CN109385383B - 一株耐盐栖盐田菌w-y11及其应用 - Google Patents

一株耐盐栖盐田菌w-y11及其应用 Download PDF

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    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
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Abstract

本发明公开了一株耐盐栖盐田菌W‑Y11及其应用。本发明的耐盐栖盐田菌W‑Y11的分类命名为栖盐田菌Salinicola sp.，该菌株已于2018年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16741。通过实验证明：本发明的耐盐栖盐田菌W‑Y11能够乳化原油，不仅可用于微生物采油，提高采油率，还可用于石油污染的治理和修复，具有很好的应用前景。

Description

一株耐盐栖盐田菌W-Y11及其应用
技术领域
本发明涉及微生物采油技术领域，具体涉及一株耐盐栖盐田菌W-Y11及其应用。
背景技术
石油污染分布广泛，涉及采油、炼油、化工、机械等各种工业，以及石油泄漏等各种污染环境。石油烃组分复杂多样，疏水性强而难以被普通微生物所接触、所降解、所利用。微生物采油技术就是通过向地层中注入营养或微生物，利用油藏中微生物的生长代谢活动，提高原油产量和采收率。
传统的石油功能菌株多分离自水体、土壤中。现有的研究表明，微生物除分别在水、土中外，在石油油相中也有广泛的分布，因此从石油油相中分离相关的功能菌株在微生物采油技术中具有重要意义。
文献“印度洋表层海水石油降解菌及其烷烃羟化酶AlkB的多样性分析”中报道了14株Salinicola sp.菌，但经测定后未有降解原油的效果。文献“翅碱蓬根系微生物群落多样性及其对降油细菌的负载性能研究”报道了经比对后属于Salinicola zeshunii的菌株，但未进行降解原油实验。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株栖盐田菌Salinicola sp.W-Y11。
本发明提供的栖盐田菌Salinicola sp.W-Y11的保藏编号为CGMCC No.16741，其分类命名为栖盐田菌Salinicola sp.，已于2018年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
本发明的另一个目的是提供栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。
本发明提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油采油中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油采油的产品中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在微生物采油中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在原油乳化中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备原油乳化的产品中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油降解中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油降解的产品中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油污染治理中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油污染治理的产品中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在石油污染修复中的应用。
本发明还提供了栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备石油污染修复的产品中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)-6)中任一种功能：
1)石油采油；
2)微生物采油；
3)原油乳化；
4)石油降解；
5)石油污染治理；
6)石油污染修复。
本发明还有一个目的是提供一种微生物采油的方法。
本发明提供的微生物采油的方法包括如下步骤：在采油的过程中，加入栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂。
本发明的最后一个目的是提供一种石油污染治理和/或修复的方法。
本发明提供的石油污染治理和/或修复的方法包括如下步骤：用栖盐田菌Salinicola sp.或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂处理石油污染物。
上述应用或产品或方法中，所述栖盐田菌Salinicola sp.为栖盐田菌Salinicolasp.W-Y11CGMCC No.16741。
上述应用或产品或方法中，所述菌剂的制备方法如下：将栖盐田菌Salinicolasp.W-Y11CGMCC No.16741接种至含1％(质量分数)氯化钠的LB培养基中培养，得到所述菌剂。所述菌剂中的菌浓度不低于108cfu/mL。
本发明提供了一种微生物采油菌W-Y11，其分类命名为栖盐田菌Salinicola sp.，该菌株已于2018年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16741。通过实验证明：本发明的微生物采油菌W-Y11能够乳化原油，不仅可用于微生物采油，提高采油率，还可用于石油污染的治理和修复，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为W-Y11的16S rDNA基因系统发育树。
图2为W-Y11的gyrB基因系统发育树。
图3为W-Y11乳化稠油。左为W-Y11，右为对照。
保藏说明
拉丁名：栖盐田菌Salinicola sp.
菌株编号：W-Y11
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年11月13日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16741
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、W-Y11菌株的分离、鉴定及保藏
一、W-Y11菌株的分离
2017年7月，从新疆克拉玛依的胜利油田的油井采出液中获得油相石油，发明人从中分离得到一株菌，将其命名为菌株W-Y11。
二、W-Y11菌株的鉴定
1、W-Y11菌株的形态鉴定
W-Y11菌株的形态特征：在含有1％(质量分数)氯化钠的LB平板上形成肉色圆润凸起菌落。
2、W-Y11菌株的生理生化鉴定
