CN107964402A - 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107964402A
CN107964402A CN201710528958.1A CN201710528958A CN107964402A CN 107964402 A CN107964402 A CN 107964402A CN 201710528958 A CN201710528958 A CN 201710528958A CN 107964402 A CN107964402 A CN 107964402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus
inoculum
microbial
micrococcus luteus
class inoculum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710528958.1A
Other languages
English (en)
Inventor
申圆圆
李春荣
姬雨
张帆
于博
刘健
谢金艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xian Unversity of Arts and Science
Xian University
Original Assignee
Xian Unversity of Arts and Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xian Unversity of Arts and Science filed Critical Xian Unversity of Arts and Science
Priority to CN201710528958.1A priority Critical patent/CN107964402A/zh
Publication of CN107964402A publication Critical patent/CN107964402A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/14—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing organic compounds only
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2101/00—Agricultural use

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种降解石油的生物质微生物菌剂，由以下重量份的成分组成：微生物菌肥80～85份；生物质炭2‑5份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液10‑15份。还涉及一种微生物菌剂的制备方法。本发明的固体微生物菌剂可有效降解土壤中的石油污染，将本发明的固体微生物菌剂与植物联合进行石油污染土壤的修复，修复效果更好。

Description

一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
石油类污染物的危害主要表现在对人和动物、土壤和天然水体的危害和影响。石油排入土壤后，会影响土壤的通透性，土壤颗粒受石油污染后不易被水所浸润，形不成有效的土壤内导水通路，渗水量下降，透水性降低，而且积聚在土壤中的石油烃，绝大部分是高分子有机物，它们粘着在植物根系上形成一层粘膜，阻碍根系的呼吸与水分的吸收，甚至引起根系的腐烂。另外，石油富含反应基团，它们会与无机氮、磷结合，并抑制硝化作用和脱磷酸作用，从而减少土壤有效态氮、磷含量。
生物修复是指在污染环境中加入一些物质(如营养、O2、微生物)或提高这些物质的能力，使天然生物降解过程加速的生物技术。石油污染土壤的生物修复技术根据具体操作以及菌种的来源可以分为自然衰减法、生物刺激法和生物强化法。自然衰减法和生物刺激法对污染物的降解效率低，且易产生迁移性更强的中间产物，因此应用不广泛。通过微生物操作筛选能够降解石油烃污染物的微生物，并作为外源高效菌种添加到污染土壤中，降解转化石油烃污染物的方法即为生物强化法。
理论上生物强化修复技术可以通过添加外来高效石油烃降解菌来实现石油烃的高效去除。但由于石油烃组成复杂，毒性强，且生物可用性降低等原因使原位生物强化修复的效率低。同时外来菌种受生态系统中环境因素的复杂性和波动性的冲击，接种微生物数量和活性迅速降低至无法达到预期目标，外源微生物的生存能力、活性以及迁移能力与环境因素之间的关系直接决定着生物强化修复的治理效果。制约生物强化修复技术发展的主要生态原因有生物因素和非生物因素。多数非生物因素可以通过工程措施，如调解土壤含水量、pH、添加有机碳源和无机营养物等进行调控；在生物强化修复过程中，受土壤多相复杂结构的限制，外源微生物在土壤中迁移困难，造成微生物无法与污染物有效接触并摄取污染物，微生物对污染物摄取困难是原位生物修复的一个瓶颈。
发明内容
为解决现有的技术问题，本发明提供了一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法。
本发明的具体内容如下：一种降解石油的生物质微生物菌剂，由以下重量份的成分组成：
微生物菌肥80～85份；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)和弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)的混合发酵液10-15份；
所述微生物菌剂的含水量为5wt％～15wt％；
所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillusthuringiensis 3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonasgeniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004。
此处重量份可以为克、两、斤、公斤、吨等重量计量单位。
进一步的，由以下重量份的成分组成：微生物菌肥89份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液11份；所述微生物菌剂的含水量为9.5wt％。
进一步的，还包括生物质炭，所述生物质炭的重量份为2-5份。生物质炭是一种具有比表面积大、来源广泛、富含一些对植物生长有促进作用的元素(如农业秸秆生物质炭钾含量高)的特点。如果在土壤石油污染修复过程中在微生物菌剂中添加生物质炭，对土壤中油的吸附固定及为植物提供生长所需营养元素具有积极作用。
进一步的，所述微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％。
进一步的，混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
本发明还提供了一种降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照2～4∶3～5∶2～4∶2～4∶2～4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；
步骤(4)：将微生物菌肥或微生物菌肥与生物质炭与步骤(3)中得到的混合发酵液按重量份配比混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
进一步的，在步骤(1)中，所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为24h～36h。
进一步的，在步骤(2)中，所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
