CN108949628B - 一株微生物采油菌w-y5及其应用 - Google Patents

一株微生物采油菌w-y5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株微生物采油菌W‑Y5及其应用。微生物采油菌W‑Y5具体为Tepidiphilus sp.W‑Y5，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15902。实验证明，Tepidiphilus sp.W‑Y5不仅具有降解石油的功能，可用于石油污染的治理和修复，而且还可以用于微生物采油，提高采油率。本发明具有重要的应用价值。

Description

一株微生物采油菌W-Y5及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株微生物采油菌W-Y5及其应用。
背景技术
石油污染分布广泛，涉及采油、炼油、化工、机械等各种工业以及石油泄漏等各种污染环境。石油烃组分复杂多样，疏水性强而难以被普通微生物所接触、所降解、所利用。
微生物采油技术就是通过向地层中注入营养或微生物，利用油藏中微生物的生长代谢活动，提高原油产量和采收率。传统的石油功能菌株多分离于水体、土壤中。现有的研究表明，微生物除分布在水、土中外，在石油油相中也有广泛的分布，因此从石油油相中分离相关的功能菌株在微生物采油技术中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是降解石油。
本发明首先保护Tepidiphilus sp.W-Y5，该菌株已于2018年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15902。Tepidiphilus sp.W-Y5CGMCC No.15902简称Tepidiphilus sp.W-Y5。
本发明还保护一种菌剂，该菌剂含有所述Tepidiphilus sp.W-Y5。所述菌剂的用途为A1)或A2)或A3)或A4)：A1)微生物采油；A2)乳化原油；A3)降解石油；A4)石油污染治理和/或修复。
所述菌剂的制备方法可包括如下步骤：将Tepidiphilus sp.W-Y5接种至细菌培养基并进行培养，获得Tepidiphilus sp.W-Y5浓度为107-109CFU/mL(如107-108CFU/mL、108-109CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL或109CFU/mL)的菌液，即为所述菌剂。
所述细菌培养基可为LB液体培养基。
所述菌剂的制备方法中，所述培养的条件可为：45～55℃(如45～50℃、50～55℃、45℃、50℃或55℃)、100-200r/min(如100-150r/min、150-200r/min、100r/min、150r/min或200r/min)培养20～30h(如20～24h、24～30h、20h、24h或30h)。
除了活性成分，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明还保护所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂的应用，可为a1)或a2)：a1)微生物采油；a2)制备微生物采油的产品。
本发明还保护所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂的应用，可为b1)或b2)：b1)乳化原油；b2)制备乳化原油的产品。
本发明还保护所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂的应用，可为c1)或c2)：c1)降解石油；c2)制备降解石油的产品。
本发明还保护所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂的应用，可为d1)或d2)：d1)石油污染治理和/或修复；d2)制备石油污染治理和/或修复的产品。
本发明还保护一种产品，其含有所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂；所述产品可具有如下A1)-A4)中至少一种功能：A1)微生物采油；A2)乳化原油；A3)降解石油；A4)石油污染治理和/或修复。
本发明还保护一种微生物采油的方法，可包括如下步骤：在采油过程中，加入所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂。
本发明还保护一种乳化原油和/或降解石油的方法，可包括如下步骤：向原油或含有原油的液相体系中加入所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂。
本发明还保护一种石油污染治理和/或修复的方法，可包括如下步骤：采用所述Tepidiphilus sp.W-Y5或上述任一所述的菌剂处理石油污染物。
实验证明，本发明提供的Tepidiphilus sp.W-Y5CGMCC No.15902不仅具有降解石油的功能，可用于石油污染的治理和修复，而且还可以用于微生物采油，提高采油率。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为W-Y5菌株乳化原油的效果。
图2为物模驱油结果曲线。
保藏说明
拉丁名：Tepidiphilus sp.
菌株编号：W-Y5
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年06月05日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15902
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
液体无机盐培养基：将5g NaCl、1g NH4H2PO4、1g(NH4)2SO4、1g K2HPO4和3g KNO3溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L，调节pH值至7-8；121℃灭菌30min。
LB液体培养基：将10g NaCl、10g蛋白胨和5g酵母粉溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L，调节pH值至7-8；121℃灭菌30min。
LB固体培养基：将10g NaCl、10g蛋白胨、5g酵母粉和15g琼脂粉溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L，调节pH值至7-8；121℃灭菌30min。
