。

具有Seq Id No.6的正向引物可以用例如荧光标记NED标记。所述引物的核苷酸序列是：

正向(DUISr4)：5’GGCATCCACCGTGTACGCT 3’(SEQ ID No 6)。

在另一优选的具体实施方式中，方法的特征在于对于上述的引物(SEQ ID No 6)，引物组P3或引物组P4进一步含有基本上由具有SEQID No 7序列的DNA组成的引物。

反向(EntISf)：5’TTGGATCACCTCCTTACCTWA 3’(SEQ ID No 7)

在另一个优选的根据本发明方法的具体实施方式中，保守位置L1、L2、L3或L4选自16S rDNA区、23S rDNA区、5S rDNA区、16S-23S中间区或5S-23S中间区内的保守区。

所述区域对于本领域技术人员是已知的并且已经发现其是在特别适合的位置上，所述位置用于确定适合用作例如引物组P1、引物组P2或引物组P3和引物组P4中的引物的引物。

在例如Seq Id No.1-5中描述的引物是这样合适的引物的例子。

如上面解释的，可以使用几个本领域中已知的方法(测序、质谱等等)分析用根据本发明的方法获得的片段。

优选地，获得的片段含有大小不同的片段，并且可以检测这样的不同。换句话说，如此选择用于根据本发明的不同引物组的引物：属于特定分类群组的不同种类的微生物获得的片段有大小的差异。

因此，根据本发明的优选的方法是一种其中获得的片段至少含有大小差异的方法。

在本发明的另一个方面，提供了适合用于根据本发明的方法的引物或引物组。

如上面解释的，知道本文公开的本领域技术人员没有任何能够确定特定的引物、引物群组或引物组或与另一个引物组的组合是否适合用于根据本发明方法的发明技能。

例如，在Seq ID No 1-7中所描述的引物可以适合用于根据本发明的方法。

因此，在另一个优选的具体实施方式中，至少一个引物用于基本上由具有选自SEQ ID No 1-7序列的DNA组成的本发明。

根据本发明的另一个方面，提供适合用作根据本发明方法中的成对引物组P1-P3或P2-P4的引物组的组合。

如将被本领域技术人员理解的，并且如本文所述的，根据本发明的方法基于扩增两个保守位置L1和L3和/或L2和L4之间的至少一个区域。换句话说，一定要提供适合用作成对的引物组P1-P3或P2-P4(并且其中P4可以与P3相同)的引物组的组合。

特别地，提供了如上述的引物组的组合，其特征在于至少一个基本上由具有选自SEQ ID No 1-7序列的DNA组成的引物。

在另一个方面，提供了含有适合用于根据本发明方法的至少一对引物组P1-P3和/或一对引物组P2-P4的试剂盒。

这样的试剂盒进一步包括其它适合用于根据本发明方法的成分，如标记的引物、缓冲液、核苷酸、聚合酶、孵育管等等，或如何操作根据本发明方法的说明书。

在另一个方面，提供了根据本发明方法的用途，适合用于根据本发明方法的引物或引物组的用途，用于研究外部因素对环境中微生物种群(例如细菌种群)组成的影响，其中外部因素选自饮食、食物、药物、抗生素、温度、益生菌、污染物、杀虫剂或医学治疗。

如本文解释的，根据本发明的方法可以适合用于(以可靠的方式)研究微生物种群(例如细菌种群)的组成。因此获得的微生物种群(例如细菌种群)的指纹图谱还可以通过例如与来自其它的、但是可比较的环境的指纹图谱相比较(例如来自健康个体和患有特定状况的个体的微生物种群(例如细菌种群)之间的比较)，或通过比较获自相同的环境但是不同时间点的微生物种群(例如细菌种群)的组成(例如，这允许容易地研究在例如抗生素治疗后，或在土壤用杀虫剂等处理后微生物种群组成的发展)。

