CN106916889A - 快速检测唾液dna中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用 - Google Patents

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CN106916889A CN201710083713.2A CN201710083713A CN106916889A CN 106916889 A CN106916889 A CN 106916889A CN 201710083713 A CN201710083713 A CN 201710083713A CN 106916889 A CN106916889 A CN 106916889A
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Abstract

本发明公开了一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用。所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂包含第一引物和第二引物。所述检测方法包括：提供所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂或试剂盒；将待检测的唾液DNA样品，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。本发明所用试剂配置来源简单，操作简便耗时短，成本低廉，无需专门技术培训及特殊仪器设备，可有效检测唾液DNA中微生物污染程度，有效保证二代测序靶向捕获技术应用于医学检验的可靠性，并大大降低因唾液DNA样本被微生物污染导致的后续实验失败带来的实验风险和成本风险，为唾液DNA用于下游分子生物学检测保驾护航。

Description

快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用。
背景技术
2013年5月,有6个孩子的好莱坞女星兼导演安吉丽娜·朱莉证实,通过基因检测得知,自己遗传携带了乳腺癌易感基因BRCA1,使得她患乳腺癌几率高达87％,患卵巢癌几率50％,同时她的母亲和姨妈先后因乳腺癌不幸去世。因此,朱莉分别于2014年4月和2015年3月主动接受了双乳和卵巢的切除手术,尽可能降低患癌风险。
随着分子遗传学的发展,根据诺贝尔奖获得者麦克黑尔和哈罗德的研究发现:所有肿瘤的根本机制都是基因序列的损坏,即肿瘤是一种基因病,其主要致病因素包括先天性的家族遗传及后天的基因突变。其中,先天性的致病基因具有家族聚集性,有害突变基因遗传给后代的概率为50％,且遗传到有害变异基因的人群,患癌风险将极大升高。
自2005年起,基因检测技术在肿瘤诊断领域的应用正在逐步扭转美国肿瘤患者的生存局面。今天,美国已有超过500万人做了基因检测，使得一些重大慢性病治愈率大幅提高，如家族型肠癌的发病率降低了90％，死亡率降低了70％；英国超过200万人做了基因检测，目前基因检测已成为该国人身保险必选项目。在进行基因检测时，外周血是最优秀的样本来源，但是外周血采样必须使用专用采血管，并且运输上也较为困难。随着科研人员的不断研究发现，唾液样本中有大量活细胞，状态稳定，便于运输，并且唾液样本较外周血而言采样简单，无需专业人员就可以进行样本采集。然而，唾液样本的最大问题在于口腔微生物也存在于唾液中，在进行DNA提取时，微生物DNA也会掺杂到唾液DNA中，从而影响后续医学检验分析结果，甚至会导致结果不可用。
因此，如何在医学检验分析前检测并评估唾液DNA中微生物的污染状态，成为了业界目前最急需解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，其包含具有SEQID NO：1所示序列的第一引物和具有SEQ ID NO：2所示序列的第二引物。
在一些较为具体的实施方案中，所述试剂包括浓度为0.5uM～5uM的第一引物、浓度为0.5uM～5uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.0～9.0。
在一些更为具体的实施方案中，所述试剂包括浓度为1uM的第一引物、浓度为1uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.5。
本发明实施例还提供了一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂盒，其包括前述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂。
在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物和超纯水。
在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照物和阳性对照物。
本发明实施例还提供了一种唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其包括：
提供所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂或所述的试剂盒；
将待检测的唾液DNA样品，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。
优选的，所述待检测唾液DNA样品与快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的体积比为1uL～5uL:15uL～25uL。
在一些较为具体的实施方案中，所述PCR扩增的条件包括：
预扩增，包括：在90℃～100℃温度条件下反应1min～5min；
PCR循环，包括：
首先进行10～30个循环，每个循环包括：依次在90℃～100℃下保温10s-50s，50℃～72℃下保温10s～50s，65℃～85℃下保温10s～50s；
其后，依次在65℃～85℃下保温1min～5min，4℃保存。
更为优选的，所述PCR循环包括：
首先进行20个循环，每个循环包括：依次在95℃下保温30s，55℃下保温30s，72℃下保温30s；