进一步的，步骤(3)中所述发酵培养基的组成为：酵母粉40g～100g，K2HPO4 1g，CaCl2 0.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4。
进一步的，步骤(3)中所述发酵培养的接种量为2％～8％，培养温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
本发明中藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌筛选及鉴定方法步骤如下：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO3 0.15％，(NH4)SO40.15％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，CaCl20.0002％，蒸馏水1000mL，原油(延长石油脱水原油)0.5％，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株
保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO3 0.15％，(NH4)SO40.15％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，CaCl2 0.0002％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，原油(延长石油脱水原油)0.5％，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt％正十二烷或1wt％环己烷的的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt％正十二烷和1wt％环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt％正十二烷或1wt％环己烷的的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷或环己烷的的无机盐液体培养基变浑浊的菌株，共三株。
步骤四、鉴定：提取总DNA：
1、分别取过夜培养的三株菌株(至多2×109个)，10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液(20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HCl pH8，2.5mMEDTA，1％TritonX-100)，重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
2、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液Washbuffer；
3、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热(60℃)的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2％琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤五、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer 5μl；Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃5min；循环95℃35s，55℃35s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物(SEQ ID NO.1)：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物(SEQ ID NO.2)：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤六、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物(片段大小1.4kb左右)进行测序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5)分别与GenBank中已发表的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的16SrDNA序列、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的16SrDNA序列和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0％、100％和100％。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定三株菌株分别为藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
本发明中苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌筛选及鉴定方法步骤如下：
步骤一、富集：将10g采自延长石油集团的七里洞采油场集油站落地原油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d。其中，富集液体培养基的成分为：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选菌落进行平板划线纯化分离。将菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。
步骤二：溶油圈法筛选石油降解菌
将上述纯菌菌种接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10-15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的石油降解能力；其中，含油无机盐固体培养基的成分为：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，原油1.5mL，pH 7.0，pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。将初步筛选的石油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。
步骤三：菌种16S rDNA鉴定
(1)基因组DNA提取
按SK8255(细菌)试剂盒操作提取2种菌。
(2)PCR扩增
①菌种鉴定通用引物：
②PCR反应体系
试剂 体积(μl)
Template(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg2+) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1
酶 0.2
F(10uM) 0.5
R(10uM) 0.5
加双蒸H2O至 25
③PCR循环条件
温度 时间 程序
94℃ 4min 预变性
94℃ 45sec 30cycle
55℃ 45sec
72℃ 1min
72℃ 10min 修复延伸
4℃ ∞ 终止反应
(3)PCR产物纯化
①PCR扩增结束后，将PCR反应管中的反应液转移到干净的1.5mL离心管中，加入400管中，加入至干净的TTGT，混勾；
②将3S柱放到特制收集管，将混合液吸取到柱内，打开盖子室温放置2min，盖上离心管盖，l0000rpm离心1min；
③倾倒管中废液，在管中加入600ul wash buffer，l0000rpm离心1min；
④重复步骤③一次；
⑤倾倒管中废液，将3S柱放回收集管中，盖上离心管盖，12000rpin离心2min；
