CN107312727A - 一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境石油污染生物处理技术领域，具体涉及一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂及其制备方法。制备该微生物菌剂的原料包括以下物质：红平红球菌3％～4％、芽孢杆菌8％～10％、鞘氨醇单胞菌3％～4％、沸石粉末3％～6％、鼠李糖3％～6％、营养培养基70％～80％。复合微生物菌剂中的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌可利用石油中的苯、甲苯、芳香烃等物质为能源，通过分泌表明活性剂，将水体中的石油乳化、分解，将有毒有害的石油污染物降解成小分子化合物，可应用于水体中石油污染物的清除，过程简单、高效、无污染，适用于湖泊、河流等水体环境的治理。

Description

一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于环境石油污染生物处理技术领域，具体涉及一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着现代工农业的迅速发展，人类对能源的需求不断扩大，对石油的开采力度逐渐加大，这给人们的生产和生活带来了极大的便利，如：汽车代步、沥青公路取代泥砖路等。这使得愈来愈多的油田出现在世界各地，但随着石油行业的开采、冶炼，石油所带来的巨大的环境污染问题，成为现代环境治理的重中之重。
石油，主要成分是烷烃、环烷烃和芳香烃的组合物，是一种疏水性物质。油轮、油田工业等含油废料、废水排放到水体中会在表面迅速扩散形成油膜，这些油膜会吸收太阳能，阻止大气与水中的气体交换，从而影响水中植物的光合、呼吸作用，降低营养物质的代谢及转换速率，干扰水中生物的摄食、生长繁殖等；且由于水体生态系统自我净化、修复能力较慢，使得水体中生物种群的丰富度和分布发生变化，从而影响生物群落组成及生态系统的多样性。据统计，每年倾注到海洋的石油量高达200万吨～1000万吨，航运石油污染物达160万吨～200万吨，这些石油污染物使水体的综合使用价值降低，通过生物间的富集会危害到人体健康。
石油对水体的严重危害性，不仅造成水体生态系统的破坏，也影响到人类的生活健康。石油中的苯、醛、烷烃和酚等化合物具有潜在的毒性和致癌性，通过食物链进入到人体中，会引起人体的免疫系统、呼吸系统等代谢紊乱，从而影响人类的生长发育、生育能力。因此，由石油引发的水体污染，已逐渐引起人们的重视。
目前处理水体中的石油污染物主要是通过物理法、化学药剂法、臭氧氧化技术、吸附法等。其中物理法主要是通过抽油机吸油、水栅刮油等方法阻止溢油扩散，但由于石油在水体中的扩散速率较快、无定型、覆盖面积广等特点，处理时难度大、效率低；化学药剂法，通过向水体中喷洒或投入可降解的石油清除剂，在短时间内使得石油污染物能够乳化降解，形成能消散于水中的微小球状物，但这种通过人为的添加化学试剂的方法具有潜在的威胁性，会造成水体的二次污染，影响生态系统的多样性；臭氧氧化法，能够把危害性较大的污染物通过与臭氧接触氧化的方法转化成危害性较小的污染物，但这种方法的缺点是治标不治本，污染的水体没有得到根治；吸附法，将石油污染物通过活性炭、硅胶等吸附剂吸附从而达到清除污染物的目的，但所用的吸附材料易饱和，需定期更换，沉降速率慢。
由于传统的治理方法存在着一定的弊端，因此寻求高效、环境友好性、安全性的清除措施成为近年来治理石油污染的一项重要途径，微生物菌剂能够利用石油中的有毒有害物质作为能源，通过机体代谢转化成无毒无害的小分子，从而达到降解、控制水体污染的目的，成为今年来开发及利用的一项热点。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂及其制备方法，复合微生物菌剂中的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌可利用石油中的苯、甲苯、芳香烃等物质为能源，通过分泌表面活性剂，将水体中的石油乳化、分解，将有毒有害的石油污染物降解成小分子化合物，可应用于水体中石油污染物的清除，过程简单、高效、无污染，适用于湖泊、河流等水体环境的治理。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂，制备该微生物菌剂的原料包括以下物质：红平红球菌Rhodococcus erythropolis 3％～4％、芽孢杆菌Bacillus sp.8％～10％、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas.3％～4％、沸石粉末3％～6％、鼠李糖3％～6％、营养培养基70％～80％。
所述芽孢杆菌组成为短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，其占比为1-2:0.5-1:1-2。
所述营养培养基包括液体营养培养基和固体营养培养基：液体营养培养基成分组成为玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2％～3％，余量为蒸馏水，121℃，灭菌15～30min；固体营养培养基成分组成为琼脂1.5％～2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2％～3％，余量为蒸馏水，121℃，灭菌15～30min。
所述无机盐成分组成为FeCl3、K2HPO4、KH2PO4、CuCl2、MgSO4、MnSO4、CaCl2、(NH4)2HSO4、NaCl，其比例为0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)如上述所述制备液体营养培养基和固体营养培养基，并进行高压灭菌；
(2)分别将红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌种取出并水浴活化，分别吸取稀释后的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌液在固体培养基上分别进行涂布或划线，培养；
(3)在培养红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的固体营养培养基平板上分别挑取红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的单菌落并分别接种至液体营养培养基纯种培养，培养至对数期；
(4)将对数期的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌纯发酵菌液接种至液体营养培养基，将接种后的发酵液通入无菌空气，混合培养；
(5)发酵液pH值达到设定值，检测发酵液中总活菌数，当总活菌数达到设定值时，停止发酵；
