WO2006059769A1 - 悪性リンパ腫の診断及び予後診断の方法 - Google Patents

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WO2006059769A1
WO2006059769A1 PCT/JP2005/022316 JP2005022316W WO2006059769A1 WO 2006059769 A1 WO2006059769 A1 WO 2006059769A1 JP 2005022316 W JP2005022316 W JP 2005022316W WO 2006059769 A1 WO2006059769 A1 WO 2006059769A1
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bim
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Masao Seto
Hiroyuki Tagawa
Yasuko Yoshida
Shigeki Kira
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Aichi Prefecture
Ngk Insulators, Ltd.
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosis and prognosis of malignant tumors, particularly malignant lymphoma, and more particularly to a method for diagnosis and prognosis of mantle cell lymphoma.
  • Mantle cell lymphoma is characterized by a translocation (11: 4) (ql3: q32) in the BCL1 gene that results in overexpression of CCDN1, and it is characterized by naive pre- germinal centers. center) Presumed to be derived from CD5 + cells (Seto et al., 1992;
  • genomic imbalances such as genomic gain / amplification such as 8q, ⁇ , 12q and 18q, and genomic loss / deletion such as lp, 6q, 8p, 9p, lq and 13q.
  • MCL mantle cell lymphoma
  • deletion of the BIM gene locus region was observed in 5 patient specimens, and deletion was observed in 5 out of 7 cell lines.
  • the common deletion region was examined in detail, and it was clarified that the responsible gene of the deletion region was the BIM gene. It was also clarified that the expression was strongly suppressed in response to the gene deletion.
  • the BIM gene is an antagonist of the BCL2 gene that has anti-apoptotic effects, and its deletion is caused by anti-apoptosis caused by the BCL2 gene in cells. Since it is envisaged to further enhance the cis function, it is assumed that it plays an important role in tumors and their pathologies.
  • BIM gene abnormalities are characteristic of MCL among B-cell malignant lymphomas, but BCL2 is expressed in many tumor cells. Solid tumors may also play an important role in tumorigenesis and pathogenesis.
  • the BIM gene can be an indicator of therapeutic response that is highly likely to function as a tumor suppressor gene in tumorigenesis and pathogenesis. In the future, important significance as a therapeutic target molecule may become clear.
  • a diagnostic method is provided.
  • the malignant tumor may be a malignant lymphoma.
  • a disease type determination step of determining a disease type of the malignant lymphoma based on the detection result of the detection step can be provided.
  • the disease type in this disease type determination step can be mantle cell lymphoma.
  • the detection step may include a detection step of detecting a deletion or mutation in the base sequence of human chromosome 2 ql3.
  • the detection step may be a step of detecting a region of human chromosome 2 q13 or a BIM gene defect.
  • a treatment responsiveness determining step of determining the therapeutic responsiveness of the malignant tumor based on the detection result in the detecting step can be provided. That is, when there is a deficiency in the region of human chromosome 2 q13 or the BIM gene, it can be diagnosed that the therapeutic response is low.
  • the detection step comprises the following steps: BAC RP11-438K19, 35027 bp force, 49920 bp, position 394 to position 597 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and base set forth in SEQ ID NO: 2. This may be a process of detecting a deletion or mutation in any of positions 214 to 417 in the sequence.
  • the detection step may be a step of using any one of BIM gene in the sample, mRNA and cDNA expressed from the BIM gene.
  • This detection step can include a step of performing a PCR method, an RT-PCR method, or a nucleic acid hybridization. Further, this detection step includes a step of hybridizing the probe and the nucleic acid sample obtained from the analyte on an array having one or more probes complementary to at least a part of the BIM gene. Can do.
  • the detection step is a step of performing an array CGH method.
  • the detection step may be a step of detecting the presence / absence, expression level, or mutation of the protein encoded by the BIM gene.
  • a marker for diagnosing malignant tumor which is a polynucleotide having a BIM gene, a part thereof, or a complementary nucleotide sequence thereto.
  • the diagnostic marker includes both a compound serving as a diagnostic index and a compound capable of detecting the compound by marking a compound serving as a diagnostic index.
  • a BIM gene can be a compound that serves as a diagnostic indicator
  • a polynucleotide having a complementary base sequence can be a compound that can mark the BIM gene.
  • This marker can have the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, which is the protein translation region of the BIM gene.
  • this marker is a polynucleotide having at least a part of positions 394 to 597 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or positions 214 to 417 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary base sequence thereto. It may be a nucleotide.
  • such polynucleotides may be used as probes or primers.
  • a marker for diagnosing malignant tumor which is a protein encoded by the BIM gene, a part thereof, or an antibody against them.
  • a diagnostic array for malignant tumors comprising human second dye
  • An array to which nucleic acid probes for detecting defects or mutations in the chromophore ql3 are immobilized is provided.
  • the probe can be a nucleic acid probe for detecting a deletion or mutation of the BIM gene. Further, the nucleic acid probe has at least a part of positions 394 to 597 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or positions 214 to 417 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary base sequence thereto. You may have.
  • a diagnostic kit for the diagnostic method comprising a nucleic acid probe for detecting a BIM gene deletion or mutation.
  • a diagnostic kit is provided.
  • the diagnostic kit may include a probe for detecting defects in various regions on the chromosome.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of mantle cell lymphoma which is a coding region of a BIM gene or a homologous protein having an activity of a protein encoded by the BIM gene.
  • a pharmaceutical composition containing a DNA construct having a region is provided.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of mantle cell lymphoma wherein a protein encoded by the BIM gene or a homologous protein having the activity of the protein encoded by the BIM gene is used.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • a prognostic diagnosis method for a patient with mantle cell lymphoma wherein the sample collected from the patient is used in human chromosome 6 ql6.2 to q27.
  • a method is provided for carrying out the steps of detecting a deletion or mutation, a deletion or mutation in human chromosome 8 pl2 to p23.2 and an amplification or mutation in human chromosome ql3.2 to q24.22.
  • the detection step includes a step of detecting the deletion or amplification by hybridization of a probe including a region on the chromosome and the nucleic acid sample of the patient collected from the patient. can do.
  • the probe can be a BAC clone and a Z or PAC clone.
  • the detection step can be performed on a solid support.
  • the detection step may be a step of performing an array CGH method.
  • the detection step may be a step of detecting c-MYC gene amplification, expression enhancement, or mutation.
  • the detection step may be a step of using either the c-MYC gene or the mRNA and cDNA expressed from the c-MYC gene in the specimen.
  • This detection step can include a step of performing PCR, RT-PCR, or nucleic acid hybridization.
  • this detection step hybridizes the probe and the nucleic acid sample obtained from the specimen on an array comprising one or more probes complementary to at least a part of the c-MYC gene. Steps may be included.
  • the detection step may be a step of detecting the presence / absence, expression level, or mutation of the protein encoded by the c-MYC gene.
  • an array for prognosis of mantle cell lymphoma comprising human chromosome 6 ql6.2-q27, human chromosome 8 pl2-p23.2 and human 8
  • An array is provided on which any of the probes for detecting chromosomes ql3.2 to q24.22 are immobilized.
  • the probe for detecting human chromosome 8 ql3.2 to q24.22 may be a probe capable of detecting c-MYC gene.
  • human chromosome 6 ql6.2 to q27, human chromosome 8 p12 to p23.2 and human chromosome 8 ql3.2 to q24.22 are detected.
  • a prognostic diagnosis of mantle cell lymphoma which is a polynucleotide such as a probe primer (set)
  • the polynucleotide may be a c-MYC gene or one of them.
  • a polynucleotide having a partial or complementary base sequence may be used.
  • a marker for prognosis of mantle cell lymphoma which is a protein encoded by the cMYC gene, a part thereof, or an antibody thereto.
  • a diagnostic kit for the prognosis method for mantle cell lymphoma wherein the diagnosis includes at least one prognosis marker for mantle cell lymphoma.
  • a kit is provided.
  • a pharmaceutical composition for treating mantle cell lymphoma comprising a nucleic acid construct that suppresses expression of cMYC gene.
  • FIG. 1 shows a typical genomic profile for individual tumor patients. The whole genome profile of a representative patient sample and (b) SP-53 cell line is shown! /. The Log2 ratio is plotted for all clones based on their location on the chromosome, with a vertical line indicating chromosome segregation. BAC and PAC are arranged from the left lp telomer to the right Xq telomer based on their genomic positions. (A) Copy number gain region: 5p, 7p21.3, 13q21.33, 17q21.31 to q24.3 and copy number loss region: 1 ⁇ 32, 2pl l .2, 2ql3, 8 ⁇ 12 to ⁇ 23.3, 8ql2. ql3.
  • FIG. 2 Shows the frequency of genome-wide copy number changes in 29 patients.
  • the clones were arranged in the order of chromosomes 1 to 22 and in each chromosome based on their anger Center mapping position, May 2004 version.
  • FIG. 3 shows genomic profiles on chromosome 2 of patient samples (G468) and three MCL cell lines (SP-53, Z-138 and Jeko-1). When the Log2 ratio is +0.2 or higher, the genome copy number gain is used. When the Log2 ratio is less than 0.2, the genome copy number loss is used. The physical distance (Mb) from 2q centromer is shown.
  • the vertical line indicates the largest defective site on chromosome 2 of BAC43 8K19 containing the BIM gene.
  • the Log2 ratio is -0.59 (G468), -2.75 (SP—53), —1.71 (Z—138) and —1.76 (jek o— 1), and homozygous at the BIM locus Suggests a sexual defect.
  • FIG. 4 Shows the minimal common region of homozygous deficiency and BIM gene expression in 2ql3.
  • A Schematic diagram of deletion patterns of BAC438K19, BIM gene exon and three cell lines (SP-53, Z-138 and Jeko-1). Gray box: Exon (BIM EL gene and BIM L gene open reading frame).
  • the open reading frame (597bp) of the BIM EL gene consists of three etasons, exon 1:75, 082—75, 475bp (394 bp) (including the start codon (ATG)), exon 2:49, 074—49, Contains 177 bp (104 bp) and exon 3:34, 990-35, 088 bp (99 bp) (including stop codon (TGA)), all on BAC438K19.
  • Black and white circles Probes used for Southern blots. Dotted line with white cycle: Homozygous defect (band negative). Black, thick line with circle: non-homozygous defect (band positive). Thin line: No homozygous defect has been confirmed.
  • Probe 1 bands human placenta (+), SP-53 (-), Gran ta519 (+), Z-138 (+), REC-1 (+), NCEB-l (+), Jeko-1 (one ) And JV M2 (+) o probe 4 bands: human placenta (+), SP-53 (—), Granta519 (+), Z—138 (—), REC— 1 (+), NCEB— l (+ ), Jeko— 1 (+ Z—) and JVM2 (+).
  • Probe 5-6 bands human placenta (+), SP-53 (—), Granta519 (+), Z—138 (—), 1 ⁇ : Ji 1 (+),? ⁇ 8—1 (+), 1 «) — 1 (+) and 1 ⁇ 2 (+).
  • control console is a typical control of probe 3 (TCR j8 probe) under the band of probe 6. A troll band is shown.
  • C Northern blot analysis of BIM gene of 7 MCL cell lines, B lymphoma (Karpas231) and Burkitt lymphoma (Raji) cell lines. Control with j8—ac tin.
  • FIG. 5 shows a Southern plot and FISH analysis result of a patient sample (G468).
  • B Two-color FISH analysis using probe A and probe B for G468.
  • Probe A BAC438K19
  • Probe B BAC368A17
  • Probe B is 1.55 Mb telomeric to probe A and BAC438K19 contains the BI M gene.
  • the interphase chromosomes had two pairs of red signals (probe B, red) and a pair of green signals (probe A, green), indicating a heterozygous loss for probe A.
  • FIG. 6 (a) shows the force-plan Meyer survival curve of mantle cell lymphoma with and without 6q21 deficiency, 8p23 amplification, and 8q24 amplification.
  • the horizontal axis represents the number of survival days, and the vertical axis represents the survival probability.
  • Figure 6 (b) shows the force-plan Meyer survival curve for mantle cell lymphoma with and without the lq22 and 9p22 defects.
  • the method for diagnosing malignant tumor of the present invention comprises human chromosome 1 p36.23 to p36.32, human chromosome 1 q42.2 to q43, human chromosome 2 pi 1.2, human chromosome 2 ql 3, Human chromosome 17 pi 1.2 to pl3.3 and rabbit chromosome 19 pi 3.2 to pl3.3, comprising a step of detecting defects or mutations in one or more selected species It is characterized by.
  • a patient sample of a malignant tumor is applied! When such a detection step is performed and a homozygous or heterozygous defect is found in the chromosomal region, it can be diagnosed as a malignant tumor.
  • MCL cell lines show a higher grade of malignancy than MCL case specimens. Therefore, detection of a deficiency or mutation in 2q13 is useful for diagnosing a malignant tumor, particularly a B-cell malignant lymphoma, such as MCL, which has a high grade of malignancy.
  • human chromosome 19 pi3.2 in human chromosome 19 pl3.2 it is preferable to detect the deletion or mutation of 1. This is because these areas are more frequent.
  • Various methods can be employed to detect defects or mutations in various regions on these chromosomes. For example, it can be detected by hybridization using a nucleic acid sample collected from a patient and a probe that hybridizes with various regions on these chromosomes. Nucleic acid samples of case strength can be obtained from patients' lymphoma specimens by standard DNA extraction methods. On the other hand, the probe should be one that hybridizes at least part of the region on the chromosome. As the DNA probe, a BAC clone and / or a PAC clone corresponding to the chromosomal region can be used. Examples of various regions and clones on these chromosomes are shown in Tables 1 and 2.
  • the form of the hybridization is not particularly limited. Even a liquid phase reaction may be a method using a solid phase carrier such as a bead or a substrate.
  • a DNA probe such as a clone immobilized on a solid phase carrier such as a chip can be used.
  • the solid phase carrier on which the DNA probe as described above is immobilized include a DNA array.
  • the immobilized form of the probe is not particularly limited, and includes an immobilized form by various bonds such as covalent bond and non-covalent bond such as Z or electrostatic and hydrophobic interaction.
  • an array used for array CGH can be used as an array to which such probes are fixed.
  • a solid phase carrier on which such a probe is immobilized is also provided.
  • the solid support is a flat substrate such as a slide glass, and the probe-immobilized support is a DNA microarray.
  • the responsible gene for deletion of 2ql3 has been identified as the BIM gene.
  • a BIM gene deficiency or mutation may be detected for detection of a 2ql3 deficiency or mutation.
  • a BIM gene deficiency or mutation can be detected not only by the BIM gene deficiency in the sample itself but also by the level of expression of the BIM gene.
  • the expression level of the BIM gene in the specimen sample is small compared to the sample of a healthy subject, it can be diagnosed as a malignant tumor type with high malignancy such as MCL. .
  • the case where the expression level of the BIM gene in the specimen sample is small compared to the sample of a healthy person is, for example, preferably 60% or less of the expression level of a healthy person, more preferably 50% or less. More preferably, it is 20% or less, more preferably 10% or less.
  • the detection of a defect or mutation in the BIM gene can use any of BIM gene, mRNA expressed from the BIM gene, and cDNA expressed in a specimen sample.
  • These nucleic acid materials can be obtained by known nucleic acid sample acquisition or amplification methods such as PCR and RT-PCR. Primers used in the PCR method that can amplify the BIM gene or a part thereof can be designed based on the sequence of the BIM gene.
  • the protein translation region of the BIM gene is the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 394 to 597 and position 214 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base length of the primer is preferably 15-40 bases, desirably 15-30 bases. However, when performing LA (long accurate) PCR, it is preferable to use at least 30 bases. It is preferable to select a base sequence so that the sense strand and the antisense strand are not annealed with each other, and the formation of a hairpin-like structure can be avoided.
  • the detection or deletion of the BIM gene using these nucleic acid samples can be performed by quantitative PCR such as ReaKTime PCR using an appropriate primer capable of amplifying the BIM gene.
  • deletion or mutation of the BIM gene is a process that specifically hybridizes to the BIM gene. It is preferable to use a hybridization using a lobe.
  • a probe complementary to at least a part of the BIM gene can be used. The probe need not be completely complementary to the gene as long as it specifically hybridizes to the nucleic acid sample from the BIM gene.
  • Such a slightly mutated polynucleotide is a site-specific mutation (Current protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., 1987), John Wiley & Sons, 8.1—8–3 Hayano, PCR (Current protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.
  • the probe hybridizes with a nucleic acid sample derived from the BIM gene under stringent conditions.
