JP6994776B2 - 微生物メタゲノム分析を通した乳癌の診断方法 - Google Patents

微生物メタゲノム分析を通した乳癌の診断方法 Download PDF

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Description

本発明は、微生物メタゲノム分析を通して乳癌を診断する方法に関し、より具体的には、被検体由来サンプルを利用して細菌、古細菌などの微生物メタゲノム分析を行って、特定細菌および古細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって乳癌を診断する方法に関する。
乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、乳房に発生するすべての悪性腫瘍を総称する。乳癌は、乳房に異常な細胞組織が継続して成長したり、他の臓器に広がる致命的な病気である。乳癌は、すべての癌の中で最も研究が多く行われているにもかかわらず、環境的要因および遺伝的要因の二つにより発生するという不明確な知識があるだけであり、まだ乳癌の発生原因に関しては、まだ確立された定説はない。ただし、様々な研究結果を通じていくつかの要因が高い相関関係を示しており、その中で、女性ホルモンであるエストロゲンが乳癌の発生過程で重要な役割をすることに意見が一致している。乳癌の発生原因を推測するような危険因子が知られているが、家族の中で両親や兄弟、娘が乳癌を病む場合、自分が乳癌にかかる危険度は１．７倍に増加し、特に閉経前に発生した乳癌の場合、２．４倍に増加し、家族の中で２人以上が両側乳癌であれば、９倍に増加すると報告された。外国の報告によれば、乳癌患者の約１０％が乳癌遺伝子（ＢＲＣＡ－１とＢＲＣＡ－２）を有する遺伝性乳癌である。この乳癌遺伝子を有するヒトは、５０才以前に６０％で、７０才まで８５％で乳癌が発生し、７０才まで６５％で卵巣癌も同時に発生し得る。
また、生殖ホルモンが長期間活性化すれば、乳管上皮細胞の発癌性突然変異によって乳癌が発生し得るが、特に初潮が早かったり（１２才以前）、閉経が遅れたり（５５才以後に２倍）、子供を産まなかった女性、３０代以後に初めての妊娠をした女性、授乳歴がない閉経前の女性、１０年以上避妊薬を服用した女性、閉経期に発生する顔面紅潮を治療したり、骨粗しょう症や心臓疾患を予防するためにホルモン補充療法を１０年以上最近まで受けている女性において危険であると知られている。その他、環境要因として飲酒、高脂肪食事（特にとうもろこし油やマーガリンなどの多不飽和脂肪と牛肉の飽和脂肪）、閉経後の女性の体重過多、放射線露出なども関連があると知られている。乳癌の好発年齢は、一般的に乳房陽性疾患より高く、平均年齢が韓国女性の場合、４５才であり、米国女性は、５５才であって、１０年の差異があるが、発生頻度が、年齢が高いほど増加する。
しかし、固形癌の中で最も多く研究が行われた癌にもかかわらず、まだ非侵襲的な方法で乳癌を予測する方法はなく、既存の診断方法では、乳癌などの固形癌が進行された場合に発見される場合が多いので、乳癌による医療費用と死亡を予防するためには、乳癌の発生および原因因子をあらかじめ予測して、高危険群において乳癌の発生を予防する方法を提供することが効率的な方法である。
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と病気に大きい影響を及ぼすものと知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが大概１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境で採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学と言え、微生物が存在する自然環境でのすべての微生物群集の総ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）を通称する意味であって、１９９８年にＪｏ Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎにより初めて使用された（Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５、Ｒ２４５－２４９）。最近、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とした方法でヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ｓリボソームＲＮＡの遺伝子である１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ） ｐｌａｔｆｏｒｍを利用して分析する。しかし、乳癌の発病において、血液または尿などの人体由来物から微生物由来小胞に存在するメタゲノム分析を通して乳癌の原因因子を同定し、乳癌を予測する方法について報告されたことがない。
本発明者らは、乳癌を診断するために、被検体由来サンプルである血清を利用して細菌および古細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、その結果、乳癌の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定したところ、これに基づいて本発明を完成した。
これより、本発明は、細菌および古細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通して乳癌を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されてない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、乳癌診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常な人由来サンプルと細菌および古細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
そして、本発明は、下記の段階を含む、乳癌の診断方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常な人由来サンプルと細菌および古細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
また、本発明は、下記の段階を含む、乳癌発病の危険度の予測方法を提供する。
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常な人由来サンプルと細菌および古細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
本発明の具現例において、前記段階（ｃ）でＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を血液で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明の具現例において、前記段階（ｃ）でＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、ＴＭ７－３、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｉａよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を血液で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を血液で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を血液で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＨｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を血液で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＴｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、ＴＭ７、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を尿で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、ＴＭ７－３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、および４Ｃ０ｄ－２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を尿で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＳｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、およびＹＳ２よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を尿で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＥｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆ１６、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を尿で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でＲａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ、およびＧｅｍｅｌｌａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を尿で比較して乳癌を診断するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記被検体サンプルは、血液または尿であってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記血液は、全血、血清、血しょう、または血液単核球であってもよい。
環境に存在する細菌および古細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、乳癌は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状であるので、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通して乳癌発病の危険度をあらかじめ予測することによって、乳癌の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、乳癌の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、乳癌と診断された患者でメタゲノム分析を通して原因因子の露出を避けることによって、癌の経過を良くしたり、再発を防止することができる。