(6)向发酵液中补充经过滤除菌的鼠李糖和沸石粉末，在无菌的环境中罐装成工作液。
所述步骤(2)中，水浴活化条件为：28℃，1～2min；吸取菌液量均为50～100μL；培养条件为25℃～35℃，24～28h。
所述步骤(3)中，纯种培养条件为25℃～35℃，50～80r/min。
所述步骤(4)中，红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌与液体营养培养基的接种比均为3％～5％，红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的接种质量比为1-1.5:2-3:1-1.5；无菌空气通入条件为：25℃～35℃，30～80mL/min；混合培养条件为：120～180r/min，3～5d。
所述步骤(5)中，pH设定值为6.8～7.8；总活菌数设定值为2-10*109CFU/mL。
所述步骤(6)中，鼠李糖、沸石粉末的质量占比均为3％～6％。
与现有技术相比，本发明具有如下优异技术效果：
(1)红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌等有益微生物，能够在水体中迅速繁殖并分泌具有无毒、无二次污染、环境友好性的糖脂类、脂肽类、脂蛋白类等一些生物表面活性剂，能够使水中石油中的苯、甲苯、酚、蒽等污染物快速增溶、乳化，将石油中的化合物分解成简单的亲水性小分子化合物，降低石油疏水性，从而有效地降解水中石油有机污染物，改善并修复水体环境。
(2)沸石，作为分子筛，其晶体结构有不同大小的空穴和通道，具有很大的开放性，可以将石油组成成分进入孔道内，可有效提高石油污染物的降解效率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步解释：
实施例1
制备该微生物菌剂的原料按质量百分比为：
红平红球菌Rhodococcus erythropolis 3％、芽孢杆菌Bacillus sp.8％、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas.3％、沸石粉末3％、鼠李糖5％、营养培养基80％；其中芽孢杆菌组成为短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，其占比为1.5:1:1.5。
营养培养基包括液体营养培养基和固体营养培养基：液体营养培养基成分组成为玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐3％，余量为蒸馏水；固体营养培养基成分组成为琼脂2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐3％，余量为蒸馏水。
无机盐成分组成为FeCl3、K2HPO4、KH2PO4、CuCl2、MgSO4、MnSO4、CaCl2、(NH4)2HSO4、NaCl，其比例为0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
制备方法为：
(1)如上述所述制备液体营养培养基和固体营养培养基，并进行高压灭菌，121℃，30min。
(2)分别将红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌种从-80℃冰箱内取出并于28℃水浴活化2min，分别吸取稀释后的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌液50μL在固体培养基上分别进行涂布或划线，于30℃培养24h。
(3)在培养红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的固体营养培养基平板上分别挑取红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的单菌落并分别接种至液体营养培养基纯种培养。其中红平红球菌的液体培养条件为30℃、60r/min，培养至对数期；芽孢杆菌的液体培养条件为35℃、80r/min，培养至对数期；鞘氨醇单胞菌的液体培养条件为30℃、50r/min，培养至对数期。
(4)将对数期的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌纯发酵菌液按接种质量比为1.5:3:1.5接种至液体营养培养基，其中红平红球菌与液体培养基的接种比为3％，芽孢杆菌与液体培养基的接种比为5％，鞘氨醇单胞菌与液体培养基的接种比为3.5％；将接种后的发酵液于30℃，以50mL/min的流速通入无菌空气，180r/min，混合培养5d。
(5)发酵液pH值达到7.5，检测发酵液中总活菌数，当达到5*109CFU/mL时，停止发酵。
(6)向发酵液中补充经过滤除菌的鼠李糖、沸石粉末，鼠李糖质量占比为5％、沸石粉末质量占比为3％，在无菌的环境中罐装成工作液。
本实施例治理的污染水源为久置1年的石油管道清洗废液，将发酵后的复合微生物菌剂摇匀后按1:100的比例加入到石油污染废水中。在30℃的条件下，以50mL/min的流速通入无菌空气并以100r/min的转速搅拌处理48h、96h，原油的降解率可高达84.5％、90.8％。
实施例2
制备该微生物菌剂的原料按质量百分比为：
红平红球菌Rhodococcus erythropolis 4％、芽孢杆菌Bacillus sp.10％、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas.4％、沸石粉末5％、鼠李糖5％、营养培养基72％；其中芽孢杆菌组成为短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，其占比为1.5:1:1.5。
营养培养基包括液体营养培养基和固体营养培养基：液体营养培养基成分组成为玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2.5％，余量为蒸馏水；固体营养培养基成分组成为琼脂2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2.5％，余量为蒸馏水。
无机盐成分组成为FeCl3、K2HPO4、KH2PO4、CuCl2、MgSO4、MnSO4、CaCl2、(NH4)2HSO4、NaCl，其比例为0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
制备方法为：
(1)如上述所述制备液体营养培养基和固体营养培养基，并进行高压灭菌，121℃，30min。
(2)分别将红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌种从-80℃冰箱内取出并于28℃水浴活化2min，分别吸取稀释后的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌液50μL在固体培养基上分别进行涂布或划线，于30℃培养24h。