  • the stringent condition is a condition that enables selective and detectable specific binding between the probe and the nucleic acid sample.
  • Stringent conditions are defined by salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is decreased, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • stringent salt concentrations are typically about 750 mM or less NaCl and about 75 mM or less trisodium citrate, more preferably about 500 mM or less NaC1 and about 50 mM or less trisodium citrate, most preferably about 250 mM or less NaCl. It is less than about 25 mM trisodium acid.
  • the stringent organic solvent concentration is about 35% or more of formamide, most preferably about 50% or more.
  • Stringent temperature conditions are about 30 ° C or higher, more preferably about 37 ° C or higher, and most preferably about 42 ° C or higher. Other conditions include hybridization time, detergent concentration (eg, SDS), and presence / absence of carrier DNA. By combining these conditions, various stringencies are set.
  • hybridization conditions described above are merely examples, and those skilled in the art will consider conditions such as the nucleotide sequence, concentration and length of the probe, reaction time, reaction temperature, and reagent concentration. Appropriate nobbreviation conditions can be set.
  • the probe may be appropriately labeled as necessary.
  • labeling it is preferable to use the force non-RI method which can be performed by radioisotope (RI) method or non-RI method. Yes.
  • the non-RI method include a fluorescent labeling method, a piotine labeling method, a chemiluminescence method, and the like.
  • the BIM gene In order to detect a deletion or mutation of the BIM gene, for example, it can be analyzed using in situ neutralization, Northern blot, dot blot, DNA array, or the like.
  • the form of hybridization in such a method is not particularly limited.
  • a liquid phase reaction or a method using a solid support such as a bead or a substrate may be used.
  • a detection method using hybridization preferably, a DNA probe immobilized on a solid phase carrier such as a chip or a bead can be used.
  • the solid phase carrier on which the DNA probe is immobilized include a DNA array (DNA chip).
  • the probe immobilization form is not particularly limited, and includes immobilization forms of various types of covalent bonds and Z or non-covalent bonds such as electrostatic and hydrophobic interactions. It may be fixed on a solid phase carrier.
  • deletion or mutation in 2ql3 is detected by BAC RP11-438K19, 35027bp force, 49920bp, ⁇ ⁇ IJ No.1, positions 394 to 597 and ⁇ ⁇ ⁇ It can also be carried out as a step of detecting a deletion or mutation at positions 214 to 417 of the base sequence described in No. 2. That is, these regions are DNA regions that are deficient in cell lines in which 2ql3 deficiency and decreased BIM gene expression are observed in the MCL cell line in the Northern blot (see Examples).
  • the base sequence in the predetermined range in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is a part of the coding region of BIM protein.
  • a marker for diagnosing malignant tumor having a region on various chromosomes such as 2ql3, a BIM gene, a part thereof, or a complementary base sequence thereto.
  • a marker is preferably a nucleic acid molecule such as a polynucleotide capable of detecting these various regions and defects or mutations of the BIM gene.
  • nucleic acid molecules are examples include polynucleotides having various chromosome regions or parts thereof or nucleotide sequences complementary to these, BIM genes or parts thereof or polynucleotides having nucleotide sequences complementary to these.
  • the polynucleotide is preferably DNA.
  • nucleic acid molecules such as probes and primers having a nucleotide sequence complementary to a region on various chromosomes or a part thereof or a BIM gene or a part thereof can be preferably used as a diagnostic reagent.
  • a probe or a DNA microarray on which the probe is immobilized is also provided.
  • a diagnostic kit comprising such a primer set is also provided.
  • a BIM gene deficiency or mutation may be detected by detecting the presence or absence, expression level or mutation of the protein encoded by the BIM gene.
  • an antibody specific for such a protein can be used.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used. It may be an antibody molecule or a part thereof.
  • serum can be obtained after immunizing an animal using a protein or a partial fragment thereof as an immunogen.
  • the above eukaryotic expression vector can be prepared by introducing serum into a muscle or skin of an animal by injection or gene gun and then collecting the serum.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by known monoclonal antibody production methods (“monoclonal antibodies”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic Press. , 1996).
  • the antibody may be appropriately labeled with a labeling substance!
  • a labeling substance an enzyme, a radioisotope or a fluorescent dye can be used.
  • the enzyme include, but are not limited to, enzymes used in normal EIA, such as peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, Malate dehydrogenase or the like can also be used.
  • an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used. Binding of these enzymes and antibodies can be performed by a known method using a cross-linking agent such as maleimide compound.
  • a known substance can be used depending on the type of enzyme used.
  • fluorescence As the dye, those used in the usual fluorescent antibody method such as fluorescens isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
  • FITC fluorescens isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • immunostaining such as tissue or cell staining, competitive or noncompetitive radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (Various detection methods such as FIA), luminescent immunoassay (LIA), enzyme immunoassay (EIA, ELI SA) can be used.
  • the antigen-antibody reaction in such a measurement method may be performed in a liquid phase or a solid phase.
  • the antigen-antibody reaction product is preferably separated.
  • a solid support such as a chromatography, a bead or a plate may be used. Western blotting techniques may also be used.
  • ELISA method etc. can be used.
  • a marker for diagnosis of a malignant tumor comprising BIM protein or a part thereof or an antibody against them.
  • antibodies are preferred as detection reagents for detecting such proteins.
  • a kit for diagnosing a malignant tumor containing such an antibody is provided.
  • the diagnostic kit of the present invention may contain an antibody or a labeled antibody in the liquid phase, or may be one in which the antibody or the labeled antibody is bound to a solid phase carrier. It may also contain an immobilized antigen or part thereof.
  • the diagnostic kit may contain the substrate.
  • a washing solution for washing away non-bound molecules from the solid phase may be contained.
  • it can contain components that can generally be included in diagnostic kits containing antibodies.
  • the pharmaceutical composition for treating MCL of the present invention comprises a DNA construct having a coding region of a BIM gene or a homologous protein coding region having the activity of a protein encoded by the BIM gene. It is. According to the present inventors, the malignancy of malignant tumors has increased due to the lack of the BIM gene. Therefore, suppression of MCL progression is expected by supplementing BIM protein in MCL patients.
  • the BIM gene is expressed by introducing the DNA construct into a patient using a vector or the like. It is preferable. Therefore, the vector can be used as a pharmaceutical composition by retaining the coding region in a known vector. Furthermore, by producing cells that can express the coding region by such vectors or by other transfection methods, these cells can be used as a pharmaceutical composition.
  • a protein encoded by the BIM gene or the like can be used as it is as a pharmaceutical composition.
  • the formulation and administration of such a pharmaceutical composition can be produced by those skilled in the art by selecting an appropriate dosage form and selecting a dose as appropriate.
  • the pharmaceutical composition can directly introduce the DNA using a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a ribosome.
  • the target DNA or the like can be administered to a patient using these methods by ex vivo method or in vivo method.
  • the sample collected from the patient force is a defect in human chromosome 6 ql6.2 to q27, a defect in human chromosome 8 pl2 to p23.2 and a human.
  • Chromosome 8 ql3.2.2 to q24.22 has a step of detecting any of the amplifications. Then, any of the following determination steps (a) to (c) can be performed.
  • This method may comprise a step of detecting the deletion or amplification by hybridization of a probe including a region on the chromosome and a nucleic acid sample of the patient collected from the patient.
  • probes can be BAC clones and Z or PAC clones.
  • BAC clones RP11-60O19
  • BAC clones RP11-240A17
  • BAC clones RP11-1136L8
  • PAC clones RP1-80K22
  • a probe-immobilized solid phase carrier for prognosis diagnosis of an MCL patient to which any of these probes is immobilized.
  • a typical example is a DNA microarray.
  • primers (sets) that can amplify these chromosomal regions and probes that hybridize to these regions.
  • the responsible gene of the amplified region in 8q24 is the c-MYC gene. Therefore, the prognosis can be diagnosed by detecting the expression level of the c-MYC gene in the same manner as the BIM gene already described. That is, it can be said that the expression level of this gene is higher in patients than in healthy individuals, and sometimes the prognosis is poor. Specifically, it is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably 100% or more compared to the expression level of healthy individuals.
  • the detection step can be a step of detecting amplification, expression enhancement or mutation of the c-MYC gene.
  • the detection step may be a step of using either the c-MYC gene or the mRNA and cDNA expressed from the c-MYC gene in the specimen.
  • the detection step may be a step of detecting the presence / absence, expression level or mutation of the protein encoded by the c-MYC gene.
  • the present invention also includes prognostic markers such as arrays, primers, probes, and antibodies, and prognostic kits that can be used in these embodiments.
  • C-MY MCL prognostic array with probe capable of detecting C gene, c MYC gene or a part of it or a polynucleotide having a complementary base sequence Probe or primer (set) for prognosis of MCL It may be a marker.
  • the diagnostic marker may be a protein encoded by the c-MYC gene, a part thereof, or an antibody against them. Further included are diagnostic kits containing at least one of these prognostic markers.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of MCL of the present invention is characterized by containing a nucleic acid construct that suppresses the expression of the cMYC gene.
  • the prognosis of MCL is poor because the c-MYC gene is amplified. Therefore, suppression of the progression of MCL is expected by suppressing the expression of cMYC protein in MCL patients.
  • nucleic acid constructs capable of suppressing the expression of the c-MYC gene by antisense or RNA interference can be used.
  • nucleic acid constructs include antisense nucleic acid methods that inhibit transcription by interactions such as hybridization with DNA encoding genes, etc., and antisense nucleic acids that inhibit transcription or translation by interactions such as hybridization with RNA such as mRNA.
  • nucleic acid constructs such as RNA interference method, decoy nucleic acid method, ribozyme method, etc. that degrade transcripts or inhibit translation based on interactions such as hybridization with transcripts such as mRNA.
  • Abutama can also be introduced by electo-poration.
  • nucleic acid in the nucleic acid construct that suppresses gene expression means a polynucleotide such as deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid.
  • the term also includes single stranded (DNA or RNA, sense or antisense) or double stranded polynucleotide (DNA or RNA).
  • DNA-RNA oligonucleotides double-stranded
  • DNA-RNA chimeric oligonucleotides single-stranded
  • peptide nucleic acids and morpholino oligonucleotides.
  • polynucleotide may be naturally or artificially modified.
  • a nucleic acid construct capable of expressing RNA interference is the mRN of such a target gene. It is constructed so that expression of these target genes can be suppressed targeting at least a part of transcripts such as A.
  • a nucleic acid construct is an RNA construct having a double-stranded structure of oligoribonucleotides that hybridize to each other. Specifically, each having an overhanging 3 ′ end is relatively short !, a single that forms (or has) a double-stranded oligonucleotide (small interfering RNA: siRNA) and a hairpin structure. Of oligoribonucleotides (short hairpin RNA: shRNA). These RNA constructs are preferred in that they can cause direct RNA interference.
  • RNA constructs of single-stranded oligonucleotide ribonucleotides that do not form a hairpin structure can also express RNA interference.
  • nucleic acid construct is an embodiment of the RNA construct of the above-described embodiment, that is, a vector encoding the siRNA or shRNA so that it can be expressed.
  • the nucleic acid construct of such an embodiment is preferable in that continuous RNA interference can be realized.
  • the shRNA expression vector can be constructed so that a continuous single-stranded RNA capable of constructing shRNA by intracellular transcription is transcribed from the antisense sequence and the other loop sequence of the sense sequence.
  • the siRNA expression vector should be constructed so that RNA having a predetermined sense sequence and antisense sequence is transcribed.
  • the sense sequence and antisense sequence may be expressed by a single vector, or different vector forces may be expressed.
  • the pharmaceutical composition can directly introduce the DNA using a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a ribosome.
  • a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a ribosome.
  • the target DNA or the like can be administered to a patient using these methods by ex vivo method or in vivo method.
  • the immunological phenotype of the tumor was determined by immunohistochemistry of the tissue pieces and flow cytometry of sputum or cell suspension. These studies include Ig light and heavy chains and some B cells (CD19, CD20, CD22, CD45RA and CD79a) and T cells (CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8, CD45RO and CD43 markers) CDND and CD23 were used, and CCND1 expression was analyzed in all specimens by Northern blot analysis and Z or immunohistochemistry (Suzuki et al., 1999) All samples used in this example were B It had a cell phenotype and expressed CD5, indicating overexpression of CCND1.
  • MCL-derived cell lines SP-53, Granta519, Z-138, REC-1, NCEB-1, jeko-1, and JVM2 were used. All these MCL cell lines have morphologies, immunological phenotypes, and Z or interphase cytogenetics (detection of t (l: 4) (ql3; q32)) (Saltman et al., 1988; Amin et al , 2003; Jeon et al., 1998). Previous The JVM2 cell line derived from lymphocyte leukemia and carrying the gene translocation of t (11; 4) (q13; q32) was also used in the examples.
  • the Karpas231 cell line derived from follicular lymphoma (FCL) and carrying the t (14; 18) (q32; q21) gene translocation, is a Dr. Abraham Karpas of Medical Research Council Center, Hills Road, Courtesy of Cambridge, UK (Nachva et al., 1993), and the Raji cell line is derived from Burkitt lymphoma.
  • High molecular weight DNA was extracted by lymph node strength in 29 patients with standard proteinase KZRNAse treatment and phenol'form extraction. Normal DNA was obtained from a healthy male blood donor. The RNA was also homogenized in guam-dithiothionate, and cell line strength was also prepared by centrifugation through cesium chloride.
  • the array used in the examples contains 2348 BAC and PAC clones, covering the human genome with a resolution of approximately 1.3 Mb, RP11 and RP13 libraries for BAC clones, and RP1 for PAC clones. Based on the RP3, RP4 and RP5 libraries.
  • BAC and PAC clones are available from NCBI (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensemblome Data Resources (http://www.ensembl.org/) and UC3 ⁇ 4C genome Bioinfomati cs (http: // www selected based on information in .ncbi.nlm.nih.gov /), and BACPAC Resource Center at the Children's Hospital (Oakland Research Institute, Oakland, A).
  • the chromosomes were arranged in the range of each chromosome in the order of chromosome 1 to chromosome 22 and X chromosome based on Ensembl Genome Data Resources from the Sanger Center Institute, February 2004 version.
  • the position of all clones used in the array CGH was confirmed by fluorescence insight hybridization (FISH). The name of the clone and the chromosomal location are provided on request.
  • FISH fluorescence insight hybridization
  • a cage for degenerate oligonucleotide primer PCR contained 10 ng of BAC (or PAC) DNA.
  • DOP PCR products precipitated with ethanol And then dissolved in a DNA spot solution DSP0050 (Matsunami Glass Co., Ltd., Osaka, Japan) and mechanically placed on a CodeLink TM activated slide (Amersham Biosciences, Piscata way, NJ). Spotting was performed in duplicate by an inkjet method using NGK (NGK, Nagoya, Japan).
  • the DNA ⁇ pot was automatically divided and the signal intensity was determined by subtracting the local background, followed by the signals of the two dyes (Cy3 intensity ZCy5 intensity) Intensity ratios are calculated for each spot and converted to log ratios in the order of their positions on the chromosome on the etachel sheet.
  • a value including 1.0 of homo loss / deletion was set to 1.0.
  • Probes 1-6 were designed based on BAC438K19 genomic DNA to detect 2ql3 target genes.
  • the length of BAC438K19 (Accession No. AC096670) is 179497bp.
  • Probes 7 and 8 were designed based on the genomic DNA of BAC368A17 (BAC438K19 (against 1.55 Mb telomeric)) and BAC537E18 (BAC438K19 [against 1.85 Mb centromeric), respectively].
  • Probes 1-8 used for the Southern blot were amplified by PCR using 8 primer pairs based on human placenta DNA. The primer pairs used for PCR were as follows. Probes 1-6 are shown in SEQ ID NOs: 3-8, and primer pairs for probes 1-8 are shown in SEQ ID NOs: 9-24.
  • Probes 2-4 contained the open reading frame of BIM! /.
  • BIM BIM EL
  • BIM L BIM alpha
  • BIM beta BIM gannma
  • the open reading frame (597 bp) of BIM EL contains the etason of these variants
  • probe 4 contains the start codon (ATG) of BIM (BIM EL and BIM L)
  • probe 2 Contains the BIM stop codon (TGA).