用这种方式，可以有利地用根据本发明的方法分析可以影响微生物种群(例如细菌种群)组成的外部因素的效应。

特别地，可以容易地关于微生物种群(例如细菌种群)组成的发展或改变监测选自饮食、食物、药物、抗生素、温度、益生菌、污染物、杀虫剂或医学治疗的外部因素。

如在提供的实施例中可见的，当进行根据本发明方法的特定具体实施方式时，提供了关于例如不只是扩增片段大小差异的信息，还有所述片段属于的特定分类群组例如门的信息。通过该方法，可以获得微生物种群(例如细菌种群)的总的概况，无需确定所述获得的片段属于哪个特定的微生物。

但是还将被本领域技术人员理解的是通过将获得的结果与通过将根据本发明的方法应用于获自一个特定微生物(例如细菌)的DNA而获得的结果比较，可以进行微生物种群(例如细菌种群)的进一步详细的分析。

另外，将被本领域技术人员理解的是通过比较例如获自不同个体，例如自健康个体和自患有特定状况的个体的样品之间获得的结果，现在可以容易地分析特定状况是否伴随特征性的微生物种群(例如细菌种群；指纹图谱)(的组成)。例如可以检测的是在状况X下，存在属于不同分类群组(例如门)的细菌之间例如比例的改变，而另外可以发现，与存在于健康个体中的种群比，属于一个特定门的特定(未知)细菌在种群中大量地增加，而与在健康个体中存在的种群相比其它细菌是缺少的。换句话说，种群的指纹图谱改变了。

同样，根据本发明的方法可以有利地用于分析外部因素如饮食、食物、药物、杀虫剂等对微生物种群(例如细菌种群)组成的效应。

同样，当把关于微生物种群(例如细菌种群)的组成获得的信息与那些涉及或已经涉及特定状况(如健康状况、饮食或环境中杀虫剂的存在等)的组成相比时，现在可以第一次预测这样的特定状况是否还可以存在于/发生于被分析的微生物种群(例如细菌种群)中。

例如，当特定的纤维如半乳寡聚糖或果糖寡聚糖的消耗影响含有更多属于例如拟杆菌门细菌的胃肠道的特定部分中的微生物种群(例如细菌种群)的组成时，这样的微生物种群(例如细菌种群)组成的特定指纹图谱可以与获自个体的指纹图谱相比，以便确定这个人是否将例如消耗同样影响所述胃肠道部分中微生物种群(例如细菌种群)组成的食物因素。

因此使用根据本发明的方法，现在可以更好地理解微生物种群(例如细菌种群)(的组成)之间的关系和其中外部因素的影响。因此该方法可以有利地用于研究、分析、预测外部因素和/或状况对微生物种群(例如细菌种群)的作用，反之，无需知道特定的微生物存在于样品中。通过根据本发明的方法获得的微生物种群(例如细菌种群)的指纹图谱可以有利地用于所述目的。

本发明现在将进一步用下面非限制性实施例举例说明。虽然将被本领域技术人员理解的是下面的实施例不限制本发明，还要理解的是提及的方法、材料、条件如温度和浓度、引物和使用的标记，可以独立于实施例中的上下文，和在本发明中被认为是在本发明的上下文中保持优选的具体实施方式。例如当提到反应可以在37-40℃在2-50mM的浓度进行时，37-40℃和2-50mM是彼此独立的，被认为是有利条件和在本发明的上下文中的具体实施方式。

实施例

实施例1.样品

人类胃肠道：

来自人类肠的活组织检查样品在结肠镜检查中获得(样品同样可以通过肠的其它部分的活组织检查，包括小肠而获得)。获得的样品重量在25mg以下并且我们立即用0.9％NaCl洗涤，冻在液氮中并且储存于-80℃直到使用。

