CN102839137A - 一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下重量份的成分混合制成：微生物菌肥85～90份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液10～15份。另外，本发明还提供了该固体微生物菌剂的制备方法。本发明的固体微生物菌剂可将有益微生物引入土壤中，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤，是生态环保的绿色菌剂。在土壤中施加本发明的固体微生物菌剂可促进作物的生长，并降解和转化土壤中的石油污染物，还可增强作物的抗逆性、提高作物产量。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
石油类污染物的危害主要表现在对人和动物、土壤和天然水体的危害和影响。石油排入土壤后，会影响土壤的通透性，土壤颗粒受石油污染后不易被水所浸润，形不成有效的土壤内导水通路，渗水量下降，透水性降低，而且积聚在土壤中的石油烃，绝大部分是高分子有机物，它们粘着在植物根系上形成一层粘膜，阻碍根系的呼吸与水分的吸收，甚至引起根系的腐烂。另外，石油富含反应基团，它们会与无机氮、磷结合，并抑制硝化作用和脱磷酸作用，从而减少土壤有效态氮、磷含量。
生物修复是指在污染环境中加入一些物质（如营养、O2、微生物）或提高这些物质的能力，使天然生物降解过程加速的生物技术。石油污染土壤的生物修复技术根据具体操作以及菌种的来源可以分为自然衰减法、生物刺激法和生物强化法。自然衰减法和生物刺激法对污染物的降解效率低，且易产生迁移性更强的中间产物，因此应用不广泛。通过微生物操作筛选能够降解石油烃污染物的微生物，并作为外源高效菌种添加到污染土壤中，降解转化石油烃污染物的方法即为生物强化法。
理论上生物强化修复技术可以通过添加外来高效石油烃降解菌来实现石油烃的高效去除。但由于石油烃组成复杂，毒性强，且生物可用性降低等原因使原位生物强化修复的效率低。同时外来菌种受生态系统中环境因素的复杂性和波动性的冲击，接种微生物数量和活性迅速降低至无法达到预期目标，外源微生物的生存能力、活性以及迁移能力与环境因素之间 的关系直接决定着生物强化修复的治理效果。制约生物强化修复技术发展的主要生态原因有生物因素和非生物因素。多数非生物因素可以通过工程措施，如调解土壤含水量、pH、添加有机碳源和无机营养物等进行调控；在生物强化修复过程中，受土壤多相复杂结构的限制，外源微生物在土壤中迁移困难，造成微生物无法与污染物有效接触并摄取污染物，微生物对污染物摄取困难是原位生物修复的一个瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于降解石油的固体微生物菌剂。该固体微生物菌剂可将有益微生物引入土壤中，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤，是生态环保的绿色菌剂。在土壤中施加固体微生物菌剂可促进作物的生长，并降解和转化土壤中的石油污染物，还可增强作物的抗逆性、提高作物产量。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于降解石油的固体微生物菌剂，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成：微生物菌肥85～90份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液10～15份；所述固体微生物菌剂的含水量为5wt%～15wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus，保藏编号CGMCC No.6072，保藏日期为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus，保藏编号CGMCC No.6074，保藏日期为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus，保藏编号CGMCC No.6073，保藏日期为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
上述的一种用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下重量份的成分混合制成：微生物菌肥89份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液11份；所述固体微生物菌剂的含水量为9.5wt%。
上述的一种用于降解石油的固体微生物菌剂，所述微生物菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
所述重量份可以为克、两、斤、公斤、吨等重量计量单位。
本发明还提供了上述用于降解石油的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照2～4∶3～5∶2～4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；
步骤四、将微生物菌肥与步骤三中所述混合发酵液按重量份配比混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
上述的方法，步骤一中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度为37±1℃，培养时间为24h～36h。
上述的方法，步骤二中所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
上述的方法，步骤三中所述发酵培养基的组成为：酵母粉40g～100g，K2HPO41g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO40.1g，蒸馏水定容至 1L，pH值为7.2～7.4。
上述的方法，步骤三中所述发酵培养的接种量为2%～8%，培养温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
本发明所述藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的筛选和鉴定方法为：
1、筛选方法：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，CaCl20.0002%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，CaCl20.0002%，琼脂2%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt% 正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株，共三株。
2、鉴定方法：
步骤一、提取总DNA：
101、分别取过夜培养的三株菌株（至多2×109个），10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液（20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HClpH8，2.5mMEDTA，1%TritonX-100），重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液Washbuffer；
103、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热（60℃）的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤二、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer 5μl； Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃ 5min；循环95℃ 35s，55℃ 35s，72℃ 30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物（SEQ ID NO.1）：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物（SEQ ID NO.2）：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物（片段大小1.4kb左右）进行测序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列（SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）分别与GenBank中已发表的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的16SrDNA序列、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的16SrDNA序列和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0%、100%和100%。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的三株菌株分别为藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
本发明的固体微生物菌剂的使用方法为：可在种植作物前施用于土壤或者作物种植后追施于土壤，用量以石油污染土壤的重量的1%与底肥混拌施用。
本发明采用的藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均源于土壤，因此固体微生物菌剂进入土壤后很快形成优势菌群，占据一定生态位；另外，这三种菌均具有促进植物根生长、改善根围生态环境的作用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的固体微生物菌剂可将有益微生物引入土壤中，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤。
2、本发明的固体微生物菌剂可促进作物的生长，并降解和转化土壤中的石油污染物。