W-Y11菌株的生理生化特征：能够在0-20％氯化钠浓度下生长。
3、W-Y11菌株的分子鉴定
将活化的W-Y11菌株接种在含1％(质量分数)氯化钠的液体LB培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH7-8)中，30℃、150rpm振荡培养24h。取1mL新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，分别采用16S rDNA基因通用引物8F/1492R和gyrB基因通用引物up1F/up2R进行PCR扩增。PCR产物电泳检测后，测定16S rDNA基因序列和gyrB基因序列，16S rDNA基因具体序列如序列表中序列1所示，gyrB基因具体序列如序列表中序列2所示。
16S rDNA基因序列经过比对后属于Salinicola菌，基于16S rDNA基因使用软件MEGA构建的系统发育树如图1所示。基于gyrB基因使用软件MEGA构建的系统发育树如图2所示。W-Y11与相似性最高的菌株Salinicola socius和Salinicola salarius的生理生化特征比较如表1所示。
表1、W-Y11与Salinicola socius和Salinicola salarius的生理生化特征比较结果
菌株 W-Y11 Salinicola socius Salinicola salarius
NaCl范围 0-20％ 0.5-30％ 0-25％
最佳NaCl范围 3-15％ 3-10％ 10-20％
菌落颜色 肉色 黄色着色 黄色
综合以上鉴定结果表明，菌株W-Y11是一种新发现的Salinicola菌。
三、W-Y11菌株的保藏
W-Y11菌株的分类命名为栖盐田菌Salinicola sp.，该菌株已于2018年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.16741。
实施例2、W-Y11菌株对稠油乳化
本实施例中的石油于2017年7月采集自新疆克拉玛的胜利油田，50℃的石油粘度为28700mPa.s，属特稠油。
1、将活化后的W-Y11接种至含1％(质量分数)氯化钠的液体LB培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到W-Y11菌液(菌浓度≥108cfu/mL)。
2、试验组：将5体积份菌液接种至95体积份石油-无机盐培养基(溶剂为水，溶质及其浓度分别为1g/L石油、44g/L NaCl、1g/L NH4H2PO4、1g/L(NH4)2SO4、1g/L K2HPO4、3g/LKNO3，总矿化度50000mg/L，pH 7-8)中，30℃、150rpm振荡培养7d。
对照组：将100体积份石油-无机盐培养基，30℃、150rpm振荡培养7d。
3、完成步骤2后，照片结果见图3。图3中，左边为试验组，右边为对照组。菌株W-Y11在30℃下对稠油出现明显的乳化作用。
4、按照文献“原油降解菌的分离及其降解性能”中的方法测定完成步骤2的体系中的石油残余量，计算石油降解率。石油降解率＝(石油加入量-石油残余量)/石油加入量。计算结果表明：石油降解率为42.5％。
实施例3、W-Y11菌株在微生物采油技术中的应用
本实施例中的石油于2017年7月采集自新疆克拉玛的胜利油田，50℃的石油粘度为28700mPa.s，属特稠油。
本实施例通过室内物模驱油实验评价微生物菌种的驱油效果。具体实验方法如下：
1、采用高压模型管(规格
Figure BDA0001895939180000052
购至海安石油科研仪器有限公司)内填装不同目数的石英砂制作为填砂模型管。采用渗透率测量装置测量模型管渗透率，选择符合的模型管。抽真空饱和地层水，计算孔隙度；最终制备的用于后续步骤的模型管的参数见表2。
表2、模型管填砂参数
Figure BDA0001895939180000051
2、从模型管入口持续注入石油，直至模型管出口检测到石油流出，测量原始含油饱和度；并在油藏温度(30℃)下老化3天。
3、按照1个模型管孔隙体积容积的注入量注入水(总矿化度为53440mg/L)进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98％)停止水驱，计算采收率(即为水驱采收率)。
4、按照1个模型管孔隙体积容积的注入量注入含菌水(完成注入后，计算采收率，即为注微生物过程采收率)，在油藏温度(30℃)下培养15天。
含菌水的制备方法如下：将活化的W-Y11接种在含1％(质量分数)氯化钠的液体LB培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，得到W-Y11菌液(菌浓度≥108cfu/mL)。在注入水中加入W-Y11菌液、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、KNO3、蛋白胨和酵母粉，使其在含菌水的中浓度分别为5％(体积分数)W-Y11菌液、1g/L NH4H2PO4、1g/L(NH4)2SO4、1g/L K2HPO4、3g/L KNO3、2g/L蛋白胨和1g/L酵母浸粉。
5、按照1个模型管孔隙体积容积的注入量注入水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98％)停止水驱，计算采收率(即为微生物作用后续水驱采收率)。
对水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率进行了对比，结果见表3。室内物模驱油表明，使用W-Y11菌株可以提高采收率5.52％。
表3、采收率
物模阶段 采收率(％) 提高采收率(％)
水驱 34.61 /
注微生物过程 37.75 3.14
微生物作用后续水驱 40.13 5.52
序列表
<110>北京润世能源技术有限公司
<120>一株耐盐栖盐田菌W-Y11及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1420
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
tacacatgca gtcgagcggc agcacgggga gcttgctccc tggtggcgag cggcggacgg 60
gtgagtaatg cataggaatc tgcccgatag tgggggataa cgtggggaaa cccacgctaa 120
taccgcatac gtcctacggg agaaagcgga ggctcttcgg acttcgcgct atcggatgag 180
cctatgtcgg attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggcgacga tccgtagctg 240
gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa 360
gaaggctttc gggttgtaaa gcactttcag cgaggaagaa agcctttggg ttaatacccc 420