实施例2.DNA分离

为了从获得的样品中分离DNA，首先裂解获得的样品。为此使用QIAGEN QIAamp DNA Mini试剂盒，但是本领域技术人员将理解其它裂解方案是可用的。

在解冻实施例1中获得的样品后，将样品转移至含有360μl ATL缓冲液的管中。加入约40μl蛋白酶K。将获得的混合物在56℃孵育直到样品中的组织裂解(约1-2小时)。在14000rpm离心5秒后，加入400μl AL缓冲液。将混合物充分震荡15秒并且在摇动下在70℃孵育10分钟。

接着，使用easyMAG Biomérieux)继续DNA的分离。为此，使用有内部裂解步骤的内部标准规程，使用约800μl混合物。在进行如在easyMAG中有的规程，总共获得在缓冲液中的约110μl DNA。

实施例3.引物

如在步骤2中获得的约10-100微升DNA用于根据本发明的分析。

为此，进行PCR反应，虽然本领域技术人员将理解可以使用其它扩增DNA的方法。

在根据本发明的本实施例中用于扩增的引物(0.1-1μM或更多)的特征在于正向引物是这样的：其仅仅对有限数量的门，例如对于仅仅一个或仅仅两个不同的门是特异的。另外，引物用不同的荧光标记而标记。DNA∶引物的比例可以在1∶1和1∶50之间变化。

本实施例中的第一正向引物对硬壁菌门和放线菌门特异并且用荧光标记FAM标记。所述引物的核苷酸序列是：

FirISf：5’-CTGGATCACCTCCTTTCTAWG-3’

对拟杆菌门特异的第二引物用荧光标记HEX标记。所述引物的核苷酸序列是：

BacISf：5’-CTGGAACACCTCCTTTCTGGA-3’

另外，将3个非标记的反向引物加入混合物中。

它们是：

DUISr1：5’-AGGCATCCACCGTGCGCCCT-3’

DUISr2：5’-AGGCATTCACCRTGCGCCCT-3’

DUISr3：5’-AGGCATCCRCCATGCGCCCT-3’

在Applied Biosystems的GeneAmp PCR系统9700中进行PCR反应。为每个独立的PCR反应制备下列混合物：

储存液每个反应(μl)

PCR Gold缓冲液 10x 2.5

DNTP 2mM 2.5

MgCl2 25mM 1.5

BSA 1,25％ 0.8

Ampli TAQ Gold 5U/ul 0.2

Bidest 100％ 4

FirISf 10μM 0.7

BacISf 10μM 0.7

DUISr1 10μM 0.7

DUISr2 10μM 0.7

DUISr3 10uM 0.7

PCR循环如下：

94℃7分钟

72℃5分钟

实施例4.片段分析

在PCR后，用Applied Biosystems的ABI Prism 3130xl遗传分析仪，Genescan分析软件(Applied Biosystems)和软件包BioNumerics 4.61(Applied Maths)分析获得的片段。

实施例5.根据本发明的方法典型操作的结果

下面图1中的结果从获自如上述的人类肠的5个活组织检查活样品中获得。

在图1中，从左至右，片段的长度从0个碱基对跑至1000个碱基对。以一个“s”指示的小峰是大小标记的例子，其允许关联获得的不同片段的大小。

以一个“B”指示的峰代表来自拟杆菌门细菌的HEX标记的片段。

以一个“F”指示的峰是来自硬壁菌门和放线菌门细菌的FAM-标记产物的例子。

通过将x-轴上的位置与大小标记关联，确定片段的确切长度。这样的数据可以例如涉及就一个或更多特异细菌种属而已经获得的特异信息。相信峰的高度代表存在于种群中的特定细菌的量。

从结果中明确的是不同的个体显示不同的指纹图谱，并且在一些个体的指纹图谱中峰是存在的而在其它个体中其是缺失的，而同时可以观察到在不同个体之间的相似性。

实施例6.

在图2中，将如上述的根据本发明的方法应用于所谓的混合的粪肠球菌(属于硬壁菌门)和脆弱拟杆菌(属于拟杆菌门)的培养物。如从图中可见的，该方法可以区分两个不同的细菌，但是更重要的现在可以通过比较获得的“指纹图谱”与微生物种群(例如细菌种群)的指纹图谱，容易地使用所述数据，无需这样细菌的特异性引物，允许容易地和直接地鉴定存在于微生物种群(例如细菌种群)中的这样的微生物(例如细菌)。

实施例7.

