CN109234187B - 一株莠去津降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株莠去津降解菌及其应用，该菌株为Methylopila sp.Y6X‑2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15919。本发明菌能够降解莠去津，可应用于莠去津污染环境治理修复技术领域。

Description

一株莠去津降解菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株莠去津降解菌及其应用。
背景技术
莠去津的杀草谱较广，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，尤其对玉米有较好的选择性(因玉米体内有解毒机制)，我国在70年代开始生产并大规模应用。但莠去津具有明显的“三致”作用，可引起雄蛙雌化，美国、欧盟和日本均已将其列入内分泌干扰化合物名单，长期暴露于莠去津能引起人类和其他动物种类的健康风险。目前关于莠去津的药害，除了预防，还可以采用生物修复方法对污染环境进行治理，因此获得莠去津降解菌株用于污染环境治理修复具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株莠去津降解菌及其应用。
本发明采用的具体方案为：
本发明提供了一株莠去津降解菌，该菌株为Methylopila sp.Y6X-2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15919。
本发明还提供了上述莠去津降解菌的应用，将所述的莠去津降解菌接种于莠去津污染环境中，进行治理修复。
本发明还提供了一种菌剂，该菌剂的活性成分为上述莠去津降解菌。
本发明还提供了上述菌剂的应用，将所述的菌剂接种于莠去津污染环境中，进行治理修复。
本发明所具有的有益效果：
本发明菌能够降解莠去津，可应用于莠去津污染环境治理修复技术领域。
附图说明
图1为莠去津降解菌Y6X-2的PCR产物电泳图；
图2为菌株Y6X-2与相关种的16S rDNA序列系统发育树。
菌株保藏
本发明Methylopila sp.Y6X-2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.15919，保藏日期：2018年6月8日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：莠去津降解菌Y6X-2的分离
将天津蓟州区良种试验场莠去津污染的土样按5％的量加入灭菌的100ml含有200mg/L莠去津液体富集培养基中，在30℃、150rpm振荡培养。培养7d后从培养液中取出5ml转入100mL新鲜的含有200mg/L莠去津富集培养基中，在30℃、150rpm振荡培养。再次培养7d后从培养液中取出5ml转入100mL新鲜的含有200mg/L莠去津富集培养基中，在30℃、150rpm振荡培养。继续培养7d后取培养液逐级稀释，涂布于添加200mg/L莠去津的固体富集培养基平板上，30℃培养一段时间后，将能产生透明圈的菌落分离出来进行纯化。纯化得到菌株Y6X-2。
其中液体富集培养基：将莠去津(97％，购自国药集团化学试剂有限公司)配成10g/L的甲醇储备液，经0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。配制培养基时，按浓度取储备液于一个灭菌的三角瓶中，在超净台中放置挥发甲醇。然后加入100ml灭菌的无机盐培养基(K2HPO41.79g/L、KH2PO4 0.45g/L、MgSO4·7H2O 0.29g/L、NaCl 0.4g/L、其余为水，pH 7)，摇匀。
其中固体富集培养基：在液体富集培养基基础上加入1.5％的琼脂。
实施例2莠去津降解菌Y6X-2的鉴定
将活化的Y6X-2，CGMCC No.15919接种在液体培养培养基(蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％，酵母粉0.25％，其余为水，灭菌冷却后加入1％的已过滤除菌的甲醇)中，30℃、150rpm振荡培养24h。取1ml新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2ml离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，采用通用引物8F/1492R进行PCR扩增。PCR产物电泳检测后，如图1泳道4电泳条带，测定16S rDNA基因序列，具体序列如SEQ ID NO:1所示，经过比对后属于Methylopila菌。Y6X-2的形态特征：短杆状、不产生芽孢，在固体平板上形成直径1-2mm的细小白色菌落。Y6X-2的生理生化特征：革兰氏染色阴性，脲酶反应阳性。
序列表：SEQ ID NO:1：
gagcggcagacgggtgagtaacgcgtggggatgtgccttgtggtacggaacaactcagggaaacttgagctaataccgtataagcccttcgggggaaagatttatcgccacaagatcaacccgcgttggattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttcactggggaagataatgacggtacccagagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgcacgtaggcggacttttaagtcaggggtgaaatcccaaggctcaaccttggaactgcctttgatactggaagtcttgagttcgggagaggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctcactggcccgatactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatggaagctagccgttggtcagcatgctgatcagtggcgcagctaacgctttaagcttcccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagctcttgacatgccgtgttacccggagagattcggggtccacttcggtggcgcggacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccctagttgccatcattcagttgggcactctagggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggcagcaaaggggcgacccctagctaatctccaaaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgc
实施例3：Y6X-2，CGMCC No.15919降解莠去津
将活化的Y6X-2，CGMCC No.15919接种在液体培养培养基(蔗糖130g/L、蛋白胨2g/L、Na2HPO4 1.4g/L、KH2PO4 0.3g/L、其余为水，pH 7)中，30℃、150rpm振荡培养24h。按2％(V/V)取新鲜菌液接种在含有200mg/L莠去津的液体富集培养基中，在30℃、150rpm振荡培养7d。然后用等体积二氯甲烷萃取3次，弃水相，合并有机相，经无水硫酸钠脱水后用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用色谱乙腈定容至10mL，过0.22μm有机滤膜。
使用文献“烟嘧-莠去津油悬浮剂的高效液相色谱分析”中的高效液相色谱法检测莠去津的残余量。首先采用外标法定量，以色谱乙腈为溶剂将莠去津标准品配制成500mg/L(取0.01g莠去津原药，溶解于20mL的色谱乙腈)的母液，然后依次稀释成0、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L 8个浓度梯度，分别测定峰面积，结果见表1。以莠去津浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得曲线公式：y＝35716x+16022，其中R2＝0.9989。
表1不同莠去津浓度(mg/L)及峰面积
浓度 0 10 20 30 40 50 75 100
峰面积 0 410484 753533 1071435 1475165 1735429 2654747 3634987
使用同样的方法测定Y6X-2培养后的莠去津浓度对应的峰面积为439614，带入标准曲线公式计算对应的莠去津浓度为11.86mg/L。
根据(起始莠去津浓度-培养后莠去津浓度)/起始莠去津浓度计算Y6X-2，CGMCCNo.15919降解莠去津去除率＝(200-11.86)/200＝94.07％。
其中液体富集培养基：将莠去津(97％，购自国药集团化学试剂有限公司)配成10g/L的甲醇储备液，经0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。配制培养基时，按浓度取储备液于一个灭菌的三角瓶中，在超净台中放置挥发甲醇。然后加入100ml灭菌的无机盐培养基(K2HPO41.79g/L、KH2PO4 0.45g/L、MgSO4·7H2O 0.29g/L、NaCl 0.4g/L、其余为水，pH 7)，摇匀。
序列表
<110> 李晓明
<120> 一株莠去津降解菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 甲基球状菌(Methylopila sp.)
<400> 1
gagcggcaga cgggtgagta acgcgtgggg atgtgccttg tggtacggaa caactcaggg 60
aaacttgagc taataccgta taagcccttc gggggaaaga tttatcgcca caagatcaac 120
ccgcgttgga ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat ccatagctgg 180
tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 240
gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg 300
aaggccttag ggttgtaaag ctctttcact ggggaagata atgacggtac ccagagaaga 360
agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg 420
aatcactggg cgtaaagcgc acgtaggcgg acttttaagt caggggtgaa atcccaaggc 480
tcaaccttgg aactgccttt gatactggaa gtcttgagtt cgggagaggt gagtggaact 540
gcgagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt cgcaagaaca ccagtggcga aggcggctca 600
ctggcccgat actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 660
ggtagtccac gccgtaaacg atggaagcta gccgttggtc agcatgctga tcagtggcgc 720
agctaacgct ttaagcttcc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa 780
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac 840
cttaccagct cttgacatgc cgtgttaccc ggagagattc ggggtccact tcggtggcgc 900
ggacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 960
caacgagcgc aaccctcgcc cctagttgcc atcattcagt tgggcactct agggggactg 1020
ccggtgataa gccgagagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttacgggct 1080
gggctacaca cgtgctacaa tggcggtgac agtgggcagc aaaggggcga cccctagcta 1140
atctccaaaa gccgtctcag ttcggattgc actctgcaac tcgagtgcat gaaggtggaa 1200
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1260
gcccgtcaca ccatgggagt tggttttacc cgaaggcgc 1299

Claims (4)

1.一株莠去津降解菌，其特征在于：该菌株为Methylopila sp.Y6X-2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15919。
2.权利要求1所述的莠去津降解菌的应用，其特征在于：将所述的莠去津降解菌接种于莠去津污染环境中，进行治理修复。
3.一种菌剂，其特征在于：该菌剂的活性成分为权利要求1所述的莠去津降解菌。
4.权利要求3所述菌剂的应用，其特征在于：将所述的菌剂接种于莠去津污染环境中，进行治理修复。
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