JP7112125B2 - 細菌メタゲノム分析を通したリンパ腫の診断方法 - Google Patents
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Description
(a)正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からDNAを抽出する段階;(b)前記抽出したDNAに対して配列番号1および配列番号2のプライマーペアを利用してPCR(Polymerase Chain Reaction)を行う段階;および(c)前記PCR産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
(a)正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からDNAを抽出する段階;(b)前記抽出したDNAに対して配列番号1および配列番号2のプライマーペアを利用してPCRを行う段階;および(c)前記PCR(Polymerase Chain Reaction)産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
デイノコッキ(Deinococci)、クロロプラスト(Chloroplast)、およびベータプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)よりなる群から選ばれる1種以上の綱(class)細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス(Deinococcales)、リケッチアレス(Rickettsiales)、ストレプトフィタ(Streptophyta)、リゾビアレス(Rhizobiales)、オケアノスピリラレス(Oceanospirillales)、パステウレラレス(Pasteurellales)、およびナイセリアレス(Neisseriales)よりなる群から選ばれる1種以上の目(order)細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ(Erythrobacteraceae)、ロドスピリルラセエ(Rhodospirillaceae)、デイノコッカセエ(Deinococcaceae)、ノカルジオイダセエ(Nocardioidaceae)、オキサロバクテラセエ(Oxalobacteraceae)、ミトコンドリア(mitochondria)、ラクトバシルラセエ(Lactobacillaceae)、ルミノコッカセエ(Ruminococcaceae)、ハロモナダセエ(Halomonadaceae)、マイクロコッカセアエ(Micrococcaceae)、コリネバクテリアセエ(Corynebacteriaceae)、プロピオニバクテリアセエ(Propionibacteriaceae)、プレボテラセエ(Prevotellaceae)、ブルクホルデリアセエ(Burkholderiaceae)、アクチノミセタセエ(Actinomycetaceae)、ティシエレルラセエ(Tissierellaceae)、パステウレルラセエ(Pasteurellaceae)、カルノバクテリアセエ(Carnobacteriaceae)、ナイセリアセエ(Neisseriaceae)、およびアルカニボラクサセエ(Alcanivoracaceae)よりなる群から選ばれる1種以上の科(family)細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス(Cupriavidus)、デイノコッカス(Deinococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、ディアリスター(Dialister)、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、シトロバクター(Citrobacter)、マイクロコッカス(Micrococcus)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、アネロコッカス(Anaerococcus)、ポルフィロモナス(Porphyromonas)、プレボテラ(Prevotella)、ベイロネラ(Veillonella)、ロチア(Rothia)、アクチノマイセス(Actinomyces)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ペプトニフィラス(Peptoniphilus)、カプノサイトファガ(Capnocytophaga)、ラウトロピア(Lautropia)、グラニュリカテラ(Granulicatella)、フィネゴルディア(Finegoldia)、ナイセリア(Neisseria)、セレノモナス(Selenomonas)、およびアルカニボラックス(Alcanivorax)よりなる群から選ばれる1種以上の属(genus)細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較するものでありうる。
ベータプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)綱(class)細菌由来細胞外小胞、
オケアノスピリラレス(Oceanospirillales)、パステウレラレス(Pasteurellales)、およびナイセリアレス(Neisseriales)よりなる群から選ばれる1種以上の目(order)細菌由来細胞外小胞、
マイクロコッカセアエ(Micrococcaceae)、コリネバクテリアセエ(Corynebacteriaceae)、プロピオニバクテリアセエ(Propionibacteriaceae)、プレボテラセエ(Prevotellaceae)、ブルクホルデリアセエ(Burkholderiaceae)、アクチノミセタセエ(Actinomycetaceae)、ティシエレルラセエ(Tissierellaceae)、パステウレルラセエ(Pasteurellaceae)、カルノバクテリアセエ(Carnobacteriaceae)、ナイセリアセエ(Neisseriaceae)、およびアルカニボラクサセエ(Alcanivoracaceae)よりなる群から選ばれる1種以上の科(family)細菌由来細胞外小胞、または
マイクロコッカス(Micrococcus)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、アネロコッカス(Anaerococcus)、ポルフィロモナス(Porphyromonas)、プレボテラ(Prevotella)、ベイロネラ(Veillonella)、ロチア(Rothia)、アクチノマイセス(Actinomyces)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ペプトニフィラス(Peptoniphilus)、カプノサイトファガ(Capnocytophaga)、ラウトロピア(Lautropia)、グラニュリカテラ(Granulicatella)、フィネゴルディア(Finegoldia)、ナイセリア(Neisseria)、セレノモナス(Selenomonas)、およびアルカニボラックス(Alcanivorax)よりなる群から選ばれる1種以上の属(genus)細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合、リンパ腫と診断することができる。