LB固体平板：将约55℃的LB固体培养基倒入无菌培养皿，冷却后得到LB固体平板。
实施例1、W-Y5菌株的分离、鉴定与保藏
一、W-Y5菌株的分离
取1g原油(2017年8月采自新疆油田油井)，加入100mL液体无机盐培养基，50℃、150rpm振荡培养30d后，稀释涂布在LB固体平板上，50℃培养7d，挑取单菌落划线纯化后保存，将分离纯化获得的分离物命名为W-Y5菌株。
二、W-Y5菌株的鉴定
1、形态学鉴定
将W-Y5菌株接种至LB固体平板上，50℃暗培养，5d后观察菌落的形态并通过高分辨率透射电镜分析观察菌体的形态特征。
实验结果表明，W-Y5菌株的菌落直径为1-2mm；W-Y5菌株短杆状、不产生芽孢。
2、生理生化特征分析
参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社，1999.)测定W-Y5菌株的生理生化特征。
结果表明，W-Y5菌株的生理生化特征如下：革兰氏染色阴性，氧化酶反应阳性，过氧化氢酶反应阳性。
3、16s rDNA序列同源性分析
(1)将W-Y5菌株接种于LB液体培养基，50℃、150rpm振荡培养24h，得到培养菌液。
(2)完成步骤(1)后，取新鲜的培养菌液，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于离心管(规格为2mL)中，然后采用DNA提取试剂盒提取DNA。
(3)完成步骤(2)后，取菌体的DNA，先进行电泳检测，然后采用通用引物8F/1492R进行PCR扩增，得到含有W-Y5菌株16S rDNA保守区的PCR产物。引物序列如下：8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
电泳检测PCR产物并测序。测序结果表明，W-Y5菌株16S rDNA的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
将序列1与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对。比对结果表明，W-Y5菌株与Tepidiphilus sp.的同源性最高。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的W-Y5菌株鉴定为Tepidiphilus sp.。
三、W-Y5菌株的保藏
W-Y5菌株已于2018年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.15902。W-Y5菌株的全称为Tepidiphilus sp.W-Y5CGMCC No.15902。
实施例2、W-Y5菌株在乳化原油和降解石油中的应用
一、W-Y5菌株在乳化原油中的应用
1、将W-Y5菌株接种于LB液体培养基，50℃、150rpm振荡培养24h，得到W-Y5菌液(W-Y5菌液中，W-Y5菌株的浓度为108CFU/mL)。
2、将步骤1得到的W-Y5菌液按照5％(v/v)的比例接种于原油无机盐培养基中，50℃、150rpm振荡培养7d。
温度为50℃时，原油的粘度为3210mPa.s。
原油无机盐培养基：将1g原油、5g NaCl、1g NH4H2PO4、1g(NH4)2SO4、1g K2HPO4和3gKNO3溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L，调节pH值至7-8；121℃灭菌30min。
3、将LB液体培养基按照5％(v/v)的比例接种于原油无机盐培养基中，50℃、150rpm振荡培养7d。作为对照。
实验结果见图1(左图为LB液体培养基处理原油，右图为W-Y5菌液处理原油)。结果表明，W-Y5菌株在50℃下对原油有明显的乳化作用。
二、W-Y5菌株在降解石油中的应用
1、同步骤一中1。
2、同步骤一中2。
3、取完成步骤2的体系，按照文献“原油降解菌的分离及其降解性能”中的方法测定石油残余量，计算石油降解率。石油降解率＝(石油加入量-石油残余量)/石油加入量。
计算结果表明，石油降解率为59.7％。结果表明，W-Y5菌株具有降解石油的功能，可用于石油污染的治理和修复。
实施例3、W-Y5菌株在微生物采油技术中的应用
通过室内物模驱油实验评价微生物菌种的驱油效果，实验步骤具体如下：
1、按照油藏区块渗透率(0.200μm2)，采用高压模型管(规格
Figure BDA0001739499510000052
购至海安石油科研仪器有限公司)内填装不同目数的石英砂制作为填砂模型管。
2、采用渗透率测量装置测量模型管渗透率，选择符合的模型管；模型管填砂参数如表1所示。
表1.模型管填砂参数
Figure BDA0001739499510000051
3、抽真空饱和地层水，计算孔隙度。
4、油驱水建立束缚水，测量原始含油饱和度；并在油藏温度(50℃)下老化3天。
5、用注入水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98％)停止水驱，计算水驱采收率。
6、将W-Y5菌株接种于LB液体培养基，50℃、150rpm振荡培养24h，得到W-Y5菌液(W-Y5菌液中，W-Y5菌株的浓度为108CFU/mL)。
7、在注入水中加入NH4H2PO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、KNO3、蛋白胨、和酵母粉和W-Y5菌液，得到含W-Y5的混合液。含W-Y5的混合液中，NH4H2PO4、(NH4)2SO4和K2HPO4的浓度均为1g/L，KNO3的浓度为3g/L，蛋白胨的浓度为2g/L，酵母粉的浓度为1g/L，W-Y5菌液的浓度为5％(v/v)。含W-Y5的混合液中，W-Y5菌株的浓度为108CFU/mL。
8、按1.0PV注入量将上述含W-Y5的混合液注入模型管中；在油藏温度(50℃)下培养15天。
9、二次水驱，水驱至含水98％以上，分别计算注微生物(含W-Y5的混合液)过程中、微生物(含W-Y5的混合液)作用后续水驱的采收率和W-Y5菌株的提高采收率。
水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率的结果如表2所示。对水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率进行对比发现：使用W-Y1菌株进行采油，采收率提高了5.23％。物模驱油结果曲线如图2所示。
表2.水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率