3、本发明的固体微生物菌剂可增强作物的抗逆性、提高作物产量， 是生态环保的绿色菌剂。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
菌株筛选：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，CaCl20.0002%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，CaCl20.0002%，琼脂2%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床 培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株，共三株，分别命名为4006、4033和4070。
菌株鉴定：
步骤一、提取总DNA：
101、分别取过夜培养的三株菌株（至多2×109个），10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液（20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HClpH8，2.5mMEDTA，1%TritonX-100），重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液Washbuffer；
103、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热（60℃）的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤二、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer 5μl；Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃5min；循 环95℃ 35s，55℃ 35s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物（SEQ ID NO.1）：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物（SEQ ID NO.2）：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物（片段大小1.4kb左右）进行测序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列（SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）分别与GenBank中已发表的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的16SrDNA序列、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的16SrDNA序列和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0%、100%和100%。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的三株菌株分别为藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，并分别命名为藤黄微球菌Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074，短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073。
本发明的固体微生物菌剂及其制备方法通过以下实施例1至实施例4进行描述：
以下实施例所用牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g～20g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.2～7.4。
所用牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.2～7.4。
所用发酵培养基的组成为：酵母粉40g～100g，K2HPO41g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO40.1g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.2～7.4。
实施例1
本实施例的用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下成分混合制成：微生物菌肥90g，藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）的混合发酵液10g；所述固体微生物菌剂的含水量为5wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述微生物菌肥为西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
本实施例的固体微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在温度为37±1℃的条件下培养24h～36h，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为28±1℃的条件下培养24h，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；所述培养过程中调节摇床转速为130rpm～150rpm；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照2∶3∶2的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；所述发酵培养的接种量为8%，培养温度为28±1℃，培养 时间为36h；
步骤四、将90g微生物菌肥与10g步骤三中所述混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
本实施例制备的固体微生物菌剂中的有效活菌数为1.0×109cfu/克～1.0×1011cfu/克。
实施例2
本实施例的用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下成分混合制成：微生物菌肥85kg，藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）的混合发酵液15kg；所述固体微生物菌剂的含水量为15wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述微生物菌肥为西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
本实施例的固体微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在温度为37±1℃的条件下培养36h，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为28±1℃的条件下培养36h，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆 菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；所述培养过程中调节摇床转速为130rpm～150rpm；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照4∶5∶4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；所述发酵培养的接种量为2%，培养温度为28±1℃，培养时间为36h；
步骤四、将85g微生物菌肥与15g步骤三中所述混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
本实施例制备的固体微生物菌剂中的有效活菌数为1.0×109cfu/克～1.0×1011cfu/克。
实施例3
本实施例的用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下成分混合制成：微生物菌肥89g，藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）的混合发酵液11g；所述固体微生物菌剂的含水量为9.5wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述微生物菌肥为西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
本实施例的固体微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在温度为37±1℃的条件下培养30h，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为28±1℃的条件下培养30h，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；所述培养过程中调节摇床转速为130rpm～150rpm；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照3∶4∶3的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；所述发酵培养的接种量为5%，培养温度为28±1℃，培养时间为30h；
步骤四、将89g微生物菌肥与11g步骤三中所述混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
本实施例制备的固体微生物菌剂中的有效活菌数为1.0×109cfu/克～1.0×1011cfu/克。
实施例4