⑥将3S柱放入新的l.5mL离心管中，在3S柱中央加入20央GB3，打开盖子37℃放置2min；
⑦闭盖l0000rpm离心1min，离心管所收集的液体即为所纯化回收的DNA片段，-20℃冰箱保存。
(5)测序
将纯化后的PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果提交GenBank进行比对。分别与GenBank中已发表的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的16SrDNA序列、弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0％、99.8％。
根据16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定菌株分别为苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌。
本发明的生物质微生物菌剂的使用方法为：可在种植作物前施用于土壤或者作物种植后追施于土壤，用量以石油污染土壤的重量的1％与底肥混拌施用。
本发明采用的藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌均源于土壤，因此固体微生物菌剂进入土壤后很快形成优势菌群，占据一定生态位；另外，这五种菌均具有促进植物根生长、改善根围生态环境的作用。
本发明的固体微生物菌剂可将有益微生物引入土壤中，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤；添加入具有大比表面积的生物质炭，具有吸附固定石油污染物，为微生物及植物等提供微量元素的作用；可促进作物的生长，并降解和转化土壤中的石油污染物，抑制病虫害可增强作物的抗逆性、提高作物产量，是生态环保的绿色菌剂。
本发明的菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其中，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均于2012年5月3日，藤黄微球菌保藏编号为CGMCC No.6072，蜡状芽孢杆菌保藏编号CGMCC No.6074，短小芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.6073；苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌均于2016年9月12日保藏，苏云金芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.13005，弯曲假单胞菌保藏编号CGMCC为No.13004。
具体实施方式
本发明中藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌筛选及鉴定方法步骤如下：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO3 0.15％，(NH4)SO40.15％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，CaCl2 0.0002％，蒸馏水1000mL，原油(延长石油脱水原油)0.5％，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株
保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO3 0.15％，(NH4)SO40.15％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，KCl 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，CaCl2 0.0002％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，原油(延长石油脱水原油)0.5％，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt％正十二烷或1wt％环己烷的的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt％正十二烷和1wt％环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt％正十二烷或1wt％环己烷的的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷或环己烷的的无机盐液体培养基变浑浊的菌株，共三株。
步骤四、鉴定：提取总DNA：
1、分别取过夜培养的三株菌株(至多2×109个)，10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液(20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HCl pH8，2.5mMEDTA，1％TritonX-100)，重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
2、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液Washbuffer；
3、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热(60℃)的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2％琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤五、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer 5μl；Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃5min；循环95℃35s，55℃35s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物(SEQ ID NO.1)：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物(SEQ ID NO.2)：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤六、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物(片段大小1.4kb左右)进行测序，得到的三株菌株的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5)分别与GenBank中已发表的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的16SrDNA序列、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的16SrDNA序列和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0％、100％和100％。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定三株菌株分别为藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
本发明中苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌筛选及鉴定方法步骤如下：