  • Amplification was performed with a thermal cycler (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT). PCR was performed according to the touchdown PCR method (Motegi et al., 2000). 10 cycles of denaturation (94 ° C, 0.5 min), annealing (63 ° C, 0.5 min, 1 ° C decrease every 2 cycles) and extension (72 ° C, 2.5 min) This was followed by 25 cycles of denaturation (94 ° C, 0.5 min), annealing (58 ° C, 0.5 min) and extension (72 ° C, 2.5 min), followed by 72 ° C, 5 min. Final extension in minutes. The basic annealing temperature for the reaction was 63 ° C to 58 ° C.
  • PCR products were separated by electrophoresis and purified with the QIA Quick TM Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • TA cloning on the purified PCR product was performed using pBluescriptll SK (-) and sequenced with ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, VA). Digest 10 ⁇ g of genomic DNA sample with BamHl (probes 1 and 6) or Hindlll (probes 2-4) for 16 hours, and then add 0.8% agarose gel (1 xTBE).
  • the gel is prepared in 0.25 MHC1 for 30 minutes, 1.5 M NaCl / 0.5 M NaOH [this 30 minutes f3 ⁇ 4, and further, 0.5 M Tris (pH 7.4) /1.5 M NaCl [this 30 minutes [3 ⁇ 4, Kawajiji Soaked.
  • HybondN + membrane (Amersham Pharm acia Biotech, Tokyo, Japan) were washed and transferred to, at 65 ° C [ ⁇ - 32 P] dCTP -labeled probes 1-8 toe ⁇ hybrida I was allowed to Subsequently, it was washed with 2 ⁇ SSC, then with SSC—0.1% N-lauryl sacrocin reduced in concentration at 65 ° C., and finally exposed to BioMax TM MS film (EKC, Rochester, NY).
  • Northern blots were performed on 7 MCL cell lines, Karpas231 (FCL) and Raji (Burkitt lymphoma) using BIM EL cDNA.
  • the probe used for Northern blotting was performed by RT-PCR method using the following primer pair (SEQ ID NO: 25, 26). sense: 5 -atggcaaagcaaccttctgatgta-3
  • BIM EL cDNA (open reading frame, 597 bp) was prepared from fetal brain cDNA.
  • Interphase chromosomes were prepared from paraffin-embedded samples (G468) and cell lines. Two-color FIS H analysis was performed according to previous reports (Nomura et al., 2003; Zhang et al., 2004). Probe A: BAC438K19 (green) and probe B: BAC368A17 (red) were used.
  • Array CGH has a small region for amplification and deletion, as well as whole chromosomes. It was also possible to detect the contour of the boundary region between amplification and defect. Small amplicons originating from clones containing known oncogenes were easily detected as if they were small! /, Homozygous deletions.
  • Regions with recurrent gain are 3ql3. Il to q29, 6p21.32 to p25.3, 7pl4.3 to p22.3, 8ql3.2 to q24 of the chromosome. 22, 10pl2. I to pl2. 2 and 17q23.2 to q24.1, and regions with frequent defects (more than 5 cases) are 1 ⁇ 36.23 to p36.32, lpll.2 to p31.3, lq42 .2 to (!
  • I ⁇ pl2.2 ( 21%) and 17q23.2 ⁇ q24.1 is a (17 0/0), deficient [tips! / ⁇ or Te, 2pll.2 (83%), llq22.3 to q23.1 (59%), 13ql4.3 to q21.1 (55%), lp21.3 to p22.1 (52%), 13q34 (52%), 9q22.33 to q31.1 ( 45%), 17pl3.3 (45%), 9p21.3 to p22.1 (41%), 9p24.2 to p24.3 (41%), 6q23.2 to q24.1 (38%), lp36.
  • Table 1 Frequent and highest frequency regions of gain and loss on the genome.
  • a gain or loss region is defined as a clone that exhibits high copy number (log ratio> + 1.0) or homozygous loss even if at least 3 clones showing gain or loss are continuous or not continuous : Frequent areas are defined as areas observed in 5 or more cases.
  • b The highest frequency region of gain or loss was defined as the most frequent region in the frequent region.
  • c The region is arranged based on the position on the chromosome.
  • d Based on Sanger Center Institute, February 2004 version.
  • e An example of a clone showing the highest frequency gain or loss in the highest frequency region. When clones that show the highest frequency gain or loss have the same rate of genomic abnormalities within the highest frequency region, clones that contain tumor-related genes Shown above the screen.
  • f Gene contained in a representative clone.
  • b Number of patients with 2 or more homozygous defects.
  • c Number of cell lines showing homozygous defects in 2 or more cases.
  • d Number indicating homozygosity and heterozygosity loss (compared to log—0.2).
  • Genomic imbalances generally occur more frequently in MCL cell lines than in patients.
  • the example patient sample showed a heterozygous defect as well.
  • a partial genomic profile of each chromosome 2 of the patient sample (G468) and cell lines SP-53, Z-138 and jeko-1 is shown in FIG.
  • the most defective locus in 2q is BAC RP11-438K19 (BAC438K19), which contains two genes BIM and ACOXL (Acyl-CoA dehydrogenase gene).
  • the former is a BH3-only, Bel-2 family member single protein that promotes apoptosis (0, Conner et al., 1998).
  • the latter function is known. Since there is no information on the target gene in 2ql3 with homozygous deficiency, the next step is to find the target gene candidate by searching for the minimal common region of deficiency in 2ql3. did.
  • the minimal common region of 2ql3 homozygous defects in these cell lines extends at least from probe 2 to 3 (15 kb), and at most from probe 1 to probe 4 (45 kb).
  • this region does not contain any other genes that contain the open reading frame of the BIM gene. Southern blot analysis was performed on seven MCL cell lines using BAC, RP11-368A17 (probe 7) -derived probe and BAC, RP11-537E18 (probe 8).
  • BAC, RP11-368A17 (BAC368A17) is a 1.55 Mb telomeric clone for BAC438K19
  • BAC, RP11-537E18 (BAC537 E18) is a 1.85 Mb centromeric clone for BAC438K10.
  • the bands of probes 7 and 8 are positive in all MCL cell lines (data not shown), and the homozygous defective region of each cell line (SP-53, Z-138 and Jeko-1) is It was found to be 3.4 Mb at the maximum.
  • Southern blot analysis was performed on available patient samples (Fig. 5a), and a heterozygous defect pattern was found at 2ql3.
  • array CGH shows a heterozygous pattern at 2q13 !, but Northern blot analysis showed BIM in these two cell lines due to genetic effects. The gene mRNA was clearly suppressed! BIM gene was normally expressed in Granta519 and JVM2, which did not show any gene deletion in 2ql3.
  • BAC438K19 and BAC368A17 (1.55 Mb telomeric against BAC438K19) and BAC438K19 and BAC537E18 (1.85 Mb centromeric against BAC438K10) in three MCL cell lines (SP-53, Z-138 and je Two-color FISH was performed on ko-1) and patient sample (G468). These three clones were placed next to each other on an array CGH glass slide.
  • Figure 5b shows the results of two-color FISH of BAC438K19 and BAC368A17 on a patient sample (G468). The FISH results (data not shown) for these three cell lines were in good agreement with the array CGH data.
  • TP53 mutations in MCL are well known genomic alterations and associated with various cellular mutations and poor prognosis (Greiner et al., 1996; Hernandez et al, 1996), our findings are 17pl3 It was shown that other tumor suppressor genes in 3 may be associated with the development of lymphoma.
  • the biological value of Array CGH's high resolution of analysis includes specific oncogenes and tumor suppressor genes, and may have low levels, high levels of amplified copy number, homozygous deficiency Can be detected.
  • BIM gene is a proapoptotic member of the BCL2 family and is a major physiological antagonist of BCL2, particularly in the hematopoietic system (Bouillet et al., 2002), Enders et al. Recently reported that B lymphocytes lacking the BIM gene are resistant to apoptosis induced by binding to B cell receptors in vitro (Enders et al.). al, 2003). Finally, Egle et al., Using Bim- Z- and Bim + Z- ⁇ — Myc mice, found that BIM gene deficiency is the beginning of tumor formation (Egle et al. These findings suggest that the BIM gene is a tumor suppressor gene.
  • Figure 6 shows the prognostic curve for the gain or loss of a specific clone. That is, for 29 cases, the relationship between specific gain or loss and prognosis (survival status) was examined using force-plan-Meier survival curves and the mouth-rank test.
  • Figure 6 shows the force plan Meyer survival curve. The horizontal axis shows the number of days of survival, and the vertical axis shows the survival rate.
  • Greiner TC Moynihan MJ, Chan WC, Lytle DM, Pedersen A, Anderson JR and Wei senburger DD. (1996). Blood., 87, 4302-4310.
  • Pinyol M, Hernandez L, Cazorla M, Balbin M, J ares P, Fernandez PL, Montserrat E, Cardesa A, Lopez- Otin C and Campo E. (1997). Blood., 89, 272-280.
  • the present invention relates to sequences that can be used for diagnosis and prognosis of malignant tumors, particularly malignant lymphomas.

Abstract

　本発明は、悪性リンパ腫において複雑な遺伝子コピー数の変化をより正確に解析し、より詳細に重要なゲノム異常領域を同定して、病型の診断や予後診断に利用することを目的とし、ゲノムワイドなアレイＣＧＨを実施して、ヒト１番染色体ｐ３６．２３～ｐ３６．３２、ヒト１番染色体ｑ４２．２～ｑ４３、ヒト２番染色体ｐ１１．２、ヒト２番染色体ｑ１３、ヒト１７番染色体ｐ１１．２～ｐ１３．３及びヒト１９番染色体ｐ１３．２～ｐ１３．３を同定した。

Description

悪性リンパ腫の診断及び予後診断の方法
技術分野
[0001] 本発明は、悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫の診断及び予後診断の方法に関し、詳し くは、マントル細胞リンパ腫の診断及び予後診断に方法に関する。
背景技術
[0002] マントル細胞リンパ腫（MCL)は、 CCDN1の過剰発現に帰結する BCL1遺伝子に おける転座（11 : 4) (ql3 : q32)により特徴付けられており、ナイーブ前胚中心 (naive pre- germinal center) CD5+細胞に由来していると推定されている (Seto et al.， 1992;
Jaffe et al.， 2001)。この CCDN1の過剰発現を伴う MCLの実質的に全てに見出さ れる転座の同定は、この遺伝子転座が腫瘍化に重要な役割を担っていることを示し ている Oaffe et al.， 2001)。こうした共通のマーカーの存在に関わらず、 CCND1を過 剰発現するトランスジエニックマウスを用いた実験によれば、このタンパク質のみでは リンパ腫を発症しないことがわかっている (Hinds et al.， 1994; Lovec et al.， 1994)。し たがって、 l lql3以外の遺伝子上の変異が MCLの発症と進行に関与していると考 えられる。そこで、他の変異を同定するために、 CGH法及び染色体バンド解析が行 われてきている (Monni et al, 1998; Bea et al, 1999; Cuneo et al, 1999; Bentz et al ., 2000; Martinez- Climent et al., 2001; Bigoni et al" 2001; Allen et al., 2003)。これ らの研究【こよれ ίま、、 MCL【こお!/ヽて ίま、 3q, 6p, 7p, 8q, ΙΟρ, 12q及び 18qなどの ゲノムのゲイン/増幅や lp, 6q, 8p, 9p, l lq及び 13qなどのゲノムのロス/欠損な どのゲノム不均衡がしばしば存在することを示して 、る。このようなゲノム不均衡を伴う いくつかの遺伝子における脱制御もいくつ力検出されている。例えば、 10pl2. 2の 増幅から BMI—1遺伝子、 9p21. 3の欠損力も pl6INK4a遺伝子、 l lq22. 3の欠損 力 ATM遺伝子における脱制御が見出されている (Dreyling et al., 1997; Pinyol et al" 1997; Stilgenbauer et al., 1999; Schaffher et al., 2000; Bea et al., 2001; Rosenw aid et al., 2003)。し力しながら、増幅又は欠損する部位を含む標的遺伝子は不明で ある。こうした現状は、 10〜20メガベース以上の DNAのコピー数異常しか検出でき な 、と 、う染色体バンド解析や従来の CGHの解析解像度の限界にも一つの理由が ある。