其后，在72℃下保温5min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明提供的一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，可有效检测唾液DNA中微生物污染程度，有效保证二代测序靶向捕获技术应用于医学检验的可靠性，并大大降低因唾液DNA样本被微生物污染导致的后续实验失败带来的实验风险和成本风险，为唾液DNA用于下游分子生物学检测保驾护航。
(2)本发明提供的一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，原料简单易得，成本低廉，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备。
(2)本发明提供的一种唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，操作方便，通过设计一对特异性靶向富集微生物序列的探针，再通过PCR对产物进行半定量，同时通过比对阳性及阴性对照来判断微生物的含量，可有效检测唾液DNA中微生物污染程度。
附图说明
图1是本发明实施例1-4中不同平台下对3份样本进行微生物污染检测的结果对比示意图。
具体实施方式
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：
采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
本发明实施例提供了一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，其包含具有SEQID NO：1所示序列的第一引物和具有SEQ ID NO：2所示序列的第二引物。
在一些较为具体的实施方案中，所述试剂包括浓度为0.5uM～5uM的第一引物、浓度为0.5uM～5uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.0～9.0。
在一些更为具体的实施方案中，所述试剂包括浓度为1uM的第一引物、浓度为1uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.5。
本发明实施例还提供了一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂盒，其包括前述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂。
在一些较为具体的实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物和超纯水。
在一些实施方案之中，所述试剂盒包含：PCR扩增检测的常规组件(2x KAPA HiFiHotStart ReadyMix)5uL～15uL，0.5uM～5uM第一引物(Oligo 1)1uL～10uL，0.5uM-5uM第二引物(Oligo 2)1uL～10uL。
优选的，所述试剂盒包括：2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5uL，1uM Oligo1 5uL，1uM Oligo 2 5uL。
本发明实施例还提供了一种唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其包括：
提供所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂或所述的试剂盒；
将待检测的唾液DNA样品，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。
优选的，所述待检测唾液DNA样品与快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的体积比为1uL～5uL:15uL～25uL。
在一些较为优选的实施方案之中，所述待检测唾液DNA样品的用量为2ng～10ng，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的用量为15uL～30uL。
更为优选的，所述待检测唾液DNA样品的用量为5ng，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的用量为22.5uL。
在一些实施方案之中，所述唾液DNA中微生物污染的快速检测方法还包括向待检测唾液DNA样品与快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂形成的混合液中加入阳性对照物和阴性对照物。
在一些较为优选的实施方案之中，所述阳性对照物为大肠杆菌DNA，所述阴性对照物为人基因组DNA，但并不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述PCR扩增的条件包括：
预扩增，包括：在90℃～100℃温度条件下反应1min～5min，优选为在95℃温度条件下反应3min；
PCR循环，包括：
首先进行10～30个循环，每个循环包括：依次在90℃～100℃下保温10s-50s，50℃～72℃下保温10s～50s，65℃～85℃下保温10s～50s；
其后，依次在65℃～85℃下保温1min～5min，4℃保存。
更为优选的，所述PCR循环包括：
首先进行20个循环，每个循环包括：依次在95℃下保温30s，55℃下保温30s，72℃下保温30s；
其后，在72℃下保温5min，4℃保存。
在一些实施方案之中，所述方法还包括：PCR扩增完成后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳。
计算微生物污染程度的算法为：
将电泳完毕的琼脂糖凝胶放入凝胶成像仪中，调整焦距至清晰后，拍照检查PCR效果，并使用成像仪分别测定待检测唾液DNA、阳性对照物在产物位置的光密度，通过计算待检测唾液DNA与阳性对照物的光密度关系，计算微生物污染程度。
更具体的，检查PCR效果的方法为：检查阴性对照是否有产物。若有产物，本次PCR实验失败，需重新进行PCR实验。并使用成像仪测定待检测唾液DNA、阳性对照物在产物位置的光密度，通过计算二者的光密度关系，进行微生物污染程度评价。
进一步的，所述待检测唾液DNA、阳性对照物的产物位置在520bp～550bp。