図１ａは、マウスに腸内細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後に１２時間目に、血液および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。 図２は、乳癌患者および正常ヒトの血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図３は、乳癌患者および正常ヒトの血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図４は、乳癌患者および正常ヒトの血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図５は、乳癌患者および正常ヒトの血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図６は、乳癌患者および正常ヒトの血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図７は、乳癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図８は、乳癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図９は、乳癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１０は、乳癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１１は、乳癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
本発明は、細菌および古細菌メタゲノム分析を通して乳癌を診断する方法に関し、本発明者らは、被検体由来サンプルを利用して細菌および古細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、乳癌の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
これより、本発明は、（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌および古細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含む乳癌を診断するための情報提供方法を提供する。
本発明において使用される用語「乳癌診断」とは、患者に対して乳癌が発病する可能性があるか、乳癌が発病する可能性が相対的に高いか、または乳癌がすでに発病したか否かを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する乳癌発病の危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、乳癌を早期に診断して最も適切な治療方式を選択することによって治療を決定するために臨床的に使用することができる。
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝体の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体を言うものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血液および尿から分離した細菌由来細胞外小胞を利用してメタゲノム分析を実施した。
本発明において、前記被検体サンプルは、血液または尿であってもよく、前記血液は、好ましくは全血、血清、血しょう、または血液単核球であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の実施例では、前記細菌および古細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に乳癌の発生原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、ＴＭ７－３、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｉａ綱細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、ＴＭ７、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、ＴＭ７－３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、および４Ｃ０ｄ－２綱細菌由来 細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、およびＹＳ２目細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆ１６、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ科細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来尿サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ、Ｇｅｍｅｌｌａ属細菌由来細胞外小胞の含量が乳癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
本発明は、前記のような実施例結果を通じて、血液および尿から分離した細菌由来細胞外小胞に対してメタゲノム分析を実施することによって、正常ヒトと比較して乳癌患者で含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定し、メタゲノム分析を通して前記各レベルで細菌由来小胞の含量増減を分析することによって乳癌を診断することができることを確認した。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例］
実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示したように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）である場合には、全身的に吸収されないが、細菌由来小胞（ＥＶ）である場合には、投与後に５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、および筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示したように、前記腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、各臓器に吸収されていない反面、前記腸内細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉に分布することを確認した。
実施例２．血液および尿から小胞分離およびＤＮＡ抽出
血液および尿から小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに血液または尿を入れ、遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて、上澄み液だけを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
前記方法によって血液および尿から分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを利用してＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
Figure 0006994776000001
実施例３．血液および尿から抽出したＤＮＡを利用したメタゲノム分析
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用してＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングをし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＤＮＡシークエンスデータベース（１０８、４５３シークエンス）を利用して９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
実施例４．血液から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤乳癌診断模型
前記実施例３の方法で、乳癌患者９６人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト１９２人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
血液内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表２および図２参照）。
Figure 0006994776000002
血液内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、ＴＭ７－３、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｉａ綱細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表３および図３参照）。
Figure 0006994776000003
血液内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表４および図４参照）。
Figure 0006994776000004
血液内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓ２４－７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表５および図５参照）。
Figure 0006994776000005
Figure 0006994776000006
Figure 0006994776000007
血液内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表６および図６参照）。
Figure 0006994776000008
Figure 0006994776000009
Figure 0006994776000010
実施例５．尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤乳癌診断模型
前記実施例３の方法で、乳癌患者１２７人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト２２０人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ－ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、ＴＭ７、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表７および図７参照）。
Figure 0006994776000011
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、ＴＭ７－３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、および４Ｃ０ｄ－２綱細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表８および図８参照）。
Figure 0006994776000012
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、およびＹＳ２目細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表９および図９参照）。
Figure 0006994776000013
Figure 0006994776000014
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆ１６、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ科細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１０および図１０参照）。
Figure 0006994776000015
Figure 0006994776000016