[0003] 近年、アレイ CGH法と ヽぅ、高解像度でかつ高精度なチップを用いた CGH手法が 開発されてきている (Pinkel et al., 1998)。本発明者らは、 2348種のバクテリア人工染 色体 (BAC)と p— 1由来人工染色体 (PAC)を 1. 3Mbの平均解析解像度でガラス スライド上にそれぞれ二連でスポットした独自のアレイ CGHを作製した。また、このァ レイ CGHは、 Bリンパ腫の 13q31. 3に新規な腫瘍関連遺伝子である C13orf 25を 同定した (Ota et al., 2004)。これらの結果は、アレイ CGHによる DNAコピー数の定 量的計測は、ゲノム不均衡の生じている部位をより正確に特定できるものであり、腫 瘍関連遺伝子を同定するための有用なツールであることを示している。 発明の開示
[0004] 本発明者らは、複雑な遺伝子コピー数の変化をより正確に解析し、より詳細に重要 な増幅 Z欠損領域を同定するために、 29人の個体サンプルと 7種のマントル細胞リ ンパ腫 (MCL)の細胞株に対してゲノムワイドなアレイを用いる CGHを実施した。
[0005] マントル細胞リンパ腫 (MCL)では BCL1遺伝子座位（l lql3)の染色体転座が腫 瘍化に重要な役割を担って ヽるが、染色体転座単独では腫瘍化しな ヽことも知られ ている。しかし、 MCLの病型や病態に関与する転座以外の遺伝子異常について、 詳細には検討されていない。そこで、 29症例の MCL患者検体と 7種類の MCL細胞 株を、近年我々が確立したアレイ CGHを使用して、全ゲノム領域に渡ってゲノム異 常を検討した。その結果、 MCLに特徴的なゲノム異常が見出された。今回、初めて 明らかになつたこととして、 BIM遺伝子座位領域の欠失がある。検索の結果、 BIM遺 伝子座位領域の欠失が 5症例の患者検体に認められ、また、 7細胞株のうち 5細胞株 に欠失が認められた。共通欠失領域を詳細に調べ、欠失領域の責任遺伝子は BIM 遺伝子であることを明らかにした。また、遺伝子欠失に対応してその発現が強く抑え られていることを明らかにした。悪性腫瘍に関連付けられて BIM遺伝子異常が明らか になったのは、本報告が初めてである。また、 BIM遺伝子は抗アポトーシス作用をも つ BCL2遺伝子の拮抗物質であり、その欠失は細胞に BCL2遺伝子による抗アポト 一シス機能をより高めることが想像されるので、腫瘍ィ匕やその病態に重要な役割を担 うことが推測される。現在までの解析では BIM遺伝子異常は B細胞性悪性リンパ腫 のうち MCLに特徴的に認められる遺伝子異常であるが、 BCL2は多くの腫瘍細胞に 発現されているので、 BIM遺伝子の発現抑制は他の固形癌においても、腫瘍化や 病態の形成に重要な役割を担う可能性がある。すなわち、 BIM遺伝子は腫瘍化や 病態の形成において、がん抑制遺伝子として機能する可能性が高ぐ治療反応性の 指標となりうる。また、将来、治療の標的分子として重要な意義が明らかになる可能性 がある。
[0006] 本発明によれば、以下の手段が提供される。
本発明の一つの形態によれば、ヒト 1番染色体 p36. 23〜p36. 32、ヒト 1番染色体 q42. 2〜q43、ヒト 2番染色体 p i 1. 2、ヒト 2番染色体 ql 3、ヒト 17番染色体 p i 1. 2 〜p l 3. 3及びヒト 19番染色体 p i 3. 2〜p l 3. 3力 選択される 1種又は 2種以上に おける欠損又は変異を検出する工程を備える、悪性腫瘍の診断方法が提供される。
[0007] この方法においては、前記悪性腫瘍は悪性リンパ腫であってもよい。さらに、前記 検出工程の検出結果に基づいて前記悪性リンパ腫の病型を判定する病型判定工程 を備えることもできる。また、この病型判定工程における前記病型はマントル細胞リン パ腫とすることができる。
[0008] また、この方法においては、前記検出工程は、ヒト 2番染色体 ql 3の塩基配列にお ける欠損又は変異を検出する検出工程を備えることができる。前記検出工程は、ヒト 2 番染色体 q 13の領域若しくは BIM遺伝子の欠損を検出する工程とすることもできる。 さらに、前記検出工程における検出結果に基づ 、て前記悪性腫瘍の治療反応性を 判定する治療反応性判定工程を備えることもできる。すなわち、ヒト 2番染色体 q 13の 領域若しくは BIM遺伝子の欠損があるときには、治療反応性が低いと診断することが できる。
[0009] さらに、この方法においては、前記検出工程は、 BAC RP11— 438K19の 35027 bp力ら 49920bp、配列番号： 1に記載の塩基配列の 394位〜 597位及び配列番号 ： 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位の、、ずれかにおける欠損又は変異を検出 する工程とすることがでさる。 [0010] また、前記検出工程は、検体中の BIM遺伝子、 BIM遺伝子から発現する mRNA 及び cDNAのいずれかを利用する工程とすることもできる。この検出工程は、 PCR法 、 RT— PCR法、核酸ハイブリダィゼーシヨンを実施する工程を含むことができる。さら に、この検出工程は、 BIM遺伝子の少なくとも一部に相補的な 1種又は 2種以上のプ ローブを備えるアレイ上において該プローブと検体力 得られる核酸試料とをハイブ リダィズする工程を含むことができる。
[0011] さらにまた、この方法においては、前記検出工程は、アレイ CGH法を実施する工程 とすることちでさる。
[0012] また、この方法においては、前記検出工程は、前記 BIM遺伝子によってコードされ るタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程であるとすることもでき る。
[0013] 本発明の他の一つの形態によれば、 BIM遺伝子若しくはその一部又はこれらに相 補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである、悪性腫瘍診断用マーカーが提供さ れる。なお、本明細書において、診断用マーカーとは、診断の指標となる化合物及 び診断の指標となる化合物をマーキングして当該化合物を検出できる化合物の双方 を包含している。例えば、 BIM遺伝子は診断の指標となる化合物とし、これに相補的 な塩基配列を有するポリヌクレオチドは、 BIM遺伝子をマーキングできる化合物とす ることがでさる。
[0014] このマーカーは、前記 BIM遺伝子のタンパク質翻訳領域である配列番号： 1又は配 列番号： 2に記載の塩基配列を有することができる。また、このマーカーは、配列番号 1に記載の塩基配列の 394位〜 597位若しくは配列番号 2に記載の塩基配列の 214 位〜 417位の少なくとも一部又はこれに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド であってもよい。さらに、こうしたポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーとして使 用されるものであってもよい。
[0015] 本発明の他の一つの形態によれば、 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質若 しくはその一部又はこれらに対する抗体である、悪性腫瘍診断用マーカーが提供さ れる。
[0016] 本発明の他の一つの形態によれば、悪性腫瘍の診断用アレイであって、ヒト 2番染 色体 ql3における欠損又は変異を検出するための核酸プローブを固定したアレイが 提供される。
[0017] このアレイにおいては、前記プローブは、 BIM遺伝子の欠損又は変異を検出する ための核酸プローブとすることができる。また、前記核酸プローブは、配列番号 1に記 載の塩基配列の 394位〜 597位若しくは配列番号 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位の少なくとも一部又はこれらに相補的な塩基配列を有していてもよい。
[0018] 本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかに記載の診断方法のための診 断用キットであって、 BIM遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブを 含む、診断用キットが提供される。なお、この診断用キットには、上記染色体上の各 種領域の欠損を検出するためのプローブを含んで 、てもよ 、。
[0019] 本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物で あって、 BIM遺伝子のコード領域又は該 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質 の活性を有するホモログタンパク質のコード領域を有する DNA構築物を含有する医 薬組成物が提供される。
[0020] 本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物で あって、 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質又は BIM遺伝子によってコード されるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質を含有する医薬組成物が提供さ れる。
[0021] 本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方 法であって、前記患者力 採取した試料について、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27にお ける欠損若しくは変異、ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2における欠損若しくは変異及び ヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22における増幅若しくは変異を検出する工程を実施 する、方法が提供される。
[0022] この方法にぉ 、て、以下の（a)〜（c)の 、ずれかの判定工程を実施することができ る。
(a)ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27に欠損があるとき、予後が良好である。
(b)ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2に欠損があるとき予後が不良である。
(c)ヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22に増幅があるとき、予後が不良である。 [0023] この方法においては、前記検出工程は、前記染色体上の領域を含むプローブと前 記患者力 採取した前記患者の核酸試料とをハイブリダィゼーシヨンにより前記欠損 又は増幅を検出する工程とすることができる。この工程においては、前記プローブは 、 BACクローン及び Z又は PACクローンとすることできる。さらに、前記（a)において は、 BACクローン (RP11— 60O19)を用い、前記（b)においては、 BACクローン (R P11 - 240A17)を用い、前記（c)にお!/、ては、 BACクローン (RP11— 1136L8)又 は PACクローン (RP1— 80K22)を用いることができる。さらにまた、前記検出工程は 、固相担体上において行うことができる。この方法においては、前記検出工程は、ァ レイ CGH法を実施する工程とすることもできる。
[0024] また、この方法においては、前記検出工程は、 c— MYC遺伝子の増幅、発現増強 又は変異を検出する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、検体中の c— MYC遺伝子、 c - MYC遺伝子から発現する mRNA及び cDNAの!、ずれかを利用 する工程とすることもできる。この検出工程は、 PCR法、 RT— PCR法、核酸ハイプリ ダイゼーシヨンを実施する工程を含むことができる。さら〖こ、この検出工程は、 c— MY C遺伝子の少なくとも一部に相補的な 1種又は 2種以上のプローブを備えるアレイ上 において該プローブと検体カゝら得られる核酸試料とをハイブリダィズする工程を含む ことができる。
[0025] また、この方法においては、前記検出工程は、 c— MYC遺伝子によってコードされ るタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程とすることもできる。
[0026] 本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の予後診断用アレイで あって、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27、ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2及びヒト 8番染色 体 ql3. 2〜q24. 22を検出するためのプローブのいずれかを固定したアレイが提供 される。ヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22を検出するためのプローブは、 c— MYC遺 伝子を検出できるプローブであってもよ 、。
[0027] 本発明の他の一つの形態によれば、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27、ヒト 8番染色体 p 12〜p23. 2及びヒト 8番染色体 ql 3. 2〜q24. 22を検出するためのプローブゃプラ イマ一（セット)などのポリヌクレオチドである、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マ 一力一が提供される。また、前記ポリヌクレオチドは、 c— MYC遺伝子若しくはその一 部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
[0028] 本発明の他の一つの形態によれば、 c MYC遺伝子によってコードされるタンパク 質若しくはその一部又はこれらに対する抗体である、マントル細胞リンパ腫の予後診 断用マーカーが提供される。
[0029] 本発明の他の一つの形態によれば、上記マントル細胞リンパ腫の予後診断方法の ための診断用キットであって、上記したマントル細胞リンパ種の予後診断用マーカー の少なくとも一種を含む診断用キットが提供される。
[0030] また、本発明の他の一つの形態によれば、マントル細胞リンパ腫の治療用の医薬 組成物であって、 c MYC遺伝子の発現を抑制する核酸構築物を含有する、医薬 組成物が提供される。 図面の簡単な説明
[0031] [図 1]個々の腫瘍患者についての典型的なゲノムプロファイルを示す。（a)代表的患 者サンプル及び（b) SP— 53細胞株の全ゲノムプロファイルが示されて!/、る。 Log2比 は、染色体上の位置に基づいて全てのクローンについてプロットされ、染色体の分離 を示す縦線とともに。 BAC及び P ACはそのゲノム上の位置に基づいて、左側の lpテ ロメァカゝら右側の Xqテロメァまで配列されている。（a)コピー数ゲイン領域： 5p, 7p21 . 3, 13q21. 33, 17q21. 31〜q24. 3及び コピー数ロス領域： 1ρ32, 2pl l . 2 , 2ql3, 8ρ12〜ρ23. 3, 8ql2. 3〜ql3. 1, 9p24. 3〜q31. 2, l lq22. 3〜q2 3. 2, 13ql4. 3〜q21. 1及び 15。 （b)コピー数ゲイン領域： 7pl l . 2〜p22. 3。コ ピー数ロス領域： 1ρ36. 23〜p36. 32, 1ρ13. 3〜p31. 2, lql3. 2〜q44, 2pl l . 2〜ql4. 3, 4pl5. I〜pl6. 1, 6ql4. I〜q21, 6q23. 2〜q26, 7q22. I〜q3 2. 3, 9p21. 3〜p22. 1, l lq22. 3〜q23. 2, 18q22. 1及び 20ql3. 13〜ql3. 20
[図 2]29例の患者におけるゲノムワイドのコピー数変化の頻度を示す。 (a)コピー数ゲ インの頻度。（b)コピー数ロスの頻度。クローンは、染色体 1〜22の順に、かつ各染 色体内におい は、てれらの anger Center mapping position, May 2004 version.に 基づいて配列された。 [図 3]患者サンプル（G468)及び 3種の MCL細胞株（SP— 53, Z— 138及び Jeko— 1)の第 2染色体におけるゲノムプロファイルを示す。 Log2比が + 0.2以上は、ゲノム コピー数ゲインとし、 Log2 比が一 0.2以下は、ゲノムコピー数ロスとした。 2qセント ロメァからの物理的距離（Mb)が示されている。縦線は、 BIM遺伝子を含む BAC43 8K19の第 2染色体上の最も大きな欠損部位を示す。 BAC438K19にお!/、て Log2 比は、 -0.59(G468), -2.75(SP— 53), —1.71 (Z— 138)及び— 1.76(jek o— 1)であり、 BIM遺伝子座におけるホモ接合性欠損を示唆している。
[図 4]2ql3におけるホモ接合性欠損の最小限共通領域と BIM遺伝子の発現を示す 。（a)BAC438K19、 BIM遺伝子のェクソンと 3種の細胞株（SP— 53, Z—138 and Jeko— 1)の欠損パターンの概略図。グレーボックス：ェクソン（BIM EL遺伝子及び BIM L遺伝子のオープンリーディングフレーム）。 BIM EL遺伝子のオープンリーデ イングフレーム（597bp)は、 3つのエタソン、ェクソン 1:75, 082— 75, 475bp(394 bp) (開始コドン (ATG)を含む）、ェクソン 2 :49, 074—49, 177bp (104bp)及びェ クソン 3 :34, 990-35, 088bp(99bp) (終止コドン (TGA)を含む）を含み、全て B AC438K19上にある。黒と白のサークル：サザンブロットに用いたプローブ。白いサ 一クルのある点線：ホモ接合性欠損 (バンド陰性)。黒 、サークルのある太線：非ホモ 接合性欠損 (バンド陽性)。細線:ホモ接合性欠損の有無が確認されていない。プロ ーブ 2とプローブ 3の間の太い点線矢印は、 2ql3のホモ接合性欠損の最小限共通 領域を示す。 (b) MCL細胞株のゲノム DNAに対するプローブ 1〜6を用いたサザン ブロット解析。レーン 1、ヒトプラセンタ、レーン 2、 sp— 53、レーン 3、 Granta519(G5 19)、レーン 4、 Z— 138、レーン 5、 REC— 1、レーン 6、 NCEB— 1、レーン 7、 Jeko ー1、レーン 8、JVM2。プローブ 1のバンド：ヒトプラセンタ（ + )、 SP— 53(—）、 Gran ta519( + )、 Z— 138( + )、 REC— 1(+ )、 NCEB— l( + )、Jeko— 1(一）及び JV M2( + )oプローブ 4のバンド：ヒトプラセンタ（ + )、 SP— 53(—）、 Granta519( + )、 Z— 138(—）、 REC— 1(+ )、 NCEB— l( + )、Jeko— 1( + Z—）及び JVM2( + ) 。プローブ 5— 6のバンド：ヒトプラセンタ（ + )、 SP— 53(— )、 Granta519( + )、 Z— 138(—）、1^：じー1(+ )、？^^8—1(+ )、 1«)— 1(+ )及び1^^2( + )。 「コント口 ール」は、プローブ 6のバンド下にあるプローブ 3 (TCR j8プローブ）の代表的なコン トロールバンドを示す。 （c) 7種の MCL細胞株の BIM遺伝子のノザンブロット解析、 B リンパ腫 (Karpas231)及びバーキットリンパ腫 (Raji)細胞株。コントロールは j8—ac tinでめる。
[図 5]患者サンプル (G468)のサザンプロット及び FISH解析結果を示す。 (a)サザン ブロットレーン 1 :ヒトプラセンタ、レーン 2、 3, 5 : 2q 13欠損を伴わない患者サンプル、 レーン 4：アレイ CGHによって 2ql3の欠損を示した患者サンプル G468 (図 3参照）、 レーン 6： BIM遺伝子座にホモ接合性欠損を有する jeko - 1細胞株、 BIMェクソンを 含むプローブ 2をこの実験に用いた。（b) G468についてのプローブ A及びプローブ Bを用いた二色 FISH解析。プローブ A: BAC438K19、プローブ B : BAC368A17 。プローブ Bは、プローブ Aに対して 1. 55Mbテロメリックであり、 BAC438K19は BI M遺伝子を含む。間期の染色体は、二対の赤いシグナル (プローブ B、赤）と一対の 緑のシグナル（プローブ A、緑）を有しており、プローブ Aについてのヘテロ接合性欠 損を示した。
[図 6] (a)は、 6q21における欠損、 8p23における増幅及び 8q24における増幅を有 する場合と有しない場合におけるマントル細胞リンパ腫の力プラン マイヤー生存曲 線を示す。横軸は生存日数であり、縦軸は生存確率を示す。また、図 6 (b)は、 lq22 における欠損及び 9p22における欠損を有する場合と有しない場合におけるマントル 細胞リンパ腫の力プラン マイヤー生存曲線を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0032] (悪性腫瘍の診断方法）
本発明の悪性腫瘍の診断方法は、ヒト 1番染色体 p36. 23〜p36. 32、ヒト 1番染 色体 q42. 2〜q43、ヒト 2番染色体 pi 1. 2、ヒト 2番染色体 ql 3、ヒト 17番染色体 pi 1 . 2〜pl3. 3及びヒ卜 19番染色体 pi 3. 2〜pl3. 3力ら選択される 1種又 ίま 2種以上 における欠損又は変異を検出する工程を備えることを特徴としている。
[0033] 本診断方法によれば、悪性腫瘍の患者試料につ！ヽて、こうした検出工程を実施し て、上記染色体領域においてホモ接合性あるいはヘテロ接合性の欠損が見出され た場合、悪性腫瘍であると診断することができる。これらの染色体上の各種領域のな かでも、ヒト 2番染色体 ql3における欠損又は変異を検出することは有用である。この 領域は、 MCL症例検体のほか、 MCL細胞株において高頻度に欠損している。当該 変異は、悪性リンパ腫、特に B細胞性悪性リンパ腫において特長的である。また、一 般に、 MCL細胞株は、 MCL症例検体よりもより高い悪性度を示す。したがって、 2q 13における欠損又は変異を検出することは、悪性腫瘍、なかでも、 B細胞性悪性リン パ腫において MCLなど悪性度の高い病型であると診断するのに有用である。
[0034] ヒト 17番染色体 pl l. 2〜pl3. 3【こお!ヽて ίま、ヒト 17番染色体 pl3. 3及び同 pl3.
