JP5763919B2 - 微生物集団の分析方法 - Google Patents
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Description
a.上記環境から取得されるDNAと、それに加えて少なくとも
i.門、綱、目又は科から成る群から選択される第1の分類群に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L1を対象とする少なくとも1つのプライマーp1を含む第1のプライマーセットP1と、
ii.門、綱、目又は科から成る群から選択される第2の分類群に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L2を対象とする少なくとも1つのプライマーp2を含む第2のプライマーセットP2と、
iii.少なくとも第1の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L3を対象とする少なくとも1つのプライマーp3を含む第3のプライマーセットP3と、
iv.少なくとも第2の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L4を対象とする少なくとも1つのプライマーp4を含む第4のプライマーセットP4と、
を用意する工程であって、
プライマーセットP1及びプライマーセットP3は上記保存領域L1と上記保存領域L3との間の領域を増幅するのに適切であり、プライマーセットP2及びプライマーセットP4は該保存領域L2と該保存領域L4との間の領域を増幅するのに適切である、用意する工程と、
b.上記プライマーセットを使用して増幅反応を行う工程であって、それにより大きさ、数、ヌクレオチド配列及び/又は標識において検出可能な差異を有する断片を生成する、増幅反応を行う工程と、
c.上記差異を検出する工程と、
を含む、方法が、上述の問題の少なくとも1つを解決することが見出された。
a.第1の時点t0で該環境から取得したDNAに対して本発明による方法を行う工程と、
b.第2の時点t1で該環境から取得したDNAに対して本発明による方法を行う工程と、
c.工程a及び工程bにより取得した結果を比較する工程と、
を含む、方法が提供される。
a)少なくともプライマーA及びプライマーBを含む第1のプライマーセット対P1−P3であって、
i)該プライマーAは少なくとも3個〜50個、好ましくは10個〜30個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーは第1の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ii)該プライマーBは少なくとも3個〜50個、好ましくは10個〜30個のヌクレオチドを含むプライマーであり、プライマーAとプライマーBとの間の領域は、第1の分類群に属する微生物における10個〜5000個のヌクレオチドである、第1のプライマーセット対P1−P3と、
b)少なくともプライマーC及びプライマーDを含む第2のプライマーセット対P2−P4であって、
i)該プライマーCは少なくとも3個〜50個、好ましくは10個〜30個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーは第2の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ii)該プライマーDは少なくとも3個〜50個、好ましくは10個〜30個のヌクレオチドを含むプライマーであり、プライマーCとプライマーDとの間の領域は、第2の分類群に属する微生物における10個〜5000個のヌクレオチドである、第2のプライマーセット対P2−P4と、
を用意することにより設計されることを特徴とする、本発明による方法が提供される。第1の分類群及び第2の分類群がお互いに異なることは明らかである。
試料
ヒト胃腸管:
ヒトの腸由来の生検試料を、大腸鏡検査の間に取得した(試料は、小腸を含む腸の他の部分の生検によって、同様に取得され得る)。取得した試料を25mg未満に秤量し、0.9%のNaClで直ぐに洗浄し、液体窒素中で凍結し、使用するまで−80℃で保存した。
DNAの単離
取得した試料からDNAを単離するために、取得した試料をまず溶解させる。このためにQIAGENのQIAamp DNA Mini Kitを使用するが、当業者は他の溶解プロトコルが利用可能であることを理解するだろう。
プライマー
工程2で取得した約10μL〜100μLのDNAを、本発明による分析のために使用した。
これらは、以下である。
7分94℃:
30秒94℃、45秒56℃、1分72℃を35回:
5分72℃
断片分析
PCRの後、取得した断片を、Applied BiosystemsのABI Prism 3130xl Genetic Analyzerと、Genescan Analysisソフトウェア(Applied Biosystems)と、ソフトウェアパッケージBioNumerics 4.61(Applied Maths)とを使用して分析した。
本発明による方法の典型的な実施の結果
以下の図1に示す結果を、上述のヒト腸から取得した5つの生検試料から取得した。
図2では、上述の本発明による方法が、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis:ファーミキューテスに属する)とバクテロイデス・フラジリス(バクテロイデス門に属する)とのいわゆる混合培養液に対して適用される。図から理解されるように、本方法は2つの異なる細菌の間の識別を可能とするが、取得した「フィンガープリント」を微生物集団(例えば、細菌集団)のフィンガープリントと比較することにより、現在、より重要な上記データを容易に使用することができ、かかる細菌に対する特異的なプライマーの必要なく、微生物集団(例えば、細菌集団)中に存在するかかる微生物(例えば、細菌)の容易且つ直接的な同定を可能とする。
或る実験を、「フィンガープリント」、すなわち大腸中の異なる位置から採取した細菌集団の複雑な組成を研究するために行った。加えて糞便を、本発明による方法で分析した。
フィンガープリント、すなわち例えば糞便中に存在する試料中に存在する微生物の組成を(詳細に及び事前にその微生物を実際に知る必要なく)研究及び決定するための本発明による方法の適切性のさらなる評価を行った。その実験の目標は、微生物群ゲノムの組成の変動(例えば、食事、薬物、アルコール等の外的因子により誘発される)を検出することができるかどうかを確定させることであった。
消化管の微生物群ゲノムの発達、及び抗生物質の介入の効果