更为优选的，计算微生物污染程度的方法为：使用待检测唾液DNA的光密度除以阳性对照物的光密度，并以待检测唾液DNA的光密度与阳性对照物的光密度的比值为依据，该比值大于30％为污染；该比值小于等于30％但大于10％为有污染，用于下游分析；该比值小于等于10％为无污染。
其中，所述琼脂糖凝胶电泳无特别要求，普通琼脂糖凝胶电泳都适用本方法。
以下结合附图和若干实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
实施例1
1.试剂准备：
6×Loading Dye(Thermo)，100bp gene ruler(Thermo)，大肠杆菌DNA(Promega)，人基因组DNA(Agilent)；
试剂I：2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5uL，Oligo 1(1uM)5uL，Oligo 2(1uM)5uL。
2.检测用仪器：
PCR仪(LongGene)，六一电泳仪，凝胶成像仪(复日)。
3.实验操作过程：
(1)将3个待测样本，阳性对照大肠杆菌DNA，阴性对照人基因组DNA分别取5ng；
(2)取1个1.5ml EP管，EP管上标记试剂I混合液；
(3)试剂I混合液准备(本实验中N＝5)：
(4)反应体系：
(5)向0.2mL PCR管中按照样本分别加入25μl PCR反应液；
(6)将样本放入微型式离心机，设置1000×g，离心30s；
(7)离心完成后将PCR管放进PCR仪中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：
设置完成后，进行PCR。
(8)PCR完成后，向产物中加入5uL 6×Loading Dye，并全部点入1.5％琼脂糖凝胶中，100V电泳90min。
(9)电泳完成后，将电泳胶放入凝胶成像仪中，检查产物是否在520bp左右，并且保证阴性样本无产物，拍照并通过成像仪自带软件分析待测产物和阳性对照的光密度，将待测产物光密度除以阳性对照光密度并换算百分比，百分比>30％视为污染；10％<百分比≤30％视为有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％视为无污染。
4.实验结果：
样本 光密度(IOD) 百分比(％)
1 13 6％
2 116 52％
3 68 30％
阳性对照 223 100％
5.实验结论：
样本1无污染，样本2污染严重，样本3有污染，但仍可用于下游分析。
实施例2
1.试剂准备：
6×Loading Dye(Thermo)，100bp gene ruler(Thermo)，大肠杆菌DNA(Promega)，人基因组DNA(Agilent)；
试剂I：2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5uL，Oligo 1(1uM)5uL，Oligo 2(1uM)5uL。
2.检测用仪器：
PCR仪(Mycycler,Biorad)，六一电泳仪，凝胶成像仪(依科赛)。
3.实验操作过程：
(1)将3个待测样本，阳性对照大肠杆菌DNA，阴性对照人基因组DNA分别取5ng；
(2)取1个1.5ml EP管，EP管上标记试剂I混合液；
(3)试剂I混合液准备(本实验中N＝5)：
(4)反应体系：
(5)向0.2mL PCR管中按照样本分别加入25μl PCR反应液；
(6)将样本放入微型式离心机，设置1000×g，离心30s；
(7)离心完成后将PCR管放进PCR仪中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：
设置完成后，进行PCR。
(8)PCR完成后，向产物中加入5uL 6×Loading Dye，并全部点入1.5％琼脂糖凝胶中，100V电泳90min。
(9)电泳完成后，将电泳胶放入凝胶成像仪中，检查产物是否在520bp左右，并且保证阴性样本无产物，拍照并通过成像仪自带软件分析待测产物和阳性对照的光密度，将待测产物光密度除以阳性对照光密度并换算百分比，百分比>30％视为污染；10％<百分比≤30％视为有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％视为无污染。
4.实验结果：
样本 光密度(IOD) 百分比(％)
1 27 9％
2 158 55％
3 76 26％
阳性对照 289 100％
5.实验结论：
样本1无污染，样本2污染严重，样本3有污染，但仍可用于下游分析。
实施例3
1.试剂准备：
6×Loading Dye(Thermo)，100bp gene ruler(Thermo)，大肠杆菌DNA(Promega)，人基因组DNA(Agilent)；
试剂I：2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5uL，Oligo 1(1uM)5uL，Oligo 2(1uM)5uL。
2.检测用仪器：
PCR仪(S1000,BioRad)，BioRad电泳仪，凝胶成像仪(依科赛)。
3.实验操作过程：
(1)将3个待测样本，阳性对照大肠杆菌DNA，阴性对照人基因组DNA分别取5ng；
(2)取1个1.5ml EP管，EP管上标记试剂I混合液；
(3)试剂I混合液准备(本实验中N＝5)：
(4)反应体系：
(5)向0.2mL PCR管中按照样本分别加入25μl PCR反应液；
(6)将样本放入微型式离心机，设置1000×g，离心30s；
(7)离心完成后将PCR管放进PCR仪中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：
设置完成后，进行PCR。
(8)PCR完成后，向产物中加入5uL 6×Loading Dye，并全部点入1.5％琼脂糖凝胶中，100V电泳90min。
(9)电泳完成后，将电泳胶放入凝胶成像仪中，检查产物是否在520bp左右，并且保证阴性样本无产物，拍照并通过成像仪自带软件分析待测产物和阳性对照的光密度，将待测产物光密度除以阳性对照光密度并换算百分比，百分比>30％视为污染；10％<百分比≤30％视为有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％视为无污染。
4.实验结果：
样本 光密度(IOD) 百分比(％)
1 24 9％
2 155 56％
3 81 29％
阳性对照 277 100％
5.实验结论：
样本1无污染，样本2污染严重，样本3有污染，但仍可用于下游分析。
实施例4