1の欠損又は変異を検出するのが好ましぐヒト 19番染色体 pl3. 2〜pl3. 3におい てはヒト 19番染色体 pi 3. 2の欠損又は変異を検出するのが好ましい。これらの領域 はより高頻度であるからである。
[0035] これらの染色体上の各種領域における欠損又は変異を検出するには、各種方法を 採用することができる。たとえば、患者から採取される核酸試料とこれらの染色体上の 各種領域とハイブリダィズするプローブを用いたハイブリダィゼーシヨンにより検出す ることができる。症例等力もの核酸試料としては、患者のリンパ腫標本などから標準的 な DNA抽出法等により取得することができる。一方、プローブとしては、こうした染色 体上の領域の少なくとも一部をハイブリダィズするものであればょ 、。 DNAプローブ としては、染色体領域に対応した BACクローン及び/又は PACクローンを用いるこ とができる。こうした染色体上の各種領域及びクローンの例は、表 1及び表 2に示され ている。
[0036] ノ、イブリダィゼーシヨンの形態は特に限定しな 、。液相反応であってもビーズや基 板などの固相担体を用いた方法であってもよい。好ましくは、クローンなどの DNAプ ローブをチップなどの固相担体に固定したものを用いることができる。上記のような D NAプローブを固定化した固相担体としては、 DNAアレイが挙げられる。プローブの 固定形態は特に限定しないで、共有結合性及び Z又は静電的、疎水性相互作用等 の非共有結合性の各種の結合による固定形態が包含される。なお、こうしたプローブ を固定したアレイは、例えばアレイ CGHに用いられるアレイを用いることができる。
[0037] 以上のことから、この態様によれば、こうしたプローブを固定ィ匕した固相担体も提供 される。典型的には、固相担体は、スライドガラスなど平坦な基板状体であり、プロ一 ブ固定化担体としては、 DNAマイクロアレイが挙げられる。 [0038] 本発明者らによれば、 2ql3の欠損の責任遺伝子は BIM遺伝子であると同定され ている。このため、 2ql3の欠損又は変異の検出には、 BIM遺伝子の欠損又は変異 を検出してもよい。この場合、 BIM遺伝子の欠損や変異は、検体中の BIM遺伝子の 欠損自体のほか、 BIM遺伝子の発現量の多少によって検出することができる。すな わち、検体試料中の BIM遺伝子の発現量が健常者の試料と比較して少な ヽ場合に は、悪性腫瘍において例えば、 MCLなど悪性度が高い病型であると診断することが できる。なお、検体試料中の BIM遺伝子の発現量が健常者の試料に比較して少な い場合とは、例えば、健常者の発現量の 60%以下であることが好ましぐより好ましく は 50%以下、さらに好ましくは 20%以下、一層好ましくは 10%以下である。
[0039] こうした BIM遺伝子における欠損又は変異の検出は、具体的には、検体試料中の BIM遺伝子、 BIM遺伝子から発現する mRNA及び cDNAの!ヽずれかを利用するこ とができる。これらの核酸材料は、 PCR法、 RT— PCR法等の公知の核酸試料の取 得あるいは増幅方法によって得ることができる。 BIM遺伝子又はその一部を増幅で きる PCR法に用いるプライマーは、 BIM遺伝子の配列に基づいて設計することがで きる。好ましくは、 BIM遺伝子のタンパク質翻訳領域である配列番号 1や配列番号 2 に記載の配列あるいは配列番号 1に記載の塩基配列の 394位〜 597位及び配列番 号 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位に基づいて設計することができる。なお、プ ライマーの塩基長は、好ましくは、 15— 40塩基、望ましくは 15— 30塩基である。ただ し、 LA (long accurate) PCRを行う場合には、少なくとも 30塩基とすることが好まし い。なそ、センス鎖とアンチセンス鎖が互いにァニールしないように、また、ヘアピン 状構造の形成を回避できるような塩基配列を選択することが好ましい。
[0040] これらの核酸試料を用いて BIM遺伝子における欠損又は変異を検出するには、こ うしたプライマー（セット）による Real— Time PCRなどの定量的 PCRによっても行うこ とがでさる。
[0041] また、これらの核酸試料を用いて BIM遺伝子における欠損又は変異を検出するに は、 BIM遺伝子を増幅できる適切なプライマーによる ReaKTime PCRなどによる定 量的 PCRによって行うことができる。
[0042] また、 BIM遺伝子の欠損や変異は、 BIM遺伝子に特異的にハイブリダィズするプ ローブによるハイブリダィゼーシヨンを用いることが好ましい。こうしたプローブとしては 、 BIM遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを用いることができる。プローブ は、 BIM遺伝子由来の核酸試料に対して特異的にハイブリダィズすればよぐ遺伝 子に対して完全に相補的である必要はな 、。このような多少変異したポリヌクレオチド は、部位特異的変異（Current protocols in Molecular Biology,Ausubelら編ズ 1987)Joh n Wiley&Sons,第 8.1— 8.¾早ノ、 PCR (Current protocols in Molecular Biology.Ausubel ら編, (1987)John \^ &30^,第6.1-6.4章）、通常のハイブリダィゼーシヨン（Current protocols in Molecular Biology'Ausubelら編ズ 1987)John Wiley&Sons,第 6.3- 6.4章）等 により得ることができる。プローブはストリンジェント (stringent)な条件下で BIM遺伝 子由来の核酸試料とハイブリダィゼーシヨンする。ここで、ストリンジェントな条件とは、 プローブと前記核酸試料との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件 である。ストリンジヱント条件は、塩濃度、有機溶媒 (例えば、ホルムアミド）、温度、お よびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒 濃度を増加させるか、またはハイブリダィゼーシヨン温度を上昇させるかによつてストリ ンジエンシー（stringency)は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、 NaCl約 750mM以下およびクェン酸三ナトリウム約 75mM以下、より好ましくは NaC 1約 500mM以下およびクェン酸三ナトリウム約 50mM以下、最も好ましくは NaCl約 250mM以下およびクェン酸三ナトリウム約 25mM以下である。ストリンジェントな有 機溶媒濃度は、ホルムアミド約 35%以上、最も好ましくは約 50%以上である。ストリン ジェントな温度条件は、約 30°C以上、より好ましくは約 37°C以上、最も好ましくは約 4 2°C以上である。その他の条件としては、ハイブリダィゼーシヨン時間、洗浄剤（例え ば、 SDS)の濃度、およびキャリアー DNAの存否等であり、これらの条件を組み合わ せることによって、様々なストリンジエンシーを設定することができる。なお、上記のハ イブリダィゼーシヨン条件は単なる例示であり、当業者であれば、プローブのヌクレオ チド配列、濃度、及び長さ、反応時間、反応温度、試薬濃度等の条件を考慮して、適 当なノ、イブリダィゼーシヨン条件を設定することができる。
なお、プローブは、必要に応じて適宜標識されて 、てもよ 、。標識は、ラジオァイソ トープ (RI)法または非 RI法によって行うことができる力 非 RI法を用いることが好まし い。非 RI法としては、蛍光標識法、ピオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、 蛍光標識法が挙げられる。
[0044] BIM遺伝子の欠損又は変異を検出するには、例えば、 in situノヽイブリダィゼーシ ヨン、ノザンブロット、ドットブロット、 DNAアレイなどを用いて解析することができる。な お、こうした手法におけるハイブリダィゼーシヨンの形態は特に限定しない。既に説明 したように、液相反応であってもビーズや基板などの固相担体を用いた方法であって もよい。ハイブリダィゼーシヨンによる検出手法としては、好ましくは、 DNAプローブを チップやビーズなどの固相担体に固定したものを用いることができる。 DNAプローブ を固定化した固相担体としては、 DNAアレイ（DNAチップ）が挙げられる。プローブ の固定形態は特に限定しないで、共有結合性及び Z又は静電的、疎水性相互作用 等の非共有結合性の各種の結合による固定形態が包含されるまた、プローブは、そ の場合成によって固相担体に固定ィ匕されたものであってもよい。
[0045] なお、上記した 2ql3における欠損又は変異の検出は、 BAC RP11— 438K19の 35027bp力ら 49920bp、酉己歹 IJ番号 1に記載の塩基酉己歹 IJの 394位〜 597位及び酉己 列番号 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位における欠損又は変異の検出工程と しても実施できる。すなわち、これらの領域は、ノザンブロット（実施例参照）において MCL細胞株において 2ql3の欠損及び BIM遺伝子の発現低下が認められている細 胞株にお 、て欠損されて 、る DNA領域である。配列番号 1及び配列番号 2における 上記所定範囲の塩基配列は、 BIMタンパク質のコード領域の一部である。したがつ て、これらの塩基配列あるいはその一部をプローブあるいはプライマーとして用いて、 上記各種方法により、これらの領域の欠損又は変異を検出することにより、 2ql3にお ける欠損又は変異や BIM遺伝子の欠損等を容易に検出することができる。
[0046] 以上説明したことから、この態様によれば、 2ql 3等の各種染色体上の領域あるい は BIM遺伝子若しくはその一部あるいはこれらに相補的な塩基配列を有する悪性腫 瘍診断用マーカーが提供される。これらのマーカーの欠損や変異が検出されること により、悪性腫瘍についての悪性度や病型の診断が可能となる。こうしたマーカーと しては、好ましくは、これら各種領域や BIM遺伝子の欠損や変異を検出することがで きるポリヌクレオチドなどの核酸分子であることが好ましい。こうした核酸分子は、上記 各種染色体上の領域若しくはその一部あるいはこれらに相補的な塩基配列を有する ポリヌクレオチド、 BIM遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有 するポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチドは、好ましくは DNAである。なか でも、各種染色体上の領域又はその一部あるいは BIM遺伝子又はその一部に相補 的な塩基配列等を有するプローブやプライマーなどの核酸分子は、診断用試薬とし て好ましく用いることができる。
[0047] また、この態様によれば、プローブあるいはプローブを固定化した DNAマイクロア レイも提供される。また、こうしたプライマーセットを含む診断用キットも提供される。
[0048] 本診断方法の他の態様として、 BIM遺伝子の欠損又は変異を検出するには、 BIM 遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出するこ とによってもよい。このためには、例えば、こうしたタンパク質に対して特異的な抗体を 用いることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用い ることができる。抗体分子又はその一部であってもよい。このような抗体は、例えばポ リクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役 した後、血清力も得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注 射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによ つて作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、 -ヮトリなどが 用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クロ ーン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990年; " Monoclonal Antibody" Ja mes W. Goding, third edition, Academic Press, 1996)に従い作製することができる。
[0049] 抗体は、適宜標識物質によって標識化されて!/ヽてもよ ヽ。標識物質は、酵素、放射 性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素としては、例えば、特に限定 しないで、通常の EIAに用いられる酵素、例えば、ペルォキシダーゼ、 β ガラクトシ ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースォキシダーゼ、アセチルコリンエステラ ーゼ、グルコース 6—リン酸ィ匕脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもで きる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結 合は、マレイミドィ匕合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基 質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。蛍光 色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネート（FITC)ゃテトラメチルローダミン イソチオシァネート (TRITC)等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用するこ とがでさる。
[0050] こうした抗体を用いて BIMタンパク質の発現量等を検出するには、組織あるいは細 胞染色などの免疫染色、競合型又は非競合型による放射免疫測定法 (RIA)、蛍光 免疫測定法 (FIA)、ルミネッセント免疫測定法 (LIA)、酵素免疫測定法 (EIA、 ELI SA)等の各種検出方法による測定方法を用いることができる。なお、こうした測定方 法における抗原抗体反応は、液相で行っても固相で行ってもよい。検出には、抗原 抗体反応産物が分離されていることが好ましい。このためには、例えば、クロマトダラ フィーやビーズやプレートなどの固相担体を用いてもよい。また、ウェスタンブロッティ ングの手法を用いてもよい。さらに、 ELISA法などを用いることができる。さらには、 抗体を基板などの固相担体に固定ィ匕したアレイを用いることでもできる。
[0051] この態様によれば、 BIMタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する抗体を含 む悪性腫瘍の診断用のマーカーが提供される。特に、抗体は、こうしたタンパク質を 検出するための検出試薬として好ましい。また、この態様によれば、こうした抗体を含 む悪性腫瘍の診断用キットが提供される。本発明の診断キットは、抗体や標識化抗 体を液相中に含むものであってもよく、あるいは抗体や標識化抗体を固相担体に結 合したものであってもよい。また、固定ィ匕された抗原又はその一部を含んでいてもよ い。診断用キットは、抗体が酵素で標識されている場合には、その基質を含んでいて もよい。さらに、固相担体を含むものの場合には、固相への非結合分子を洗浄除去 するための洗浄液を含んでいてもよい。このほか、一般に抗体を含む診断用キット〖こ 含まれることのできる要素を含むことができる。
[0052] 本発明の MCLの治療用医薬組成物は、 BIM遺伝子のコード領域又は該 BIM遺 伝子によってコードされるタンパク質の活性を有するホモログタンパク質のコード領域 を有する DNA構築物を含有する医薬組成物である。本発明者らによれば、 BIM遺 伝子が欠損することにより悪性腫瘍の悪性度が高まっている。したがって、 MCL患者 において BIMタンパク質を補うことにより MCLの進行の抑制が期待される。このため には、上記 DNA構築物をベクター等により患者に導入して BIM遺伝子を発現させる ことが好ましい。したがって、公知のベクターに上記コード領域を保持させることにより 、当該ベクターを医薬組成物として用いることができる。さらに、こうしたベクターにより あるいは他のトランスフエクシヨン法により、上記コード領域を発現可能に保持する細 胞を作製することで、この細胞を医薬組成物として用いることも可能である。
[0053] また、他の態様としては、 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質等をそのまま 医薬組成物として用いることもできる。
[0054] こうした医薬組成物の製剤化や投与については当業者であれば適宜適切な剤型 を選択して用量を選択することにより製造することができる。また、この医薬組成物は 、例えば、該 DNAを、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイ ルスベクター等のウィルスベクター、またはリボソーム等を用いて直接に導入すること ができる。 目的とする DNA等は、これらを利用して、 ex vivo法及び in vivo法により患 者に投与することができる。
[0055] (マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法）
本発明のマントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法は、前記患者力 採取し た試料について、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27における欠損、ヒト 8番染色体 pl2〜p 23. 2における欠損及びヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22に増幅のいずれかを検出 する工程を有することを特徴としている。そして、以下の（a)〜（c)のいずれかの判定 工程を実施することができるものである。
(a)ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27に欠損があるとき、予後が良好である。
(b)ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2に欠損あるとき予後が不良である。
(c)ヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22に増幅があるとき、予後が不良である。
[0056] こうした染色体上の領域はいずれも有意に MCLの予後と関連している力 変異の 頻度からは、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27においては、同 6q21〜q24. 1を検査対象 とすることが好ましぐより好ましくは同 6q23. 2〜q24. 1である。また、同様の観点か らヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2にお!/ヽては、同 ρ23. 1〜ρ23. 2を検査対象とするこ と力 子ましい。さらに、ヒト 8番染色体 ql3. I〜q24. 22においては、同 q21. 3〜q2 4. 21を検査対象とすることが好ましい。