进行实验而研究“指纹图谱”，即取样于结肠中不同位置的细菌种群的复杂组成。另外用根据本发明的方法分析排泄物。

为此通过本领域已知的方法在20个健康个体上进行结肠镜检查。基于肠疾病的遗传倾向进行该过程。对于所有在这一分析中使用的个体，在结肠活组织检查上进行的结肠镜检查和组织学未显示异常。对于每个患者，从整个结肠和直肠中取5个活组织检查。活组织检查的位置是：盲肠(CC)、肝曲(HC)、脾曲(LC)、乙状结肠(SC)和直肠(RC)。

在结肠镜检查后的一些天(例如3天)，收集排泄物。使用在本申请中所述的引物和引物组，按照上述进行DNA分离和从所有样品中产生图谱。结果的簇分析(使用Pearson相关和UPGMA)显示对于每个个体，微生物图谱(如通过根据本发明的方法产生的)在结肠和直肠中几乎是相同的。

然而图谱的个体间变化非常大：每个患者有自己的独特的图谱。从排泄物中获得的图谱显示来自活组织检查的显著不同，但是排泄物图谱仍是患者特异性的：不与其他排泄物样品成簇，图谱还是与相同患者的活组织检查图谱成簇(图3；图3显示结肠活组织检查和5个个体的排泄物的簇分析。虽然显著不同，排泄物图谱还是与相同个体的结肠图谱成簇。)

这个例子明确显示无论活组织检查的解剖位置，根据本发明的方法对于分析结肠活组织检查样本是极好的。另外，排泄物图谱与相同个体的活组织检查图谱相关并且还极适合作为根据本发明的方法的输入(IS-Pro)。这个数据还证实了根据本发明的方法的可重复性。

实施例8.

进行了进一步评估根据本发明的方法对研究和确定指纹图谱即存在于样品例如存在于排泄物中的微生物组成(无需详细和之前确实知道微生物)的适合性。实验的目的是确定是否可以检测微生物(例如由外部因素如饮食、药物、酒精诱导的)组成的变化。

为此，在2周内获得来自健康个体的7个排泄物样品。通过使用BioNumerics软件包进行用根据本发明方法产生的图谱的分析。这个分析显示存在于排泄物中的拟杆菌随时间稳定，而硬壁菌在这期间显示变化。这个变化可能与个体在取样前一天摄入酒精有关。这个数据强调和证实根据本发明的方法是敏感的方法，非常适于检测微生物(由外部因素如酒精、饮食或药物诱导的)组成的变化。

实施例9.

肠道微生物发展和抗生素干预的效果

在一组5个新生儿中，在出生后7、14和30天收集排泄物。其中一个婴儿(儿童5)在研究期间的大部分接受抗生素。使用根据本发明的方法，从所有样品中产生图谱(指纹图谱)。按照以上所述分析图谱和进行簇分析。

结果显示儿童1-4的图谱显示在时间内彼此相关，儿童1和2和儿童3和4显示出强的成对相似性。在第30天图谱开始不同。来自儿童5(接受了抗生素的儿童)的图谱与从其他儿童获得的图谱不相关或在整个研究期间彼此不相关(图4；图4用UPGMA产生的树状图显示在整个时间内对除了儿童5的所有儿童的强相关性，儿童5接受了抗生素)。

实验显示抗生素干预可以对肠微生物组成有大的影响并且可以通过根据本发明的方法容易地评估这样的变化。

实施例10.