5人の新生児の群において、誕生後7日目、14日目及び30日目に糞便を回収した。乳児のうち1人(児童5)が、研究期間の大部分の間、抗生物質の投与を受けた。本発明による方法を使用して、プロファイル(フィンガープリント)を、全ての試料から生成した。プロファイルを分析し、上述のようにクラスター分析を行った。
皮膚の微生物群ゲノム
皮膚の微生物群ゲノムの分析に対する本発明による方法の適用可能性を評価するために、5人の被験者から耳介後部皮膚スワブを採取した。これらの5人の被験者のうち1人は、感染した皮膚病変を有していた。この病変からも、スワブを採取した。これらの皮膚スワブからDNAを上述のように単離し、プロファイルを本発明による方法で生成した。プロファイルの分析結果は、皮膚の微生物群ゲノムが被験者間で非常に類似することを示した。感染した皮膚病片から取得したプロファイルは、その被験者の耳介後部スワブ、及び他の全ての被験者と有意に異なっていた。このことから、本発明者らは、本発明による方法が皮膚上に見出される複雑な微生物群ゲノムの分析に適切であること、及び例えば皮膚の病変において見出されるこのプロファイルの変動の検出がこの方法を使用すると非常に簡単であることを結論する。
口腔の微生物群ゲノム
口腔の微生物群ゲノムの分析に対する本発明による方法の適用可能性を評価するために、5人の健康な被験者から口腔スワブを採取した。これらの5人の被験者のうち1人は、口腔粘膜のアフタ様潰瘍を有していた。この病変からも、スワブを採取した。これらの口腔スワブからDNAを上述のように単離し、プロファイルを生成した。プロファイルの分析結果は、口腔の微生物群ゲノムが、皮膚の微生物群ゲノムよりも被験者間でより変動しやすいが、腸の微生物群ゲノムよりもはるかに変動しにくいことを示した。アフタ様病片から取得したプロファイルは、その被験者の非潰瘍性粘膜から採取した口腔スワブと有意に異なっていた。このことから、本発明者らは、本発明による方法が口腔の微生物群ゲノムの分析に適切であること、及び例えばアフタ様病変において見出されるこのプロファイルの変動の検出がこの方法を使用すると非常に簡単であることを結論する。
Claims (26)
- 細菌を含むと思われる環境における異なる分類群の細菌集団等の微生物集団を分析する方法であって、該方法が、
a)前記環境から取得されたDNAと、それに加えて少なくとも
i)門、綱、目又は科から成る群から選択される第1の分類群に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L1を対象とする少なくとも1つのプライマーp1を含む第1のプライマーセットP1と、
ii)門、綱、目又は科から成る群から選択される第2の分類群に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L2を対象とする少なくとも1つのプライマーp2を含む第2のプライマーセットP2と、
iii)少なくとも前記第1の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L3を対象とする少なくとも1つのプライマーp3を含む第3のプライマーセットP3と、
iv)少なくとも前記第2の分類群に属する微生物に対して特異的な、少なくとも1つの保存位置L4を対象とする少なくとも1つのプライマーp4を含む第4のプライマーセットP4と、
を用意する工程と、
この工程において、前記プライマーセットP1及び前記プライマーセットP3が前記保存位置L1と前記保存位置L3との間の領域を増幅するのに適切であり、前記プライマーセットP2及び前記プライマーセットP4が該保存位置L2と該保存位置L4との間の領域を増幅するのに適切であり、
前記分類群は互いに異なる分類群であり、前記第1及び第2のプライマーセットP1及びP2は標識を付けられており、前記プライマーセットP1の標識は前記プライマーセットP2の標識と異なっており、
b)前記プライマーセットを使用して増幅反応を行う工程であって、それにより大きさにおいて検出可能な差異を有する断片を生成する、増幅反応を行う工程と、
c)前記差異を検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記微生物集団が細菌を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記第1の分類群及び/又は前記第2の分類群が門であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP3と前記プライマーセットP4とが同一であることを特徴とする方法。
- 環境中に存在する微生物集団の変化を検出する方法であって、
a)第1の時点t0で前記環境から取得したDNAに対して請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
b)第2の時点t1で前記環境から取得したDNAに対して請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
c)前記工程a)及び前記工程b)により取得した結果を比較する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項5に記載の方法において、前記比較を、門、綱、目、又は科のレベルで行い、前記比較の結果を参照することにより属、又は種に関する情報をも得られることを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記比較を、門のレベルで行うことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP1が1つのプライマーから成り、及び/又は前記プライマーセットP2が1つのプライマーから成ることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至8のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP3及び/又は前記プライマーセットP4が、少なくとも2つの異なるプライマーから成ることを特徴とする方法。