Figure 0006994776000017
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ、およびＧｅｍｅｌｌａ属細菌バイオマーカーで診断模型を開発したとき、乳癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１１および図１１参照）。
Figure 0006994776000018
Figure 0006994776000019
Figure 0006994776000020
上記に記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
本発明による人体由来サンプルを利用した細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通して乳癌発病の危険度をあらかじめ予測することによって、乳癌の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、乳癌の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、乳癌と診断された患者においてメタゲノム分析を通して原因因子の露出を避けることによって、癌の経過を良くしたり、再発を防止することができる。

Claims (2)

  1. （ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
    （ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと比較して
    被検体の血液サンプルから分離したバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したＢａｃｔｅｒｏｉｄｉａ、または、被検体の尿サンプルから分離した４Ｃ０ｄ－２綱細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したバクテロイダレス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）、エンテロバクテリアレス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、被検体の血液または尿サンプルから分離したビフィドバクテリアレス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、および被検体の尿サンプルから分離したオケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、ＹＳ２よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したポルフィロモナダシエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、クロストリジアセエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、ベイロネラシエ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、エンテロバクテリアシエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、Ｓ２４－７、被検体の血液または尿サンプルから分離したリケネラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、バクテロイダシエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリアシエ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、被検体の尿サンプルから分離したＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、、ペプトストレプトコッカシエ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アセトバクテラシエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、およびメチロシスタシエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来小胞；または
    被検体の血液サンプルから分離したジアリスタ（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ、ファスコラルクトバクテリウム（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、被検体の血液または尿サンプルから分離したＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、被検体の尿サンプルから分離したトラブルシエラ（Ｔｒａｂｕｌｓｉｅｌｌａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）、およびメチロピラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来小胞の含量が増加しているか、
    被検体の血液または尿サンプルから分離したフソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、被検体の尿サンプルから分離したテネリクテス（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、アルマティモナデテス（Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ウェルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、およびＴＭ７よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したアルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、被検体の血液または尿サンプルから分離したクロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、フソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、ＴＭ７－３、被検体の尿サンプルから分離したモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、フィンブリイモナジア（Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ）、およびヴェルコミクロビエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したフィンゴモナダレス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、ロドスピリラレス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、アクチノミセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、バシラレス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）、カウロバクテラレス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、被検体の血液または尿サンプルから分離したフソバクテリアレス（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、シュードモナダレス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、被検体の尿サンプルから分離したストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、ＲＦ３９、フィンブリイモナダレス（Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ）、およびウェルコミクロビアレス（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来小胞；
    被検体の血液サンプルから分離したスタフィロコッカシエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカシエ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ブレビバクテリアシエ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロバクテリアシエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナダシエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ナイセリアシエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、イントラスポランギアシエ（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、カウロバクテラシエ（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、被検体の血液または尿サンプルから分離したフソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、リゾビアセエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ノカルディアシエ（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、モラクセラシエ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）、シュードモナダシエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、被検体の尿サンプルから分離したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、フィンブリイモナダセアエ（Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、カルノバクテリアシエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、セルロモナナダシエ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、Ｆ１６、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、および、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来小胞；または
    被検体の血液サンプルから分離したヒドロゲノピルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンヒドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）、被検体の血液または尿サンプルから分離したフソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、
    被検体の尿サンプルから分離したレプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、モガネルラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、テトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、オリバクテリウム（Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フィンブリイモナス（Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびアッケルマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、
    乳癌と判定する段階を含む、
    メタゲノム分析を通して乳癌判定のための情報提供方法。
  2. 前記血液は全血、血清、血しょう、または血液単核球であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
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