步骤一、富集：将10g采自延长石油集团的七里洞采油场集油站落地原油污染土壤样品加入100mL富集液体培养基中，28℃、130r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5mL培养液重新转接入新鲜富集培养基中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。取1mL上述菌悬液，用无菌水系列稀释后，分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，29℃左右恒温培养3d。其中，富集液体培养基的成分为：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，原油I号1％(体积比)，pH 7.0。牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，营养琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.4-7.6。待平板菌落有效分离后，根据菌落颜色、形态特征及表面湿度的不同，分别用接种针挑选菌落进行平板划线纯化分离。将菌株接种于斜面，4℃冰箱冷藏备用。
步骤二：溶油圈法筛选石油降解菌
将上述纯菌菌种接种于含油无机盐固体培养基上，置于37℃培养箱中培养10-15d，观察有无嗜油圈，并根据嗜油圈直径(D)与菌落直径(d)的比值初步确定菌株的石油降解能力；其中，含油无机盐固体培养基的成分为：NaNO3 1.5g，(NH4)2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，原油1.5mL，pH 7.0，pH值用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L氯化氢调至要求值。将初步筛选的石油降解菌接种于斜面培养基，4℃冰箱冷藏备用。
步骤三：菌种16S rDNA鉴定
(1)基因组DNA提取
按SK8255(细菌)试剂盒操作提取2种菌。
(2)PCR扩增
①菌种鉴定通用引物：
②PCR反应体系
③PCR循环条件
温度 时间 程序
94℃ 4min 预变性
94℃ 45sec 30cycle
55℃ 45sec
72℃ 1min
72℃ 10min 修复延伸
4℃ ∞ 终止反应
(3)PCR产物纯化
①PCR扩增结束后，将PCR反应管中的反应液转移到干净的1.5mL离心管中，加入400管中，加入至干净的TTGT，混勾；
②将3S柱放到特制收集管，将混合液吸取到柱内，打开盖子室温放置2min，盖上离心管盖，l0000rpm离心1min；
③倾倒管中废液，在管中加入600ul wash buffer，l0000rpm离心1min；
④重复步骤③一次；
⑤倾倒管中废液，将3S柱放回收集管中，盖上离心管盖，12000rpin离心2min；
⑥将3S柱放入新的l.5mL离心管中，在3S柱中央加入20央GB3，打开盖子37℃放置2min；
⑦闭盖l0000rpm离心1min，离心管所收集的液体即为所纯化回收的DNA片段，-20℃冰箱保存。
(5)测序
将纯化后的PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果提交GenBank进行比对。分别与GenBank中已发表的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的16SrDNA序列、弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度分别为99.0％、99.8％。
根据16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定菌株分别为苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌。
本发明的生物质微生物菌剂的使用方法为：可在种植作物前施用于土壤或者作物种植后追施于土壤，用量以石油污染土壤的重量的1％与底肥混拌施用。
实施例1
一种降解石油的生物质微生物菌剂，以下重量份的成分组成：微生物菌肥89份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液11份；微生物菌剂的含水量为9.5wt％；
藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacilluspumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonas geniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004；
微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％；
混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
本实施例的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为24h。
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为24h。
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照1∶1∶1∶1∶1的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；酵母粉100g，K2HPO4 1g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4，发酵培养的接种量为8％，培养温度为28±1℃，培养时间为24h。
步骤(4)：将89份微生物菌肥和11份步骤(3)中得到的混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
实施例2：
一种降解石油的生物质微生物菌剂，以下重量份的成分组成：微生物菌肥80份，生物质炭2份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液15份，微生物菌剂的含水量为15wt％。
藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacilluspumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonas geniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004；
微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％；
混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
本实施例的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为36h。
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为36h。
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照4∶5∶4∶4∶4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；酵母粉50g，K2HPO4 1g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4，发酵培养的接种量为2％，培养温度为28±1℃，培养时间为36h。
步骤(4)：将80份微生物菌肥、2份生物质炭和15份步骤(3)中得到的混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
实施例3：