1.试剂准备：
6×Loading Dye(Thermo)，100bp gene ruler(Thermo)，大肠杆菌DNA(Promega)，人基因组DNA(Agilent)；
试剂I：2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5uL，Oligo 1(1uM)5uL，Oligo 2(1uM)5uL。
2.检测用仪器：
PCR仪(S1000,BioRad)，BioRad电泳仪，凝胶成像仪(复日)。
3.实验操作过程：
(1)将3个待测样本，阳性对照大肠杆菌DNA，阴性对照人基因组DNA分别取5ng；
(2)取1个1.5ml EP管，EP管上标记试剂I混合液；
(3)试剂I混合液准备(本实验中N＝5)：
(4)反应体系：
(5)向0.2mL PCR管中按照样本分别加入25μl PCR反应液；
(6)将样本放入微型式离心机，设置1000×g，离心30s；
(7)离心完成后将PCR管放进PCR仪中，盖上仪器盖子，设置反应条件如下：
设置完成后，进行PCR。
(8)PCR完成后，向产物中加入5uL 6×Loading Dye，并全部点入1.5％琼脂糖凝胶中，100V电泳90min。
(9)电泳完成后，将电泳胶放入凝胶成像仪中，检查产物是否在520bp左右，并且保证阴性样本无产物，拍照并通过成像仪自带软件分析待测产物和阳性对照的光密度，将待测产物光密度除以阳性对照光密度并换算百分比，百分比>30％视为污染；10％<百分比≤30％视为有污染，但仍可用于下游分析；百分比≤10％视为无污染。
4.实验结果：
样本 光密度(IOD) 百分比(％)
1 15 7％
2 108 53％
3 58 29％
阳性对照 203 100％
5.实验结论：
样本1无污染，样本2污染严重，样本3有污染，但仍可用于下游分析。
图1是实施例1-4中不同平台下对3份样本进行微生物污染检测的结果对比示意图。从以上实施例1-4和图1可以明显看到，本发明的一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂可以有效检测唾液DNA中的微生物污染状况，4个实施例分别在4套的检测仪器组下使用该方法对同3份样本进行了微生物污染检测，得到的结果高度一致。
综上所述，本发明的试剂可有效的检测唾液DNA中的微生物污染，不受检测平台的限制，同时本发明的试剂配制来源简单，操作简便，无需特殊人员培训，成本低廉。通过验证该方法可有效的检测唾液DNA中的微生物污染，大大减少因唾液DNA样本被微生物污染导致的后续实验失败带来的实验风险和成本风险，为唾液DNA用于下游分子生物学检测保驾护航。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110>苏州贝斯派生物科技有限公司
<120>快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂、试剂盒与其应用
<160> 2
<170> patentin version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 55

Claims (10)

1.一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，其特征在于包含具有SEQ ID NO：1所示序列的第一引物和具有SEQ ID NO：2所示序列的第二引物。
2.根据权利要求1所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，其特征在于包括浓度为0.5uM～5uM的第一引物、浓度为0.5uM～5uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
和/或，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.0～9.0。
3.根据权利要求2所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂，其特征在于包括浓度为1uM的第一引物、浓度为1uM的第二引物，其余部分包含超纯水；
和/或，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的pH值为8.5。
4.一种快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物和超纯水。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还包括阴性对照物和阳性对照物。
7.一种唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其特征在于包括：
提供权利要求1-3中任一项所述的快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂或权利要求4-6中任一项所述的试剂盒；
将待检测的唾液DNA样品，所述快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂以及PCR扩增检测的常规组件混合均匀，之后进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其特征在于，所述待检测唾液DNA样品与快速检测唾液DNA中微生物污染的试剂的体积比为1uL～5uL:15uL～25uL。
9.根据权利要求7所述的唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：
预扩增，包括：在90℃～100℃温度条件下反应1min～5min；
PCR循环，包括：
首先进行10～30个循环，每个循环包括：依次在90℃～100℃下保温10s-50s，50℃～72℃下保温10s～50s，65℃～85℃下保温10s～50s；
其后，依次在65℃～85℃下保温1min～5min，4℃保存。
10.根据权利要求9所述的唾液DNA中微生物污染的快速检测方法，其特征在于，所述PCR循环包括：
首先进行20个循环，每个循环包括：依次在95℃下保温30s，55℃下保温30s，72℃下保温30s；
其后，在72℃下保温5min，4℃保存。
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