[0057] また、上記ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2の欠損がある場合に予後との関係において 有意性が高ぐ次いで、ヒト 8番染色体 ql3. I〜q24. 22の増幅があることが有意性 が高ぐさらにヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27の欠損がないことの順になつている。
[0058] この方法においては、前記染色体上の領域を含むプローブと前記患者から採取し た前記患者の核酸試料とをハイブリダィゼーシヨンにより前記欠損又は増幅を検出す る工程を備えることができる。こうしたプローブとしては BACクローン及び Z又は PAC クローンとすることでき、具体的には、 BACクローン（RP11— 60O19)を用いること ができ、 BACクローン（RP11— 240A17)を用いることができ、 BACクローン（RP11 - 1136L8)又は PACクローン (RP1— 80K22を用いることができる。
[0059] この態様によれば、これらプローブのいずれかが固定化された MCL患者の予後診 断用のプローブ固定ィ匕固相担体も提供される。典型的には、 DNAマイクロアレイが 挙げられる。また、こうした染色体上の領域を増幅することができるプライマー (セット） やこれらの領域とハイブリダィズするプローブも提供される。
[0060] また、 8q24における増幅領域の責任遺伝子は、 c— MYC遺伝子であることが強く 示唆されている。したがって、既に説明した BIM遺伝子と同様、 c— MYC遺伝子の 発現量を検出することにより、予後を診断することもできる。すなわち、患者において この遺伝子の発現量が健常人に比べて多 、とき、予後が不良であると 、うことができ る。具体的には、健常人の発現量に比較して 10%以上、好ましくは 30%以上、より 好ましくは 70%以上、一層好ましくは 100%以上である。
[0061] c MYC遺伝子の発現量を検出するには、例えば、既に述べた BIM遺伝子の発 現量の検出方法と同様の態様を c MYC遺伝子又は c MYCタンパク質に対して 採ることができる。すなわち、前記検出工程は、 c— MYC遺伝子の増幅、発現増強 又は変異を検出する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、検体中の c— MYC遺伝子、 c - MYC遺伝子から発現する mRNA及び cDNAの!、ずれかを利用 する工程とすることもできる。また、前記検出工程は、 c— MYC遺伝子によってコード されるタンパク質の発現の有無、発現量又は変異を検出する工程とすることもできる
[0062] さらに、これらの態様に用いることのできるアレイ、プライマー、プローブ、抗体等の 予後診断用マーカー、予後診断用キットも本発明に包含される。すなわち、 c-MY C遺伝子を検出できるプローブを備える MCLの予後診断用アレイ、 c MYC遺伝 子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである プローブやプライマー（セット）である MCLの予後診断用マーカーであってもよい。診 断用マーカーは、 c— MYC遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部 又はこれらに対する抗体であってもよい。さらに、こうした予後診断用マーカーの少な くとも一種を含む診断用キットも包含される。
[0063] 本発明の MCLの治療用医薬組成物は、 c MYC遺伝子の発現を抑制する核酸 構築物を含有することを特徴としている。本発明者らによれば、 c— MYC遺伝子が増 幅していることにより MCLの予後が不良となっている。したがって、 MCL患者におい て c MYCタンパク質の発現を抑制することにより MCLの進行の抑制が期待される 。このためには、 c MYC遺伝子の発現を抑制することのできる核酸構築物をべクタ 一等によりあるいはそのまま患者に導入して c— MYC遺伝子の発現を抑制させるこ とが好ましい。こうした核酸構築物としては、アンチセンスや RNA干渉によって c— M YC遺伝子の発現を抑制することができる核酸構築物を用いることができる。こうした 核酸構築物としては、遺伝子等をコードする DNAとのハイブリダィズなどの相互作用 により転写を阻害するアンチジーン核酸法、 mRNAなどの RNAとのハイブリダィズな どの相互作用により転写又は翻訳を阻害するアンチセンス核酸法、 mRNAなどの転 写物とのハイブリダィズ等の相互作用に基づ 、て転写物を分解又は翻訳を阻害する RNA干渉法、デコイ核酸法、リボザィム法等による核酸構築物が挙げられる。なお、 遺伝子発現を抑制するものではないがアブタマ一をエレクト口ポレーシヨンにより導入 することもできる。なお、遺伝子の発現を抑制する核酸構築物における「核酸」とは、 デォキシリボ核酸及びリボ核酸のようなポリヌクレオチドを意味している。また、この用 語には、一本鎖（DNA又は RNA、センス又はアンチセンス）又は二本鎖ポリヌクレオ チド（DNA又は RNA)が包含される。また、 DNA—RNAノヽイブリツド（二本鎖）や D NA—RNAキメラオリゴヌクレオチド（一本鎖）、ペプチド核酸、モルホリノオリゴヌタレ ォチドも包含される。さらにまた、ポリヌクレオチドには天然あるいは人工的な修飾が 施されていてもよい。
[0064] 例えば、 RNA干渉を発現可能な核酸コンストラクトは、こうした標的遺伝子の mRN A等の転写産物の少なくとも一部を標的としてこれら標的遺伝子の発現を抑制可能 に構築されている。こうした核酸コンストラクトの一つの態様は、互いにハイブリダィズ するオリゴリボヌクレオチドの二本鎖構造を有する RNAコンストラクトである。具体的 には、突出した 3'末端をそれぞれ有するある 、は有しな ヽ比較的短!、二本鎖オリゴリ ボヌクレオチド（small interfering RNA： siRNA)及びヘアピン構造を形成する（又は 有する）単一のオリゴリボヌクレオチド（short hairpin RNA： shRNA)が挙げられる。こ れらの RNAコンストラクトは、直接 RNA干渉を引き起こすことができる点において好 ましい。また、ヘアピン構造を形成しない一本鎖オリゴヌリボヌクレオチドの RNAコン ストラクトも RNA干渉を発現することができる。
[0065] 核酸コンストラクトのもう一つの態様は、上記の態様の RNAコンストラクト、すなわち 、 siRNAや shRNAを発現可能にコードするベクターの態様である。こうした態様の 核酸コンストラクトは、継続性のある RNA干渉を実現できる点において好ましい。この 態様において、 shRNA発現ベクターは、アンチセンス配列及びセンス配列の他ルー プ配列を、細胞内転写により shRNAを構築可能な連続した一本鎖 RNAが転写され るように構成することができる。また、 siRNA発現ベクターは、所定のセンス配列及び アンチセンス配列を有する RNAが転写されるように構成すればょ 、。 siRNA発現べ クタ一においては、センス配列及びアンチセンス配列は単一のベクターによって発現 されるようにしてもよいし、また、それぞれ異なるベクター力も発現されるようにしてもよ い。
[0066] こうした医薬組成物の製剤化や投与については当業者であれば適宜適切な剤型 を選択して用量を選択することにより製造することができる。また、この医薬組成物は 、例えば、該 DNAを、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイ ルスベクター等のウィルスベクター、またはリボソーム等を用いて直接に導入すること ができる。 目的とする DNA等は、これらを利用して、 ex vivo法及び in vivo法により患 者に投与することができる。
[0067] 以下、開示された方法、及び請求の範囲に記載された方法の実施可能性を説明 するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではなく 、本発明の範囲は、請求の範囲の記載された内容に基づき、その均等物も含むより 包括的なものとして判断される 実施例
[0068] [実施例 1]
1.材料及び方法
1 - 1. MCL患者及び試料
男性 16名及び女性 13名（全て愛知県がんセンター及び関連病院から、患者により インフォームドコンセントを得た上で取得され、愛知県がんセンターの倫理審査委員 会の審査を受け承認されている。）の 29例の MCL患者力もの腫瘍試料を用いた。 2 4例は一般型に、 5例は芽球性変異型に分類された。患者の年齢中央値は、 67歳で あった (49歳〜 92歳）。 27例中 18例（67%)は、白血病であり（27例のデータが利 用可能であった。）、 29例中 27例（93%)が進行期（ΠΙ〜ΐν)にあり、 27例中 8例（3 0%)が LDHが増加しており（27例のデータが利用可能であった）、 28例中 5例（30 %)は全身状態の不良であり（28例のデータが利用可能であった）、 27例中 21例（7 8%)がーつ以上のリンパ節以外への転移を有していた（27例のデータが利用可能 であった)。腫瘍の免疫学的表現型は、組織片の免疫組織化学及び Ζ又は細胞懸 濁液のフローサイトメトリーにより決定された。これらの研究は、 Ig軽鎖及び重鎖と、い くつかの B細胞（CD19、 CD20、 CD22、 CD45RA及び CD79a)及び T細胞（CD2 、 CD3、 CD5、 CD7、 CD4、 CD8、 CD45RO及び CD43マーカー、 CD10及び C D23を用いた。また、 CCND1発現は、全ての検体においてノザンブロット分析及び Z又は免疫組織化学（Suzuki et al.,1999)により分析した。本実施例に用いた全て の試料は B細胞表現型を有しているとともに CD5を発現し、 CCND1の過剰発現を 示していた。
[0069] 1 - 2. MCL細胞株
7種の MCL由来細胞株、 SP— 53、 Granta519、 Z— 138、 REC— 1、 NCEB— 1 、 jeko— 1及び JVM2を用いた。これらの全ての MCL細胞株は、モルホロジー、免疫 学的表現型及び Z又は間期細胞遺伝学 (t(l :4) (ql3 ;q32)の検出） (Saltman et al ., 1988; Amin et al., 2003; Jeon et al., 1998)の全てにおいて特徴付けを行った。前リ ンパ球性白血病由来であり t ( 11； 4) (q 13； q32)の遺伝子転座を保持する JVM2細 胞株も実施例で用いた。 Z— 138、 NCEB— 1、 Granta519、 REC— 1及び JVM2 はマーチン'ダイヤー博士（Dr. MartinDyer of Leicester University, UK)の好 意により提供されたものである。濾胞性リンパ腫 (FCL)由来であって t (14 ; 18) (q32 ； q21)遺伝子転座を保持する Karpas231細胞株は、アブラハム 'カルパス博士 (Dr. Abraham Karpas of Medical Research Council Center, Hills Road, Cambridge, UK ( Nachva et al.， 1993)の好意により提供されたものである。また、 Raji細胞株は、バー キットリンパ腫に由来するものである。
[0070] 1 - 3. DNA及び RNAサンプル
高分子量の DNAを 29例の患者のリンパ節力 標準プロテインナーゼ KZRNAse 処理とフエノール'クロ口ホルム抽出により抽出した。正常な DNAは、男性の健常な 献血者から取得した。 RNAは、グァ -ジ-ゥムチオシァネート中でホモジナイズし、さ らに塩ィ匕セシウムによって遠心分離することによって細胞株力も調製した。
[0071] 1—4.アレイ CGH
実施例で用いたアレイは、 2348個の BAC及び P ACクローンを含んでおり、約 1. 3 Mbの解像度でヒトゲノムをカバーしており、 BACクローンについて RP11及び RP13 ライブラリ、 PACクローンについては、 RP1、 RP3、 RP4及び RP5ライブラリに基づい ている。 BAC及び PACクローンは、 NCBI(http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl enome Data Resources (http://www.ensembl.org/)及び UC¾C genome Bioinfomati cs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)における情報に基づいて選択し、 BACPAC Reso urce Center at the Children s Hospital (Oakland Research Institute, Oakland,し A) 力ら人手した。クロ ~~ンは、 Ensembl Genome Data Resources from the Sanger Center Institute, February 2004 versionに基づいて 1番染色体から 22番染色体までと X染 色体の順に各染色体の範囲内に配列された。アレイ CGHに用いた全てのクローン の位置の確認は、蛍光インサイトウハイブリダィゼーシヨン (FISH)により行った。クロ ーンの名称と染色体位置は要求により提供される。
[0072] 変性オリゴヌクレオチドプライマー使用 PCR (DOP— PCR)のための铸型は、 10ng の BAC (又は PAC) DNAを含んでいた。 DOP— PCR産物は、エタノールで沈殿さ せた後、 DNAスポット溶液 DSP0050 (松浪ガラス株式会社製、 Osaka, Japan)に 溶解し、機械的に CodeLink (商標）活性化スライド（Amersham Biosciences, Piscata way, NJ)上にセラミックァクチユエ一ターを用いたインクジェット法（NGK、 Nagoya, J apan)により二連でスポットした。
[0073] アレイの作製とその評価、ハイブリダィゼーシヨン方法並びに分析手法については 、既に詳細な記述がある（Ota et al. , 2004)。すなわち、試料 (腫瘍又は正常)及 び対照（正常） DNAのそれぞれ 1 μ gを、 Dpnllにより処理し、 BioPrimeDNAラベリ ングンスアム (Invitrogen Life Technologies, Inc., Tokyo, Japan;【こより、 Cy3— dUTP及 び Cy5- dUTP(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて標識した。試 料及び対照 DNAは、その後、 100 /z gの Cot— 1 DNA(Life Technologies, Inc., Gai thersburg, MD)と混合し沈殿させて、 45 μ 1のハイブリダィゼーシヨン溶液（50vol% ホルムアミド、 10%硫酸デキストラン、 2x SCC、 4%SDS及び 100 μ gtRNA)に再 懸濁させ、ガラススライド上でハイブリダィゼーシヨンさせた。 48〜66時間のハイブリ ダイゼーシヨン後、スライドを洗浄してアジレントマイクロアレイスキャナー (Agilent Tec hnologies, Palo Alto, CA)によりスキャンし、得られたアレイイメージを Genepix Pro 4. 1 (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA)により解析した。すなわち、 DNA^ポット を自動的に分割し、局所的なバックグラウンドを減算して、シグナル強度を決定した。 引き続き、 2種の色素（Cy3強度 ZCy5強度）のシグナル強度の比を各スポットにつ いて計算し、エタセルシート上において染色体における位置の順で log比に変換し
2
た。
[0074] このアレイにおいては、正常男性に対する正常男性の同時ノヽイブリダィゼーシヨン を 6回実施し、 log比の正常変動を定義した。本実施例では、蛍光強度の中央値の 1
2
0%以下であり、究極的な平均化テストにより対照の偏差が 1. 0からとなり、そして正 常対照群において最大の標準偏差 (SD)となるような 113クローン全てを以後の分析 力 排除した。したがって、 2235クローン（1. 3Mbの解像度で 2988Mbをカバーし ている）をさらなる分析の対象とした。 2235クローン中 2176クローン（2834Mb)は 1 番染色体の P腕テロメァから 22番染色体の q腕テロメァに相当していた。 2235クロー ン中 59クローンは X染色体に相当していた。各スポット（2 X 2235クローン）について 計測された蛍光 log比の 96%以上が + 0. 2から 0. 2の範囲であったので、増幅と
2
欠損のための log比の閾値をそれぞれ +0. 2と 0. 2とした。低レベルのゲイン
2 Z 増幅を log比が + 0. 2から + 1. 0とし、ヘテロなロス
2 Z欠損を含んでいるものと推測 されるものの log比を一 1. 0力 0. 2とし、高レベルのゲイン/増幅を log比〉 +
2 2
1. 0とし、ホモのロス/欠損を含んでいるものを log比く一 1. 0とした。
2
[0075] 1 - 5.サザンブロット分析
2ql3の標的遺伝子を検出するためにプローブ 1— 6を BAC438K19のゲノム DN Aに基づいてデザインした。 BAC438K19 (ァクセッション No. AC096670)の長さ は、 179497bpである。プローブ 7及び 8は、それぞれ BAC368A17 (BAC438K1 9【こ対して 1. 55Mbテロメリック）及び BAC537E18 (BAC438K19【こ対して 1. 85 Mbセントロメリック）のゲノム DNAに基づ!/、てデザインした。サザンブロットに用いた プローブ 1〜8は、ヒトプラセンタ DNAに基づく 8種類のプライマーペアを用いて PCR により増幅した。 PCRに用いたプライマーペアは、以下のとおりであった。プローブ 1 〜6を配列番号 3〜8に示し、プローブ 1〜8のためのプライマーペアを配列番号： 9 〜 24に示す。
[0076] プローブ l (850bp)：
sense (BAC438K19: 30,851- ύθ, 874 bp), 5 - ttgcacaagtaaagtggcaattac- 3
antisense (BAC438K19: 31,700-31,677 bp), 5 - atccctgacaactcagcgtttaga- 3 プローブ 2 (837bp)：
sense (BAC438K19: 34,214-34,237 bp), 5，— acgaatggttatcttacgactgtt— 3 ' antisense (BAC438K19: 35,050-35,027 bp), 5 ' - atctatgcatctgagtccagactg- 3 ' プローブ 3 (850bp)：
sense (BAC438K19: 49,071—49,094 bp), 5，— taccctccttgcatagtaagcgtt— 3 ' antisense (BAC438K19: 49,920—49,897 bp), 5，— tagtgacagcttaatgaaagggca— 3 ' プローブ 4 (81 lbp)：
sense (BAC438K19: 75,127—75,150 bp), 5，— gggtttgtgttgatttgtcacaac— 3 ' antisense (BAC438K19: 75,937-75,914 bp), 5 ' - tgctgccctcagcattttcggcaa- 3 ' プローブ 5 (1, 095bp)： sense (BAC438K19: 80,501—80,524 bp), 5，— gggtttgtgttgatttgtcacaac— 3 ' antisense (BAC438K19: 81 ,595-81 ,572 bp), 5 ' - ccgcgctggagttacaaactctat- 3 ' プローブ 6 (890bp)：