シアノバクテリア(Cyanobacteria)、サーミ(Thermi)、およびユリアーキオータ(Euryarchaeota)よりなる群から選ばれる1種以上の門(phylum)細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ(Deinococci)およびクロロプラスト(Chloroplast)よりなる群から選ばれる1種以上の綱(class)細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス(Deinococcales)、リケッチアレス(Rickettsiales)、ストレプトフィタ(Streptophyta)、およびリゾビアレス(Rhizobiales)よりなる群から選ばれる1種以上の目(order)細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ(Erythrobacteraceae)、ロドスピリルラセエ(Rhodospirillaceae)、デイノコッカセエ(Deinococcaceae)、ノカルジオイダセエ(Nocardioidaceae)、オキサロバクテラセエ(Oxalobacteraceae)、ミトコンドリア(mitochondria)、ラクトバシルラセエ(Lactobacillaceae)、ルミノコッカセエ(Ruminococcaceae)、およびハロモナダセエ(Halomonadaceae)よりなる群から選ばれる1種以上の科(family)細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス(Cupriavidus)、デイノコッカス(Deinococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、ディアリスター(Dialister)、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、およびシトロバクター(Citrobacter)よりなる群から選ばれる1種以上の属(genus)細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、リンパ腫と診断することができる。
(b)前記抽出したDNAに対して配列番号1および配列番号2のプライマーペアを利用してPCRを行う段階;および
(c)前記PCR産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含むリンパ腫を診断するための情報提供方法を提供する。
実施例1.腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ50μgの用量で胃腸管で投与し、0分、5分、3時間、6時間、12時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図1aに示されたように、前記細菌(Bacteria)である場合には、全身的に吸収されないが、細菌由来小胞(EV)である場合には、投与後5分に全身的に吸収され、投与3時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与12時間まで体内に存在することが分かった。
血液に存在する小胞を分離し、DNAを抽出するために、まず、10mlチューブに血液を入れ、遠心分離(3,500×g、10min、4℃)を実施して浮遊物を沈めて上澄み液だけを回収した後、新しい10mlチューブに移した。0.22μmフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ(Centriprep centrifugal filters 50kD)に移し、1,500×g、4℃で15分間遠心分離して、50kDより小さい物質は捨て、10mlまで濃縮させた。再び0.22μmフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Type 90tiローターで150,000×g、4℃で3時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット(pellet)を生理食塩水(PBS)で溶かして小胞を収得した。
前記実施例2の方法で遺伝子を抽出した後、前記表1に示した16S rDNAプライマーを使用してPCRを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング(Illumina MiSeq sequencer)を行った。結果をStandard Flowgram Format(SFF)ファイルで出力し、GS FLX software(v2.9)を利用してSFFファイルをsequenceファイル(.fasta)とnucleotide quality scoreファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、window(20bps)平均base call accuracyが99%未満(Phred score<20)である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが300bps以上であるものだけを利用し(Sickle version 1.33)、結果分析のために、Operational Taxonomy Unit(OTU)は、UCLUSTとUSEARCHを利用してシークエンス類似度によりクラスタリングを行った。具体的に、属(genus)は94%、科(family)は90%、目(order)は85%、綱(class)は80%、門(phylum)は75%シークエンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各OTUの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、BLASTNとGreenGenesの16S DNAシークエンスデータベース(108,453シークエンス)を利用して97%以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した(QIIME)。
前記実施例3の方法で、リンパ腫患者63人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト53人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、t-testで二つの群間のp値が0.05以下であり、二つの群間に2倍以上違いが生じる菌株を選定した後、logistic regression analysis方法で診断的性能指標であるAUC(area under curve)、敏感度、および特異度を算出した。
Claims (4)