(3)在培养红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的固体营养培养基平板上分别挑取红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的单菌落并分别接种至液体营养培养基纯种培养。其中红平红球菌的液体培养条件为30℃、80r/min，培养至对数期；芽孢杆菌的液体培养条件为35℃、80r/min，培养至对数期；鞘氨醇单胞菌的液体培养条件为28℃、60r/min，培养至对数期。
(4)将对数期的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌纯发酵菌液按接种质量比为1.5:2:1.2接种至液体营养培养基，其中红平红球菌与液体培养基的接种比为3％，芽孢杆菌与液体培养基的接种比为3.5％，鞘氨醇单胞菌与液体培养基的接种比为3.5％；将接种后的发酵液于30℃，以40mL/min的流速通入无菌空气，120r/min，混合培养4d。
(5)发酵液pH值达到7.2，检测发酵液中总活菌数，当达到4*109CFU/mL时，停止发酵。
(6)向发酵液中补充经过滤除菌的鼠李糖、沸石粉末，鼠李糖质量占比为5％、沸石粉末质量占比为5％，在无菌的环境中罐装成工作液。
本实施例治理的污染水源为输油管道泄漏造成的原油水体污染，将发酵后的复合微生物菌剂摇匀后按1:100的比例加入到石油污染废水中。在30℃的条件下，以40mL/min的流速通入无菌空气并以100r/min的转速搅拌处理36h，原油的降解率可高达75.6％。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂，其特征在于，制备该微生物菌剂的原料包括以下物质：红平红球菌Rhodococcus erythropolis 3％～4％、芽孢杆菌Bacillus sp.8％～10％、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas.3％～4％、沸石粉末3％～6％、鼠李糖3％～6％、营养培养基70％～80％。
2.根据权利要求1所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌组成为短芽孢杆菌Brevibacillus brevis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，其占比为1-2:0.5-1:1-2。
3.根据权利要求1所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂，其特征在于，所述营养培养基包括液体营养培养基和固体营养培养基：液体营养培养基成分组成为玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2％～3％，余量为蒸馏水，121℃，灭菌15～30min；固体营养培养基成分组成为琼脂1.5％～2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麦芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、无机盐2％～3％，余量为蒸馏水，121℃，灭菌15～30min。
4.根据权利要求3所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂，其特征在于，所述无机盐成分组成为FeCl3、K2HPO4、KH2PO4、CuCl2、MgSO4、MnSO4、CaCl2、(NH4)2HSO4、NaCl，其比例为0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)如权利要求3-4所述制备液体营养培养基和固体营养培养基，并进行高压灭菌；
(2)分别将红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌种取出并水浴活化，分别吸取稀释后的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的菌液在固体培养基上分别进行涂布或划线，培养；
(3)在培养红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的固体营养培养基平板上分别挑取红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的单菌落并分别接种至液体营养培养基纯种培养，培养至对数期；
(4)将对数期的红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌纯发酵菌液接种至液体营养培养基，将接种后的发酵液通入无菌空气，混合培养；
(5)发酵液pH值达到设定值，检测发酵液中总活菌数，当总活菌数达到设定值时，停止发酵；
(6)向发酵液中补充经过滤除菌的鼠李糖和沸石粉末，在无菌的环境中罐装成工作液。
6.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，水浴活化条件为：28℃，1～2min；吸取菌液量均为50～100μL；培养条件为25℃～35℃，24～28h。
7.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，纯种培养条件为25℃～35℃，50～80r/min。
8.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌与液体营养培养基的接种比均为3％～5％。
9.根据权利要求8所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，红平红球菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的接种质量比为1-1.5:2-3:1-1.5。
10.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，无菌空气通入条件为：25℃～35℃，30～80mL/min；混合培养条件为：120～180r/min，3～5d。
11.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，pH设定值为6.8～7.8；总活菌数设定值为2-10*109CFU/mL。
12.根据权利要求5所述的用于修复石油污染水的农业复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，鼠李糖、沸石粉末的质量占比均为3％～6％。
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