agaggaagga catcactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta 480
atacggaggg tgcgagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg 540
gcacgccggt tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaacg gcatccggaa cggccaggct 600
agagtgcagg agaggaaggt agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga 660
ggaataccag tggcgaaggc ggccttctgg cctgacactg acactgaggt gcgaaagcgt 720
gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt cgactagccg 780
ttgggacctt taaggactta gtggcgcagt taacgcgata agtcgaccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctaccctt gacatccaga gaactttcca 960
gagatggatt ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1020
tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt atttgccagc 1080
gagtcatgtc gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggacga 1140
cgtcaagtca tcatggccct tacgggtagg gctacacacg tgctacaatg gccggtacaa 1200
agggttgcga gaccgcgagg tggagcgaat cccagaaagc cggcctcagt ccggatcgga 1260
gtctgcaact cgactccgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgcatcag aatggcacgg 1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg gactgcacca 1380
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<212>DNA
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ggaacagctc aagctgacta tctggcgcaa caaccaggtt cacgaacaga tctatcacca 120
cggcgtgccg caggcgccgc tgagcgtggt cggcgatacc gagaaatccg gtacccagat 180
cagcttcaag ccgtccagcg agaccttcgc caacatcgag ttccactacg acattctcgc 240
caagcgcctg cgcgagctgt cgtttctgaa ctccggtgtc gctattcgtc tggtcgacga 300
gcgcgacggg cgcgaggagg tgttccacta cgaaggcggt ctcaaggcgt tcgtcgatca 360
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ggatcccaag ttttcctcgc agaccaagga caagctggtc tcttccgagg tgaagacagc 720
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caccctgatt accgcactgg gttgcggcat tgggcgtgag gagttcaacc cggacaagct 1140
gcgttatcac t 1151

Claims (10)

1.一株栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11，其保藏编号为CGMCC No.16741。
2.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在石油采油中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备石油采油的产品中的应用。
3.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在微生物采油中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。
4.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在原油乳化中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备原油乳化的产品中的应用。
5.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在石油降解中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备石油降解的产品中的应用。
6.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在石油污染治理中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备石油污染治理的产品中的应用。
7.如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在石油污染修复中的应用；
或，如权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂在制备石油污染修复的产品中的应用。
8.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂；
所述产品具有如下1）-6）中任一种功能：
1）石油采油；
2）微生物采油；
3）原油乳化；
4）石油降解；
5）石油污染治理；
6）石油污染修复。
9.一种微生物采油的方法，包括如下步骤：在采油的过程中，加入权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂。
10.一种石油污染治理和/或修复的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的栖盐田菌（Salinicola sp.）W-Y11或其菌悬液或含有该菌的菌剂处理石油污染物。
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