- 下記の段階を含む、リンパ腫の判定のための情報提供方法:
(a)正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からDNAを抽出する段階;
(b)前記抽出したDNAに対して配列番号1および配列番号2のプライマーペアを利用してPCR(polymerase chain reaction)を行う段階;および
(c)前記PCR産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含み、
前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液であり、
前記段階(c)で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
フィネゴルディア(Finegoldia)およびアルカニボラックス(Alcanivorax)属(genus)細菌由来小胞の含量が増加しており、
クロストリジウム(Clostridium)およびフィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)属(genus)細菌由来小胞の含量が減少している場合、リンパ腫と判定することを特徴とするリンパ腫の判定のための情報提供方法。 - 前記段階(c)で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
フィネゴルディア(Finegoldia)およびアルカニボラックス(Alcanivorax)属(genus)細菌由来小胞の含量が増加しており、
クロストリジウム(Clostridium)およびフィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)属(genus)細菌由来小胞の含量が減少しており;
ベータプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)綱(class)細菌由来細胞外小胞、
オケアノスピリラレス(Oceanospirillales)、パステウレラレス(Pasteurellales)、およびナイセリアレス(Neisseriales)よりなる群から選ばれる1種以上の目(order)細菌由来細胞外小胞、
マイクロコッカセアエ(Micrococcaceae)、コリネバクテリアセエ(Corynebacteriaceae)、プロピオニバクテリアセエ(Propionibacteriaceae)、プレボテラセエ(Prevotellaceae)、ブルクホルデリアセエ(Burkholderiaceae)、アクチノミセタセエ(Actinomycetaceae)、ティシエレルラセエ(Tissierellaceae)、パステウレルラセエ(Pasteurellaceae)、カルノバクテリアセエ(Carnobacteriaceae)、ナイセリアセエ(Neisseriaceae)、およびアルカニボラクサセエ(Alcanivoracaceae)よりなる群から選ばれる1種以上の科(family)細菌由来細胞外小胞、または
マイクロコッカス(Micrococcus)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、アネロコッカス(Anaerococcus)、ポルフィロモナス(Porphyromonas)、プレボテラ(Prevotella)、ベイロネラ(Veillonella)、ロチア(Rothia)、アクチノマイセス(Actinomyces)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ペプトニフィラス(Peptoniphilus)、カプノサイトファガ(Capnocytophaga)、ラウトロピア(Lautropia)、グラニュリカテラ(Granulicatella)、ナイセリア(Neisseria)、およびセレノモナス(Selenomonas)よりなる群から選ばれる1種以上の属(genus)細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合、
リンパ腫と判定することを特徴とする請求項1の記載のリンパ腫の判定のための情報提供方法。 - 前記段階(c)で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
フィネゴルディア(Finegoldia)およびアルカニボラックス(Alcanivorax)属(genus)細菌由来小胞の含量が増加しており、
クロストリジウム(Clostridium)およびフィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)属(genus)細菌由来小胞の含量が減少しており;
シアノバクテリア(Cyanobacteria)、サーミ(Thermi)、およびユリアーキオータ(Euryarchaeota)よりなる群から選ばれる1種以上の門(phylum)細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ(Deinococci)およびクロロプラスト(Chloroplast)よりなる群から選ばれる1種以上の綱(class)細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス(Deinococcales)、リケッチアレス(Rickettsiales)、ストレプトフィタ(Streptophyta)、およびリゾビアレス(Rhizobiales)よりなる群から選ばれる1種以上の目(order)細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ(Erythrobacteraceae)、ロドスピリルラセエ(Rhodospirillaceae)、デイノコッカセエ(Deinococcaceae)、ノカルジオイダセエ(Nocardioidaceae)、オキサロバクテラセエ(Oxalobacteraceae)、ラクトバシルラセエ(Lactobacillaceae)、ルミノコッカセエ(Ruminococcaceae)、およびハロモナダセエ(Halomonadaceae)よりなる群から選ばれる1種以上の科(family)細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス(Cupriavidus)、デイノコッカス(Deinococcus)、ディアリスター(Dialister)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、およびシトロバクター(Citrobacter)よりなる群から選ばれる1種以上の属(genus)細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、
リンパ腫と判定することを特徴とする請求項1に記載のリンパ腫の判定のための情報提供方法。 - 前記血液は、全血、血清、血しょう、または、血液単核球であることを特徴とする請求項1に記載のリンパ腫の判定のための情報提供方法。
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