皮肤微生物

为了评估根据本发明的方法对于分析皮肤微生物的可应用性，从5个个体中取耳后皮肤拭样。五个个体中的一个具有感染的皮肤损伤。从这个损伤也取了拭样。如上所述从这些皮肤拭样分离DNA并且用根据本发明的方法产生图谱。图谱的分析显示皮肤微生物在个体间非常相似。从感染性皮肤损伤中获得的图谱与该个体的耳后拭样和来自所有其他个体的图谱显著不同。从这里我们得出结论，根据本发明的方法适合于分析在皮肤上发现的复杂微生物，并且使用该方法检测例如在皮肤损伤中发现的这个图谱的变化是非常直接的。

实施例11.

口腔微生物

为了评估根据本发明的方法对于分析口腔微生物的可应用性，从5个健康个体中取口腔拭样。五个个体中的一个有口腔粘膜的aphtoid溃疡。也从这个损伤取了拭样。按照上面所述从这些口腔拭样分离DNA并且产生图谱。图谱的分析显示口腔微生物在个体间比皮肤微生物更可变，但比肠微生物有远小的可变性。从aphtoid损伤获得的图谱与取自该个体的非溃疡粘膜的口腔拭样显著不同。从这里我们得出结论，根据本发明的方法适合于分析口腔微生物，并且使用该方法检测例如在aphtoid损伤中发现的这个图谱的变化是非常直接的。

序列表

<110>高等教育科学研究及疾病护理协会

<120>微生物种群分析

<130>p28677PC00

<160>7

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

ctggatcacc tcctttctaw g 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

ctggaacacc tcctttctgg a 21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

aggcatccac cgtgcgccct 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

aggcattcac crtgcgccct 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

aggcatccrc catgcgccct 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

ggcatccacc gtgtacgct 19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

ttggatcacc tccttacctw a 21

Claims

1.一种分析在怀疑含有细菌的环境中的不同分类群组的微生物种群，如细菌种群的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供获自所述环境的DNA并且提供至少

i)第一引物组P1，其含有至少一个引物p1，p1针对于对选自门、纲、目或科的第一分类群组特异的至少一个保守位置L1；

ii)第二引物组P2，其含有至少一个引物p2，p2针对于对选自门、纲、目或科的第二分类群组特异的至少一个保守位置L2；

iii)第三引物组P3，其含有至少一个引物p3，p3针对于至少对属于第一分类群组的微生物特异的至少一个保守位置L3；

iv)第四引物组P4，其含有至少一个引物p4，p4针对于至少对于属于第二分类群组的微生物特异的至少一个保守位置L4，并且

其中引物组P1和P3适于扩增所述保守区域L1和L3之间的区域，并且其中引物组P2和P4适于扩增所述保守区域L2和L4之间的区域；

b)使用所述引物组进行扩增反应，因此产生具有可检测大小、数量和/或核苷酸序列的差异的片段；

c)检测所述差异。

2.根据权利要求1的方法，其中微生物种群含有细菌。

3.根据权利要求1-2的方法，其中第一和/或第二分类群组是门。

4.根据权利要求1-3的方法，其中所述引物组P3和所述引物组P4相同。

5.用于检测存在于环境中的微生物种群变化的方法，包括下列步骤：

a)在第一时间点t0在获自所述环境的DNA上操作根据前述权利要求任意所述的方法；

b)在第二时间点t1在获自所述环境的DNA上操作根据前述权利要求任意所述的方法；和

c)比较在步骤a和b获得的结果。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于比较在门、纲、目、科、属或种的水平，优选在门的水平进行。

7.根据前述权利要求任意所述的方法，其特征在于引物组P1由一个引物组成和/或引物组P2由一个引物组成。

8.根据前述权利要求任意所述的方法，其特征在于引物组P3和/或P4由至少两个，优选至少三个不同的引物组成。

9.根据前述权利要求任意所述的方法，其特征在于DNA来自选自存在于人类、植物、动物、水、食物或土壤的微生物环境的环境，更优选来自胃肠道、皮肤、肺、唾液、结肠、口、腹水、排泄物、溃疡、脓、牙窝、伤口液体、创伤、血或心血管系统的微生物环境。