sense (BAC438K19: 177,3ol- 177,384 bp), 5 ' - cattccccagaaacagatctcgtt- 3 ' antisen se (BAC438K19: 178,250-178,227 bp), 5，— catagcattatcaatgccatcgat— 3 '
プローブ 7 (820bp)：
sense (BAC368A17: 34,301-34,320 bp), 5 ' - ccatagttaatgtacacagc- 3 '
antisense (BAC368A17: 35, 101-35, 120 bp), 5 ' - tcgcaaaccattaggaactg- 3 ' プローブ 8 (500bp)：
sense (BAC537E18: 191 ,071- 191 ,094 bp), 5 ' - ttggagccaaggtaggattaaaca- 3 ' antisen se (BAC537E18: 191 ,487—191 ,570 bp), 5，— ctggaggaatagtgcttccagatg— 3 '
[0077] プローブ 2〜4は BIMのオープンリーディングフレームを含んで!/、た。 BIM (BIM E L)は、 BIM L、 BIM alpha, BIM beta及び BIM gannmaなどのいくつかのスプラ イシングバリアントを有しており (O ' Connor et al" 1998; U et al" 2001 ; Liu et al" 20 02)、 BIM ELのオープンリーディングフレーム（597bp)は、これらのバリアントのエタ ソンを含んでいる。プローブ 4は、 BIM (BIM EL及び BIM L)の開始コドン（ATG) を含み、プローブ 2は BIMの終止コドン (TGA)を含んでいる。
[0078] 増幅は、サーマルサイクラ一 (Perkin- Elmer Corporation, Norwalk, CT)で行った。 P CRはタツチダウン PCR法 (Motegi et al., 2000)に従って行った。すなわち、変性（94 。C、 0. 5分）、ァニール (63°C、 0. 5分、 2サイクルごとに 1°C低下)及び伸長（72°C、 2. 5分）を 10サイクル行い、続いて、変性（94°C、 0. 5分）、ァニール（58°C、 0. 5分 )及び伸長（72°C、 2. 5分)を 25サイクル行い、さらに 72°C、 5分で最終伸長を行つ た。反応の基本的なァニール温度は 63°Cから 58°Cであった。全ての PCR産物は、 電気泳動で分離し、 QIA Quick (商標）ゲルェクストラクシヨンキット（Qiagen)により 精製した。精製した PCR産物に対する TAクローユングを pBluescriptll SK (-)を用い て実施して、 ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, VA)によりシークェンスした。ゲノム DNAサンプル 10 μ gを BamHl (プローブ 1及び 6)又は Hindlll (プローブ 2〜4)で 16時間消化し、その後、 0. 8%ァガロースゲル（1 xTBE)で電気泳動した。ゲルは、 0. 25MHC1に 30分間、 1. 5M NaCl/0. 5M NaOH【こ 30分 f¾、さら【こ、 0. 5M Tris (pH7. 4) /1. 5M NaCl【こ 30分 [¾、川頁次 浸漬した。電気泳動した DNAは、その後、 HybondN+メンブラン (Amersham Pharm acia Biotech, Tokyo, Japan)に移し洗浄し、 65°Cで [ α—32 P]dCTPで標識したプロ ーブ 1〜8とー晚ハイブリダィゼーシヨンさせた。その後、 2xSSC、次いで 65°Cで濃 度低下させた SSC— 0. 1% N—ラウリルサクロシンで洗浄し、最後に、 BioMax (商標 ) MSフィルム (EKC, Rochester, NY)に曝した。
[0079] 1 -6.ノザンブロット分析
ノザンブロットは、 7種の MCL細胞株、 Karpas231 (FCL)及び Raji (バーキットリン パ腫）に対して BIM ELcDNAを用いて実施した。ノザンブロットに用いたプローブは 、 RT— PCR法により以下のプライマーペア（配列番号： 25、 26)を用いて行った。 sense : 5 -atggcaaagcaaccttctgatgta-3
Antisense： 5 -tcaatgcattctccacaccaggcg-3
[0080] BIM ELの cDNA (オープンリーディングフレーム、 597bp)は胎児脳 cDNAから 調製した。全細胞 RNAdO /z g)を 1%ァガロース /0. 66Mホルムアルデヒドゲルで サイズ分画し、 Hybond+ナイロンメンブラン (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, J apan)に移した。メンブランは 42°Cで [ α—32 P]dCTPで標識したプローブとー晚ハイ ブリダィゼーシヨンさせた後、洗浄し、最後に、 BioMax (商標） MSフィルム (EKC, Roch ester, NY)に曝した。
[0081] 1 - 7.蛍光インサイトウハイブリダィゼーシヨン
間期染色体をパラフィン包埋サンプル (G468)及び細胞株から調製した。二色 FIS H分析を既報（Nomura et al. , 2003 ; Zhang et al. , 2004)に従って行った。 プローブはプローブ A： BAC438K19 (緑）とプローブ B： BAC368A17 (赤）を用い た。
[0082] 2.結果
2- 1. MCL患者サンプル及び細胞株のゲノムプロファイル
患者サンプル (G468)と SP— 53細胞株の高解像度解析の代表例を図 la及び図 1 bにそれぞれ示す。アレイ CGHは、増幅及び欠損について小さい領域も染色体全体 の領域も検出することができたほか、増幅と欠損との境界領域の輪郭も検出すること ができた。公知の腫瘍遺伝子を含むクローンに起因する小さい単位複製配列は、そ れが小さ!/、ホモ接合性欠損であるかのように容易に検出された。
[0083] 2-2. MCL患者サンプルにおけるゲノム不均衡
29例の患者サンプルの全てによって示された遺伝子材料の増幅又は欠損につい てデータ解析した。全ての腫瘍セットは、平均でゲノム中 130.6Mb、すなわち、その 4.6%においてコピー数の増加が生じており、平均で 250.6Mb、すなわち、その 8 .8%でコピー数の減少が生じていた。こうした変化は、増幅については平均して 3. 8領域、欠損については平均して 7.3領域であった。コピー数変化、すなわち、増幅 と欠損にっ 、てのゲノム全体での頻度を図 2に示す。
[0084] 増幅が頻発性 (recurrent gain) (5例以上）の領域は、染色体の 3ql3. Il〜q29, 6p21.32〜p25.3, 7pl4.3〜p22.3, 8ql3.2〜q24.22, 10pl2. I〜pl2. 2及び 17q23.2〜q24.1であり、欠損が頻発性（5例以上）の領域は、 1ρ36.23〜 p36.32, lpll.2〜p31.3, lq42.2〜(！ 43, 2pll.2, 2ql3, 5q21. I〜q23. 1, 6ql6.2〜q27, 8pl2〜p23, 9p24.3〜q31.1, 10pl2.31〜pl5.3, llq 14.3〜q23.2, 13ql3.2〜q34, 15ql3〜q21.1, 17pll.2〜pl3.3, 19pl 3.2〜pl3.3及び 22ql2. I〜ql3. Uこあった。また、最も頻度の高 ヽ不均衡 ίま、 増幅【こつ ヽて ίま、染色体の 3q26.1 (48%) , 7ρ21.1〜ρ21.2(34%), 6p25.3 (24%) , 8q21.3〜q24.21(24%), 10pl2. I〜pl2.2(21%)及び 17q23.2 〜q24.1(170/0)であり、欠損【こつ!/ヽて ίま、 2pll.2(83%), llq22.3〜q23. 1( 59%), 13ql4.3〜q21.1(55%), lp21.3〜p22.1 (52%) , 13q34(52%), 9q22.33〜q31. 1 (45%) , 17pl3.3(45%), 9p21.3〜p22. 1(41%), 9p24 .2〜p24.3(41%), 6q23.2〜q24.1 (38%) , lp36.23〜p36.32(31%), 8 p23. I〜p23.3(34%), 10pl4〜pl5.3(31%), 19pl3.2(28%), 5q22.1 〜q22.3(21%), 22ql2.2(21%), lq42.2〜q43(17%)及び 2ql3(17%)で あった（表 1)。頻発性の欠損である 1ρ36.23〜p36.32, lq42.2〜q43, 2pll. 2, 2ql3, 17pl3.3及び 19pl3.2〜pl3.3iまこの研究【こお!ヽて ίまじめて同定さ れたものである力 他の増幅領域は、既に MCLについて CGHを用いた報告に掲載 されたものであった。
[0085] 表 1
Figure imgf000029_0001
-
-
-
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- 卜
- 卜
[0086] 表 1 ゲノム上のゲイン及びロスの頻発性領域及び最高頻度の領域。ゲイン又はロス の領域は、ゲイン又はロスを示すクローンが少なくとも 3つ連続するか又は連続してい なくとも高コピー数 (log比〉 + 1. 0)又はホモ接合性ロスを示すクローンと定義した a:頻発性領域は 5例以上において認められた領域と定義されている。 b :ゲイン又 はロスの最高頻度領域は、頻発性領域中最も高頻度な領域と定義された。 c :領域は 、染色体上の位置に基づいて配列されている。 d : Sanger Center Institute, February 2004 versionに基づく。 e :最高頻度領域における最高頻度のゲイン又はロスを示し たクローンの例である。最高頻度のゲイン又はロスを示したクローンが最高頻度領域 内で同率のゲノム異常のときには、腫瘍関連遺伝子を含むクローンをそうでないクロ ーンよりも上に示す。 f:代表的クローンに含まれる遺伝子。
高いレベルの増幅が頻発性である領域 (log比 > + 1. 0)力 0pl2. 2 (2例、 BMI
2
— 1遺伝子座）にあり、ホモ接合性欠損のある頻発性領域 (log比く— 1. 0)は、 2pl
2
1. 2 (3 , Ig κ
Figure imgf000030_0001
Uこあった。表 2【こ示すよう【こ、 9p2 1〜ρ24における最も頻発性のホモ接合性欠損クローンは、 RP11 - 14912 (5例）で あり、このクローンは、 pl6INK4a腫瘍抑制遺伝子を含んでいた。
表 2
-
[0088] 表 2 ホモ接合性欠損（log比 < 1. 0)を示す BACクローンを示すリスト。 a：染色
2
体上の位置に基づ 、て配列されて 、る。 b： 2例以上のホモ接合性欠損を示す患者 数。 c : 2例以上のホモ接合性欠損を示す細胞株数。 d :ホモ接合性及びへテロ接合 性欠損 (log比く— 0. 2)を示す数。
2
[0089] X染色体上の 59クローンの全ては、性差のために別個に分析したが、 17例の男性 患者につ 、てのみゲノム変化を分析した。 2例が Xq28にお 、て低頻発性のコピー数 増カロ力 Sあり、 Xp21. 3〜Xp22. 3、特には、 Xp22. 31〜Xp22. 32において、へテ 口接合性 (2例)又はホモ接合性 (5例）の欠損があった。
[0090] 2- 3. MCL細胞株におけるゲノム不均衡
ゲノム不均衡は、一般に患者においてよりも MCL細胞株においてより頻繁に生じる 。 f列; 1ί 、 7P21&び 8q240ヽずれ η= 3、 430/0)の増幅 &び 9P21&び l lq220ヽ ずれも n=6、 86%)、 1ρ22 (η= 5、 71%)及び 6q、 8p23及び 13q21 (全て n= 3、 4 3%)の欠損は患者サンプルよりも MCL細胞株においてより高頻度に検出された。
[0091] 高レベルの増幅のある頻発性領域は、 13q31. 3 (n= 2、 C13orf25遺伝子座）及 び 18q21 (n= 2、 BCL遺伝子座）に検出された。表 2に示すように、ホモ接合性欠損 のある頻発性領域は、 9p21. 1〜ρ24. l、2pl l. 1及び 2ql3において見出された 。表 2は、患者サンプル及び細胞株におけるホモ接合性欠損クローンをリストしている 。 3つの細胞株（SP— 53、Z— 138及び Jeko— 1)は、 2ql3のホモ接合性の欠損（lo g比く一 1. 0)を示す一方、 2つの細胞株（REC— 1、 NCEB— 1)は、 2ql3におい
2
てへテロ接合性欠損 2ql3 (— 1く log比く— 0. 2)を示した。 2ql3の欠損を伴う 5
2
例の患者サンプルは、同様にへテロ接合性欠損を示した。患者サンプル (G468)及 び細胞株 SP— 53、 Z— 138及び jeko— 1の各第 2染色体の部分的なゲノムプロファ ィルを図 3に示す。 2qにおいて最も欠損の大きい座は、 BAC RP11— 438K19 (B AC438K19)にあり、この BACは二つの遺伝子 BIM及び ACOXL (Acyl— CoAデ ヒドロゲナーゼ遺伝子）を含んでいる。前者は、 BH3— only、 Bel— 2ファミリーメンバ 一タンパク質であって、アポトーシスを促進する (0， Conner et al.， 1998)力 後者の 機能は知られて 、な 、。ホモ接合性欠損を有する 2ql3における標的遺伝子にっ ヽ て何ら情報がないため、次に、 2ql3の欠損の最小限共通領域を探索して標的遺伝 子候補を検出する手が力りを得ることとした。
[0092] 2-4.サザンブロット分析
2ql3における欠損の標的遺伝子を検出するため、 7種の MCL細胞株について 6 種のゲノムプローブを用いてサザンブロットを実施した。ゲノムプローブは、 BAC438 K19のゲノム DNAに基づ!/、てデザインした（図 4a)。プローブ 1〜6を用いた分析は 、 BIMの一部のェクソンが 3つの細胞株 SP— 53、 Z— 138及び Jeko— 1において共 通して欠損して 、ることを示し、ホモ接合性欠損の最小限共通領域は BIM遺伝子座 にあって ACOXL遺伝子座でないことを示した（図 4b)。なお、最小限共通領域とは、 ある領域に異常を有する MCL細胞株における異常である領域を意味して 、る。これ らの細胞株の 2ql3のホモ接合性欠損の最小限共通領域は、少なくともプローブ 2か ら 3 (15kb)にわたつており、多くてプローブ 1からプローブ 4 (45kb)にわたつている。 [0093] NIBC、 Ensembl Genome Data Resources及び UCSC Genome Bioinfomaticsによれ ば、この領域は、 BIM遺伝子のオープンリーディングフレームを含んでいる力 他の 遺伝子を含んでいない。サザンブロット分析を BAC、 RP11— 368A17 (プローブ 7) 由来のプローブ及び BAC、 RP11 - 537E18 (プローブ 8)を用いて 7種の MCL細 胞株について行った。 BAC、 RP11 - 368A17 (BAC368A17)は、 BAC438K19 に対して 1. 55Mbテロメリックなクローンであり、 BAC, RP11 - 537E18 (BAC537 E18)は、 BAC438K10に対して 1. 85Mbセントロメリックなクローンである。プロ一 ブ 7及び 8のバンドは、全ての MCL細胞株において陽性であり（データ示さず。）、各 細胞株（SP— 53、 Z— 138及び Jeko— 1)のホモ接合性欠損領域は、最大でも 3. 4 Mbであることがわかった。さらに、使用可能な患者サンプルについてもサザンブロッ ト分析を行ったところ（図 5a)、 2ql3においてヘテロ接合性の欠損パターンを見出し た。
[0094] 2- 5.ノザンブロット分析
MCL細胞株で BIM遺伝子の発現を確認するために、 7種の MCL細胞株、 FCL 細胞株 (Karpas231)及びバーキット細胞種株 (Raji)につ!/、てノザンブロット分析を 行った。図 4cに示すように、 BIM遺伝子の 3種の転写物である一つの強力なバンド（ 5. 7kb)及び二つの ¾ ヽノ ンド（3. 8kb、 1. 35kb)力 Granta519、 JVM2、 Karp as231及び Rajiに観察され、一方、全く発現のないあるいは非常に弱い発現が SP — 53、 Z— 138、 Jeko— 1、 REC— 1及び NCEB— 1細胞株で観察された。 REC— 1及び NCEB— 1について、アレイ CGHでは 2q 13にお!/ヽてヘテロ接合性のパター ンを示しているが、ノザンブロット分析では、遺伝子量的効果によってこれらの 2種の 細胞株における BIM遺伝子の mRNAでは明らかに抑制されて!、ることを示した。 BI M遺伝子は、 2ql3における遺伝子欠損を全く認めなかった Granta519及び JVM2 においては、 BIM遺伝子は、通常通り発現されていた。
[0095] 2-6.蛍光インサイトウハイブリダィゼーシヨン
BAC438K19及び BAC368A17 (BAC438K19に対して 1. 55Mbテロメリック） の組み合わせ及び BAC438K19及び BAC537E18 (BAC438K10に対して 1. 8 5Mbセントロメリック）の組み合わせで 3種の MCL細胞株（SP— 53、 Z— 138及び je ko— 1)及び患者サンプル（G468)に対して二色 FISHを実施した。これら 3種のクロ ーンは隣接してアレイ CGHのガラススライド上においた。患者サンプル（G468)に対 する BAC438K19及び BAC368A17の二色 FISHの結果を図 5bに示す。これら 3 種の細胞株の FISHの結果 (データ示さず。）は、アレイ CGHデータとよく整合してい た。すなわち、 i) SP— 53細胞株においては、 BAC438K19について何らのシグナ ルも検出されなかったが BAC368A17のシグナルが二対、 BAC537E18シグナル がー対観察され、 BAC438K19クローン (log比 =— 2. 74)のホモ接合性欠損を示
2
していた。 ii) Z— 138細胞株では、弱い BAC438K19シグナルが一対観察されたが 、正常な BAC368A17シグナルが二対又は正常な BAC537E18シグナルが一対 観察され、この細胞株での BAC438K19内部欠損（log比 =— 1. 71)を示唆して
2
いた。 iii)jeko— 1細胞株では、弱い BAC438K19シグナルが一対観察されたが、 正常な BAC368A17シグナルが二対又は正常な BAC537E18シグナルが一対観 察され、この細胞株での BAC438K19内部欠損（log比 =— 1. 76)を示唆していた
2
。これらの結果は、 SP— 53細胞株における全体的な BAC438K19欠損と Z— 138 細胞株及び jeko— 1細胞株における BAC438K19の部分的なホモ接合性欠損と整 合する。
3.考察