- 請求項9に記載の方法において、前記プライマーセットP3及び/又は前記プライマーセットP4が、少なくとも3つの異なるプライマーから成ることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至10のいずれか一項に記載の方法において、前記DNAが、ヒト、植物、動物、水、食品又は土壌に存在する微生物環境から成る群から選択される環境から得られることを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の方法において、前記DNAが、胃腸管、皮膚、肺、痰、大腸、口、腹水、糞便、膿瘍、化膿、歯周ポケット、創傷液、創傷、血液又は循環器系由来の微生物環境から得られることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至12のいずれか一項に記載の方法において、前記第1のプライマーセットP1及び前記第2のプライマーセットP2が、標識され、蛍光標識、及び放射性標識から選択される標識を含むことを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記蛍光標識はFAM(登録商標)、TET(登録商標)、HEX(登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy7(登録商標)、Tamra(登録商標)、ROX(登録商標)、JOE(登録商標)、FITC(登録商標)、TRITC(登録商標)から成る群から選択され、前記放射性標識は3H、14C、32P又は33P、35Sから成る群から選択されていることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至14のいずれか一項に記載の方法において、前記第1の分類群及び/又は前記第2の分類群が門であり、該門が、ファーミキューテス、フソバクテリウム、デフェリバクター、スピロヘータ、シアノバクテリア、アシドバクテリア、ニトロスピナ、ニトロスピラ、カルディスリクス、ハロアネロビアル、ベルコミクロビア、クラミジア、プランクトミセス、ジェミモナス、フィブロバクター、クロロビウム、バクテロイデス、プロテオバクテリア、サーモトーガ、コープロサーモバクター、シネルジテス、サーモデスルフォバクテリア、デスルフロバクテリウム、アクイフェックス、デイノコッカス−サーマス、クロロフレクサス及びアクチノバクテリアから成る門の群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至15のいずれか一項に記載の方法において、プライマーセット対P1−P3、及び/又はプライマーセット対P2−P4が、
a)少なくともプライマーA及びプライマーBを含む第1のプライマーセット対P1−P3であって、
i)前記プライマーAが少なくとも15個〜50個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーが第1の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ii)前記プライマーBが少なくとも15個〜50個のヌクレオチドを含むプライマーであり、前記プライマーAと該プライマーBとの間の領域が、前記第1の分類群に属する微生物における15個〜5000個のヌクレオチドである、第1のプライマーセット対P1−P3と、
b)少なくともプライマーC及びプライマーDを含む第2のプライマーセット対P2−P4であって、
i)前記プライマーCが少なくとも15個〜50個のヌクレオチドを含むプライマーであり、該プライマーが第2の分類群に対して特異的な保存位置を対象とし、
ii)前記プライマーDが少なくとも15個〜50個のヌクレオチドを含むプライマーであり、前記プライマーCと該プライマーDとの間の領域が、前記第2の分類群に属する微生物における15個〜5000個のヌクレオチドである、第2のプライマーセット対P2−P4と、
を用意することにより設計されることを特徴とする方法。 - 請求項1乃至16のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP1又は前記プライマーセットP2が、配列番号1及び2から成る群から選択される配列を有するDNAから成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至17のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP3又は前記プライマーセットP4が、配列番号3〜5から成る群から選択される配列を有するDNAから成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至18のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP1又は前記プライマーセットP2が、配列番号6の配列を有するDNAから成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至19のいずれか一項に記載の方法において、前記プライマーセットP3又は前記プライマーセットP4が、配列番号7の配列を有するDNAから成るプライマーを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至20のいずれか一項に記載の方法において、前記保存位置L1、前記保存位置L2、前記保存位置L3又は前記保存位置L4が、16S rDNA領域、23S rDNA領域、5S rDNA領域、16S−23S中間領域及び5S−23S中間領域における保存領域から成る群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至21のいずれか一項に記載の方法に使用されるキットであって、請求項1乃至21のいずれか一項に記載の方法に使用されるプライマーセット対P1−P3及び/又はプライマーセット対P2−P4を含むことを特徴とするキット。
- 環境中における微生物集団の組成に対する外的因子の効果を研究するための
請求項1乃至21のいずれか一項に記載の方法の使用であって、該外的因子は食事、食品、薬剤、抗生物質、温度、プロバイオティクス、汚染物質、殺虫剤及びは薬物治療から成る群から選択されることを特徴とする使用方法。 - 請求項23に記載の使用方法において、前記使用は、環境中における細菌集団の組成に対する外的因子の効果を研究するために行われることを特徴とする使用方法。
- 環境中における微生物集団の組成に対する外的因子の効果を研究するための、
請求項22に記載のキットを使用する方法であって、該外的因子は食事、食品、薬剤、抗生物質、温度、プロバイオティクス、汚染物質、殺虫剤及び薬物治療から成る群から選択されることを特徴とする使用方法。 - 請求項25に記載の使用方法において、前記使用は、環境中における細菌集団の組成に対する外的因子の効果を研究するために行われることを特徴とする使用方法。
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