10.根据前述权利要求任意所述的方法，其中所述第一和第二引物组P1和P2被标记并且含有选自荧光标记，优选FAM、TET、HEX、Cy 5、Cy 5.5、Cy 3、Cy 3.5、Cy 7、四甲基罗丹明、ROX、JOE、FITC、TRITC、放射性标记，优选3H、14C、32P或33P、35S的标记。

11.根据权利要求10的方法，其中引物组P1的标记与引物组P2的标记不同。

12.根据前述权利要求任意所述的方法，其特征在于当第一或第二分类群组是门时，该门选自硬壁菌门firmicutes、梭杆菌门fusobacterium、脱铁杆菌门deferribacteres、螺旋体门spirochaetes、蓝细菌门cyanobacteria、乳杆菌门acidobacteria、硝酸刺菌门nitrospina、消化螺旋菌门nitrospirae、暖发菌门caldithrix、卤素厌氧细菌门haloanaerobiales，疣微菌门verrucomicrobia、衣原体chlamydiae、浮霉菌门planctomycetes、芽单胞菌门gemmimonas、纤维杆菌门fibrobacteres、绿菌门chlorobi、拟杆菌门bacteroidetes、变性菌门proteobacteria、热孢菌门thermotogae、嗜热粪杆菌门corprothermobacter、联合菌门synergites、热脱硫杆菌门thermodesulfobacteria、脱硫杆菌门desulfurobacterium、产水菌门aquificae、异常球菌-栖热菌门deinococcus-thermus、绿弯菌门chloroflexi或放线菌门actinobacteria。

13.根据前述权利要求任意所述的方法，其特征在于通过提供下列物质设计成对的引物组P1-P3和/或成对的引物组P2-P4：

a)含有至少一个引物A和引物B的第一对引物组P1-P3，其中

ii)所述引物B是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，并且其中引物A和引物B之间的区域是属于第一分类群组的微生物中的10-5000个核苷酸；

b)含有至少引物C和引物D的第二对引物组P2-P4，其中

ii)所述引物D是含有至少3-50个，优选10-30个核苷酸的引物，并且其中引物C和引物D之间的区域是属于第二分类群组的微生物中的10-5000个核苷酸。

14.根据前述权利要求任意所述的方法，其中引物组P1或P2含有基本上由具有选自Seq ID No 1-2序列的DNA组成的引物。

15.根据前述权利要求任意所述的方法，其中引物组P3或引物组P4含有基本上由具有选自SEQ ID No 3-5序列的DNA组成的引物。

16.根据前述权利要求任意所述的方法，其中引物组P1或P2含有基本上由具有Seq ID No 6序列的DNA组成的引物。

17.根据前述权利要求任意所述的方法，其中引物组P3或引物组P4含有基本上由具有Seq ID No 7序列的DNA组成的引物。

18.根据前述权利要求任意所述的方法，其中保守位置L1、L2、L3或L4选自16S rDNA区、23S rDNA区、5S rDNA区、16S-23S中间区或5S-23S中间区中的保守区。

19.根据前述权利要求任意所述的方法，其中获得的片段至少含有大小的差别。

20.适合用于根据权利要求1-19任意所述的方法的引物或引物组。

21.基本上由具有选自SEQ ID No 1-7序列的DNA组成的引物。

22.适合用作在根据前述权利要求1-19任意所述的方法的一对引物组P1-P3或P2-P4的引物组的组合。

23.根据权利要求20的引物组的组合，其特征在于至少一个引物基本上由具有选自SEQ ID No 1-7序列的DNA组成。

24.含有适用于根据本发明的方法的至少一对引物组P1-P3和/或一对引物组P2-P4的试剂盒。

25.权利要求1-19任意所述的方法，权利要求20-24的引物或引物组，在研究外部因素对环境中微生物种群，优选细菌种群组成的效应中的用途，其中外部因素选自饮食、食物、药物、抗生素、温度、益生菌、污染物、杀虫剂或医学治疗。