ここに報告する研究において、 MCLの全ゲノムにおいて高解析解像度のコピー数 変化のマッピングが達成された。増幅及び欠損の頻度は、アレイ分析によって高解 析解像度で同定され、ゲノム異常の正確なマッピングが可能となった。 MCLのゲノム 上の多数の変化はアレイ CGHによって同定された力 その多くは、染色体 CGH (従 来型 CGHともいう。 )によるものと同一であった。幾人かの著者ら (Monni et al.， 1998; Bea et al, 1999; Bentz et al., 2000; Martinez- Climent et al, 2001; Allen et al, 200 3)は、増幅頻発'性領域として、 3q (40- 70%) , 6p (20%) , 7p (27%) , 8q (20— 3 0%) , 10p (20%) , 12q (20- 30%) , 18q21 (20%)を報告し、そして、欠損頻発 性領域として、 lp (24- 33%) , 6q (27- 37%) , 8p (20- 30%) , 9p (16- 30%) , l lq (22— 30%)及び 13q (40— 60%)を報告している。しかしながら、アレイ CGH によって同定されるゲノム異常の発生率は一般的に染色体 CGHにより同定されるも のよりも高いとされている。例えば、本実施例では、 1ρ21〜ρ22 (52%)及び 9p21 ( 41 %, INK4ZARFlocus)のほ力 l lq22 (55%, ATMlocus)において、染色体 C GHによって過去に検出されていた対応する欠損よりも高頻度となっている。こうした 高頻度な欠損のなかでも、 1ρ22の標的遺伝子候補は同定されていないが、我々の アレイ CGH分析は、 1ρ21. 3〜p22. 1の 5. 8Mb内に最も高頻度な欠損があること を示した。
[0097] 近年、コールハマー（Kohlhammer )とその共同研究者ら力 ガラススライド上に 812 の人工染色体をスポットしたアレイを用いた (マトリックス) CGHによる 49例の患者に ついての結果を報告したが (Kohlhammer et al., 2004)、染色体 CGHデータに比べて より高頻度な MCLのゲノム変化を見出した。かれらの患者の特徴 (例えば、ステージ IIIZIVのパーセンテージ、全身状態の不良、高い LDHレベル、白血病性 MCL及び リンパ節外への転移）はほとんど我々の患者のそれと同一であるほか、ゲノム上の変 化の頻度も同様であった。し力しながら、彼らは、我々が検出したいくつかの欠損領 域、例えば、 lp36, lq42. 2-q43, 2pl l . 2, 2ql3, 17pl3. 3及び 19pl3. 2— pl3. 3を検出できな力つた。これは、彼らのクローンが全ゲノムにわたって選択され ていな力つた力もである。したがって、我々の研究成果における高解析解像度は、ゲ ノム全体力 無作為に人工染色体クローンを選択したことによるものであろう。
[0098] 我々の研究によって見出されたる新規な 6箇所の欠損領域のなかでも、 17pl3. 3 の欠損は、興味深いことにも 17pのアレイ CGH解析において最も高頻度な欠損を示 したという点において特筆すべきである。このことは、 TP53遺伝子から離れた部位に 他の腫瘍抑制遺伝子が存在することを示唆している。 TP53遺伝子座とは独立した 1 7pl3. 3における頻発性のアレル欠損は、肺癌、胸部癌、卵巣癌、肝細胞癌のほか 神経腫瘍など様々なヒト悪性腫瘍において見出されてきている (Fujimori et al, 1991; Cogen et al., 1992; Saxena et al., 1992; Phillips et al., 1996; Schults et al., 1996; Konishi et al., 2002)。 MCLにおける TP53変異がよく知られたゲノム変化であり、様 々な細胞変異や悪い予後と関連していたとしても（Greiner et al., 1996; Hernandez e t al, 1996)、我々の知見は、 17pl3. 3における他の腫瘍抑制遺伝子がリンパ腫の 発症に関連して 、る力もしれな 、ことを示した。 [0099] アレイ CGHの高解析解像度の生物学的価値は、特定の発ガン遺伝子や腫瘍抑制 遺伝子を含んで 、る力もしれな 、少な 、レベルや高レベルの増幅コピー数、ホモ接 合性欠損を検出できるところにある。高度にコピー数が高い頻発性領域は 10pl2. 2 (BMI- 1) , 13q31. 3 (C13orf25)及び 18q21 (BCL2)として同定されてきている ( Bea et al, 2001; Ota et al, 2004; Hoftnann et al, 2001; Martinez et al, 2003)。両 アレル (ホモ接合性)欠損は、
Figure imgf000035_0001
、染色体上の領域 であることの特徴であるため (Kundson 1971), 2pl lや 2ql3及び 9p21— 24における ホモ接合性の欠損領域を検知することは重要である。 2pl lにおける欠損はィムノグ ロブリン遺伝子の再配列に起因する力 9p21— p24の欠損は、おおよそ 15Mbにも わたっており、この領域が最も高頻度なホモ接合性の欠損クローン RP11— 14912を 含んでいたとしても責任遺伝子を同定するのは困難である。このクローンは、 MCLの このホモ接合性欠損領域の候補遺伝子である pi 6INK4 遺伝子を含んで!/ヽる (Dreylin g et al., 1997; Pinyol et al., 1997)。
[0100] これら 3つのホモ接合性欠損領域のうち 2ql3の標的遺伝子についてはこれまで何 らの報告もされていないが、我々の結果は、 2ql3の欠損の最小限共通領域は、 BI M遺伝子のェクソンの一部を含むが他の遺伝子や ESTsを含んで!/ヽな 、ことを示し た。このことは、 BIM遺伝子がこの欠損領域の責任遺伝子である可能性が高いことを 示唆している。近年、アポトーシスに関連する代謝経路の障害も MCLの発症に寄与 することが知られるようになってきている (Hoftnann et al., 2001; Martinez et al., 2003) 。他の研究は、 BIM遺伝子がプロアポトーシス作用のある BCL2ファミリーのメンバー であり、特に造血システムにおいて BCL2の主要な生理学的なアンタゴ-ストであると しているし（Bouillet et al., 2002),エンダーら（ Enders et al.)は最近、 BIM遺伝子を 欠損する Bリンパ球は、試験管内で B細胞レセプターとの結合によって誘導されるァ ポトーシスに抵抗性であることを報告している（Enders et al, 2003)。最後に、エグレ ら（ Egle et al.)は、 Bim— Z—及び Bim + Z— Ε — Myc miceを用いて、 BIM遺 伝子の欠損は、腫瘍形成の始まりであるとしている (Egle et al, 2004).これらの知見 は 、ずれも強く BIM遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆して 、る。
[0101] 我々は、 MCL細胞株における 2ql3の最小限共通領域が BIM遺伝子座に存在し ていることを示した。さらに、我々は、 7種の MCL細胞株中の 5種の細胞株において BIM遺伝子の発現が抑制されている力 2ql3の欠損のない 2種類の MCL細胞株 では BIM遺伝子が正常に発現していることを確認した。これらの結果は、 BIM遺伝 子が 2ql3の欠損の責任遺伝子の最も適切な候補でありその発現抑制が MCLの腫 瘍形成に寄与しているであることの強力な根拠となる。
[0102] 要約すると、 MCLの詳細な研究のための高解像度なアレイ CGHの利用によれば 、ゲノム異常を正確に同定できるとともに、 MCLにおける新規な腫瘍サブレッサーと しての BIM遺伝子を同定することができる。
[0103] [実施例 2]
(MCLゲノム異常と予後との関係）
実施例 1と同様の 29症例の MCL検体に対して予後との関連を調べた。特定クロー ンのゲイン又はロスについての予後曲線を図 6に示す。すなわち、 29症例について 特定のゲイン又はロスと予後（生存状況）との関係を力プラン マイヤー生存曲線と口 グランク検定を用いて調べた。図 6に、力プラン マイヤー生存曲線を示す。横軸は 生存日数、縦軸は生存率を示す。図 6に示すように、 6p21 (BAC, RP11 -60O19 )ロスを有する症例（6症例）は、有しない症例（23症例）よりも予後が有意に良好 (P =0. 0152)であった。また、 8p23 (BAC、RPl l— 240A17)ロスを有する症例（9 症例）は有しない症例（20症例）よりも予後が有意に不良（P = 0. 0001)であり、 8q2 4 (RP11 1136L8)ゲインを有する症例（5症例）は有しな 、症例（24症例）よりも有 意に予後が不良（P = 0. 0084)であった。 6q21及び 8p23の原因遺伝子は不明で あるが、本実施例によれば、 8q24の原因遺伝子力 C— MYCであると強く示唆され る。なお、 lp22、 9p21、 l lq21、 13q21などの高頻度に欠損力ある領域におけるゲ ノム異常と予後との関連では有意差がな力つた。
[0104] 以下の参考文献に記載の全内容は、引用により本明細書の一部に組み込まれる。
参考文献
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[0105] また、本発明は 2004年 12月 3日に米国に出願された米国仮出願番号 60/6327 08、および 2005年 9月 300〖こ米国【こ出願された米国仮出願番号 60/722007を 優先権主張の基礎としており、引用によりその内容のすべてが編入される。 産業上の利用可能性
[0106] 本発明は、悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫の診断や予後診断に利用できる 配列の説明 配列番号: 3〜
配列番号: 9 ：
配列番号: 10 プローブ 1のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 11 プローブ 2のためのセンスプライマー 配列番号: 12 プローブ 2のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 13 プローブ 3のためのセンスプライマー 配列番号: 14 プローブ 3のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 15 プローブ 4のためのセンスプライマー 配列番号: 16 プローブ 4のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 17 プローブ 5のためのセンスプライマー 配列番号: 18 プローブ 5のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 19 プローブ 6のためのセンスプライマー 配列番号: 20 プローブ 6のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 21 プローブ 7のためのセンスプライマー 配列番号: 22 プローブ 7のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 23 プローブ 8のためのセンスプライマー 配列番号: 24 プローブ 8のためのアンチセンスプライマー 配列番号: 25 RT— PCRのためのセンスプライマー 配列番号: 26 RT— PCRのアンチセンスプライマー

Claims

請求の範囲
[I] ヒト 1番染色体 p36. 23〜p36. 32、ヒト 1番染色体 q42. 2〜q43、ヒト 2番染色体 p 11. 2、ヒト 2番染色体 ql3、ヒト 17番染色体 pl l. 2〜pl3. 3及びヒト 19番染色体 pi 3. 2〜pl3. 3から選択される 1種又は 2種以上における欠損又は変異を検出するェ 程を備える、悪性腫瘍の診断方法。
[2] 前記悪性腫瘍は悪性リンパ腫である、請求項 1に記載の診断方法。
[3] 前記検出工程の検出結果に基づいて前記悪性リンパ腫の病型を判定する病型判 定工程を備える、請求項 1又は 2に記載の診断方法。
[4] 前記病型判定工程における前記病型はマントル細胞リンパ腫である、請求項 3に記 載の診断方法。
[5] ヒト 2番染色体 ql3の塩基配列における欠損又は変異を検出する検出工程を備え る、
請求項 1〜4のいずれか〖こ記載の悪性腫瘍の診断方法。
[6] 前記検出工程は、 BIM遺伝子の欠損又は変異を検出する工程である、請求項 5に 記載の診断方法。
[7] 前記検出工程における検出結果に基づいて前記悪性腫瘍の治療反応性を判定す る治療反応性判定工程を備える、請求項 5又は 6に記載の診断方法。
[8] 前記検出工程は、 BAC RP11— 438K19の 35027bp力も 49920bp、配列番号 1 に記載の塩基配列の 394位〜 597位及び配列番号 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位のいずれかにおける欠損又は変異を検出する工程である、請求項 5〜7のい ずれかに記載の診断方法。
[9] 前記検出工程は、検体中の BIM遺伝子、 BIM遺伝子から発現する mRNA及び c DNAのいずれかを利用する工程である、請求項 5〜8のいずれかに記載の診断方 法。
[10] 前記検出工程は、 PCR法、 RT— PCR法、核酸ハイブリダィゼーシヨンを実施する 工程を含んでいる、請求項 9に記載の診断方法。
[II] 前記検出工程は、 BIM遺伝子の少なくとも一部に相補的な 1種又は 2種以上のプ ローブを備えるアレイ上において該プローブと検体力 得られる核酸試料とをハイブ リダィズする工程を含んで 、る、請求項 9に記載の診断方法。
[12] 前記検出工程は、アレイ CGH法を実施する工程である、請求項 1〜11のいずれか に記載の診断方法。
[13] 前記検出工程は、 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、発現 量又は変異を検出する工程である、請求項 5〜8のいずれかに記載の診断方法。
[14] BIM遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドである、悪性腫瘍診断用マーカー。
[15] 前記 BIM遺伝子のタンパク質翻訳領域は配列番号 1又は配列番号 2に記載の塩 基配列を有する、請求項 14に記載の診断用マーカー。
[16] 配列番号 1に記載の塩基配列の 394位〜 597位若しくは配列番号 2に記載の塩基 配列の 214位〜 417位の少なくとも一部又はこれに相補的な塩基配列を有するポリ ヌクレオチドである、請求項 14に記載の診断用マーカー。
[17] プローブ又はプライマーとして使用される請求項 14〜16のいずれかに記載の診断 用マーカー。
[18] BIM遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対する 抗体である、悪性腫瘍診断用マーカー。
[19] 悪性腫瘍の診断用アレイであって、
ヒト 2番染色体 ql3における欠損又は変異を検出するための核酸プローブを固定し たアレイ。
[20] 前記核酸プローブは、 BIM遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プロ一 ブである、請求項 19に記載の診断用アレイ。
[21] 前記核酸プローブは、配列番号 1に記載の塩基配列の 394位〜 597位若しくは配 列番号 2に記載の塩基配列の 214位〜 417位の少なくとも一部又はこれらに相補的 な塩基配列を有している、請求項 19に記載の診断用アレイ。
[22] 請求項 1〜： L 1のいずれかに記載の診断方法のための診断用キットであって、
BIM遺伝子の欠損又は変異を検出するための核酸プローブを含む、
診断用キット。
[23] マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、 BIM遺伝子のコード領域又は該 BIM遺伝子によってコードされるタンパク質の活 性を有するホモログタンパク質のコード領域を有する DNA構築物を含有する医薬組 成物。
[24] マントル細胞リンパ腫の治療用医薬組成物であって、
ΒΙΜ遺伝子によってコードされるタンパク質又は ΒΙΜ遺伝子によってコードされる タンパク質の活性を有するホモログタンパク質を含有する医薬組成物。
[25] マントル細胞リンパ腫の患者の予後の診断方法であって、
前記患者力 採取した試料について、ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27における欠損 若しくは変異、ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2における欠損若しくは変異及びヒト 8番染 色体 ql3. 2〜q24. 22における増幅若しくは変異を検出する工程を実施する、方法
[26] 以下の（a)〜（c)のいずれかの判定工程を実施する、請求項 25に記載の方法。
(a)ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27に欠損があるとき、予後が良好である。
(b)ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2に欠損あるとき予後が不良である。
(c)ヒト 8番染色体 ql3. 2〜q24. 22に増幅があるとき、予後が不良である。
[27] 前記検出工程は、前記染色体上の領域を含むプローブと前記患者から採取した前 記患者の核酸試料とをハイブリダィゼーシヨンにより前記欠損又は増幅を検出するェ 程を備える、請求項 25又は 26に記載の方法。
[28] 前記プローブは、 BACクローン及び Z又は PACクローンである、請求項 27に記載 の方法。
[29] BACクローン (RP11— 60019)、 BACクローン（RP11— 240A17)及び BACク ローン (RP11— 1136L8)又は PACクローン (RP1— 80K22)力ら選択される!、ず れかを用いる、請求項 28に記載の方法。
[30] 前記検出工程は、 c— MYC遺伝子の増幅又は変異を検出する工程である、請求 項 25又は 26に記載の方法。
[31] 前記検出工程は、 c MYC遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の有無、 発現量又は変異を検出する工程である、請求項 25又は 26に記載の方法。
[32] 前記検出工程は、固相担体上において行う、請求項 25〜31のいずれかに記載の 方法。
[33] マントル細胞リンパ腫の予後診断用アレイであって、
ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27、ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2及びヒト 8番染色体 ql3
. 2〜q24. 22を検出するためのプローブのいずれかを固定したアレイ。
[34] ヒト 6番染色体 ql6. 2〜q27、ヒト 8番染色体 pl2〜p23. 2及びヒト 8番染色体 ql3
. 2〜q24. 22を検出するためのポリヌクレオチドである、マントル細胞リンパ腫の予 後診断用マーカー。
[35] 前記ポリヌクレオチドは、 c MYC遺伝子若しくはその一部又はこれらに相補的な 塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項 34に記載のマーカー。
[36] c— MYC遺伝子によってコードされるタンパク質若しくはその一部又はこれらに対 する抗体である、マントル細胞リンパ腫の予後診断用マーカー。
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