本实施例的用于降解石油的固体微生物菌剂，由以下成分混合制成：微生物菌肥87g，藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）的混合发酵液13g；所述固体微生物菌剂的含水量为11wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述微生物菌肥为西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥，菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有 机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
本实施例的固体微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus 4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在温度为37±1℃的条件下培养24h，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为28±1℃的条件下培养28h，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；所述培养过程中调节摇床转速为130rpm～150rpm；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照1∶1∶1的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；所述发酵培养的接种量为4%，培养温度为28±1℃，培养时间为32h；
步骤四、将87g微生物菌肥与13g步骤三中所述混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
本实施例制备的固体微生物菌剂中的有效活菌数为1.0×109cfu/克～1.0×1011cfu/克。
本发明研究了藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌对原油的降解能力，以及固体微生物菌剂的应用效果。
一、对原油的降解能力试验
配制原油液体培养基（NaNO31.5g，(NH4)SO41.5g，K2HPO41g， MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl20.002g，蒸馏水1000mL，原油10g），将原油液体培养基分为五组：空白对照组、藤黄微球菌组、蜡状芽孢杆菌组、短小芽孢杆菌组和混合细菌组（藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌混合）；分别将藤黄微球菌（Micrococcus luteus 4006，保藏编号CGMCC No.6072）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus4033，保藏编号CGMCC No.6074）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073）接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化24h，然后分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基内活化24h，再按照2%～8%的接种量将藤黄微球菌菌液接种于藤黄微球菌组培养基中，将蜡状芽孢杆菌菌液接种于蜡状芽孢杆菌组组培养基中，将短小芽孢杆菌菌液接种于短小芽孢杆菌组培养基中，将藤黄微球菌菌液、蜡状芽孢杆菌菌液和短小芽孢杆菌菌液按照1∶1∶1的体积比混合后接种于混合细菌组，空白对照组不接种细菌；将各组置于摇床上培养，调节摇床转速为130rpm～150rpm，28±1℃条件下培养7d；培养结束后，向各组中分别加入石油醚，离心打破水包油乳液，有机相用颗粒状无水硫酸钠过滤脱水后稀释，于260nm波长处，用1cm石英比色杯，以石油醚为空白，在UV7501型紫外可见分光光度计下测定OD值，计算培养基中的残油含量。采用公式（1）计算总石油烃的生物降解率（η%），结果见表1：
η%=（ω0-ωx）/ω0×100% （1）
式中：ω0为原油液体培养基的原油含量；ωx为各组的残油含量。
表1总石油烃降解率结果
| 组别 | 总石油烃降解率 |
| 藤黄微球菌组 | 34.8% |
| 蜡状芽孢杆菌组 | 38.5% |
| 短小芽孢杆菌组 | 37.4% |
| 混合细菌组 | 47.9% |
| 空白对照组 | 10.3% |
从表1中可以看出，这藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和混合细菌在液体摇瓶中对原油的降解能力均较高，其中，三种细菌混合培养的降解率最高，达到47.9%。
二、本发明固体微生物菌剂的应用效果
将30株土壤总石油烃污染浓度为1%的红三叶草盆栽随机分为三组：固体微生物菌剂组，微生物菌肥对照组和空白对照组，每组10株。对固体微生物菌剂组红三叶草盆栽的土壤施用本发明的固体微生物菌剂，对微生物菌肥对照组红三叶草盆栽的土壤施用微生物菌肥（西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥），对空白对照组不施加任何肥料。试验中分别进行植物发芽率、30天植物株高和鲜重（10株），总石油烃降解率测定。试验结果见表2：
表2各组植物耐受性及总石油烃降解率检测结果
| 组别 | 发芽率（%） | 株高（cm） | 鲜重（g） | 总石油烃降解率（%） |
| 固体微生物菌剂组 | 86.7 | 4.3 | 1.9 | 26.4 |
| 微生物菌肥对照组 | 73.2 | 2.9 | 1.2 | 17.3 |
| 空白对照组 | 61.9 | 1.6 | 0.6 | 9.4 |
从表2可以看出，施用本发明的固体微生物菌剂的红三叶草植株的发芽率及植物的长势均较单独施用微生物菌肥和空白对照高，说明本发明的固体微生物菌剂对植物的耐受性有积极的作用；另外，施用本发明的固体微生物菌剂后土壤中总石油烃的降解率比单独施用微生物菌肥和空白对照分别提高了9.1%和17%。
综上所述，本发明采用的藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均源于土壤，因此固体微生物菌剂进入土壤后很快形成优势菌群，占据一定生态位；另外，这三种菌均具有促进植物根生长、改善根围生态环境的作用。因此，采用本发明的固体微生物菌剂可有效降解土壤中的石油污染，将本发明的固体微生物菌剂与植物联合进行石油污染土壤的修复，修复效果更好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (8)
1.一种用于降解石油的固体微生物菌剂，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成：微生物菌肥85～90份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液10～15份；所述固体微生物菌剂的含水量为5wt%～15wt%；所述混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus4006，保藏编号CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus4033，保藏编号CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus4070，保藏编号CGMCC No.6073。
2.根据权利要求1所述的一种用于降解石油的固体微生物菌剂，其特征在于，由以下重量份的成分混合制成：微生物菌肥89份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液11份；所述固体微生物菌剂的含水量为9.5wt%。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于降解石油的固体微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌肥中有效活菌数≥0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25%，腐殖酸质量含量不低于20%，氮、磷和钾的总质量含量不低于5%。
4.一种制备如权利要求1或2所述用于降解石油的固体微生物菌剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种和短小芽孢杆菌一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种；
步骤三、将步骤二中所述藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种和短小芽孢杆菌二级菌种按照2～4∶3～5∶2～4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的混合发酵液；
步骤四、将微生物菌肥与步骤三中所述混合发酵液按重量份配比混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤一中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度为37±1℃，培养时间为24h～36h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤二中所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤三中所述发酵培养基的组成为：酵母粉40g～100g，K2HPO41g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O1.5g，MnSO40.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤三中所述发酵培养的接种量为2%～8%，培养温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
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Granted publication date: 20131016 Termination date: 20210727 |
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