物模阶段 采收率(％) 提高采收率(％)
水驱 36.39 /
注微生物过程 36.89 0.5
微生物作用后续水驱 41.62 5.23
注：“/”表示不存在。
<110> 北京润世能源技术有限公司
<120> 一株微生物采油菌W-Y5及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cagcgggccc ttcggggtgc cggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcat cggaacgtac 60
ccgggagtgg gggataaccg gccgaaaggc tggctaatac cgcatgaact cggaagagca 120
aagcggggga ccttcgggcc tcgcgctctc ggagcggccg atgtccgatt agctagttgg 180
tgaggtaaag gctcaccaag gcgacgatcg gtagcgggtc tgagaggacg atccgccaca 240
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat cttggacaat 300
gggcgcaagc ctgatccagc aatgccgcgt gggtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagcc 360
ctttcggcgg ggaagaaatc ggccgggcga atagttcggc tggatgacgg tacccgcaga 420
agaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat 480
cggaattact gggcgtaaag ggtgcgcagg cggctgtgta agaccggtgt gaaatccccg 540
ggctcaacct gggaatggcg ctggtgactg cacagctcga gtacggtaga ggggggtgga 600
attcctggtg tagcagtgaa atgcgtagag atcaggagga acaccgatgg cgaaggcagc 660
cccctgggcc tgtactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 720
cctggtagtc cacgccctaa acgatgagaa ctagccgtct ggagtcttcg tgctctgggt 780
ggcgcagcta acgcgtgaag ttctccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa 840
aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga 900
agaaccttac ctacccttga catgccggga atcctgccga gaggcgggag tgccttcggg 960
aacccggaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1020
tcccgcaacg agcgcaaccc ctgtcgatag ttgccatcat tgagttgggc actttatcga 1080
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1140
ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg gtacagaggg ttgccaagcc gcgaggcgga 1200
gccaatccca gaaagccgat cgtagtccgg attgcagtct gcaactcgac tgcatgaagt 1260
cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1320
acaccgcccg tcacaccatg ggagtggggt gcaccagaag tcggtcgcct aaccgcaagg 1380
aggg 1384

Claims (10)

1.Tepidiphilus sp.W-Y5，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15902。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5。
3.权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂的应用，为a1)或a2)：a1)微生物采油；a2)制备微生物采油的产品。
4.权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂的应用，为b1)或b2)：b1)乳化原油；b2)制备乳化原油的产品。
5.权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂的应用，为c1)或c2)：c1)降解石油；c2)制备降解石油的产品。
6.权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂的应用，为d1)或d2)：d1)石油污染治理和/或修复；d2)制备石油污染治理和/或修复的产品。
7.一种产品，其含有权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂；所述产品具有如下A1)-A4)中至少一种功能：A1)微生物采油；A2)乳化原油；A3)降解石油；A4)石油污染治理和/或修复。
8.一种微生物采油的方法，包括如下步骤：在采油过程中，加入权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂。
9.一种乳化原油和/或降解石油的方法，包括如下步骤：向原油或含有原油的液相体系中加入权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂。
10.一种石油污染治理和/或修复的方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述Tepidiphilus sp.W-Y5或权利要求2所述的菌剂处理石油污染物。
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