一种降解石油的生物质微生物菌剂，以下重量份的成分组成：微生物菌肥85份，生物质炭5份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液10份，微生物菌剂的含水量为5wt％。
藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacilluspumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonas geniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004；
微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％；
混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
本实施例的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为30h。
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为30h。
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照3∶4∶3∶3∶3的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；酵母粉40g，K2HPO4 1g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4，发酵培养的接种量为8％，培养温度为28±1℃，培养时间为30h。
步骤(4)：将85份微生物菌肥、5份生物质炭和10份步骤(3)中得到的混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
实施例4：
一种降解石油的生物质微生物菌剂，以下重量份的成分组成：微生物菌肥80份，生物质炭4份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液15份，微生物菌剂的含水量为8wt％。
藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacilluspumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonas geniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004；
微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％；
混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
本实施例的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为36h。
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为36h。
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照1∶2∶1∶1∶1的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；酵母粉40g，K2HPO4 1g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4，发酵培养的接种量为6％，培养温度为28±1℃，培养时间为30h。
步骤(4)：将80份微生物菌肥、4份生物质炭和15份步骤(3)中得到的混合发酵液混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
实施例5
本实施例测试藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、弯曲假单胞菌对原油的降解能力，具体步骤如下：
配制原油液体培养基(NaNO3 1.5g，(NH4)SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000mL，原油10g)，将原油液体培养基分为七组：空白对照组、藤黄微球菌组、蜡状芽孢杆菌组、短小芽孢杆菌组、苏云金芽孢杆菌、弯曲假单胞菌、混合细菌组(藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、弯曲假单胞菌混合)；分别将藤黄微球菌(Micrococcus luteus SL-3，保藏编号CGMCCNo.6072)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus SL-7，保藏编号CGMCC No.6074)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus SL-9，保藏编号CGMCC No.6073)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005)、弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata33，保藏编号CGMCC No.13004)接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化24h，然后分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基内活化24h，再按照2％～8％的接种量将藤黄微球菌菌液接种于藤黄微球菌组培养基中，将蜡状芽孢杆菌菌液接种于蜡状芽孢杆菌组组培养基中，将短小芽孢杆菌菌液接种于短小芽孢杆菌组培养基中，将苏云金芽孢杆菌菌液接种于苏云金芽孢杆菌组培养基中，将弯曲假单胞菌菌液接种于弯曲假单胞菌组培养基中，将藤黄微球菌菌液、蜡状芽孢杆菌菌液、短小芽孢杆菌菌液、苏云金芽孢杆菌菌液、弯曲假单胞菌菌液按照1∶1∶1：1:1的体积比混合后接种于混合细菌组，空白对照组不接种细菌；
将各组置于摇床上培养，调节摇床转速为130rpm～150rpm，28±1℃条件下培养7d；培养结束后，向各组中分别加入石油醚，离心打破水包油乳液，有机相用颗粒状无水硫酸钠过滤脱水后稀释，于260nm波长处，用1cm石英比色杯，以石油醚为空白，在UV7501型紫外可见分光光度计下测定OD值，计算培养基中的残油含量。采用公式η％＝(ω0-ωx)/ω0×100％计算总石油烃的生物降解率(η％)，式中：ω0为原油液体培养基的原油含量；ωx为各组的残油含量。
得到总石油烃降解率结果如下：
组别 总石油烃降解率
藤黄微球菌组 39.6％
蜡状芽孢杆菌组 40.2％
短小芽孢杆菌组 43.8％
苏云金芽孢杆菌组 48.7％
弯曲假单胞菌组 46.1％
混合细菌组 57.6％
空白对照组 15.3％
从表中可以看出，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、弯曲假单胞菌和混合细菌在液体摇瓶中对原油的降解能力均较高，其中，五种细菌混合培养的降解率最高，达到57.6％。
实施例6
本实施例测试微生物菌剂的应用效果，具体方法步骤如下：
将30株土壤总石油烃污染浓度为1％的黑麦草盆栽随机分为三组：微生物菌剂组，微生物菌肥对照组和空白对照组，每组10株。对微生物菌剂组黑麦草盆栽的土壤施用本发明实施例1中的微生物菌剂，对微生物菌肥对照组黑麦草盆栽的土壤施用微生物菌肥(西安德龙生物科技有限公司生产的12菌微生物菌肥)，对空白对照组不施加任何肥料。试验中分别进行植物发芽率、30天植物株高和鲜重(10株)，总石油烃降解率测定。得到的各组植物耐受性及总石油烃降解率检测结果如下：
从表中可以看出，施用本发明的微生物菌剂的黑麦草植株的发芽率及植物的长势均较单独施用微生物菌肥和空白对照高，说明本发明的微生物菌剂对植物的耐受性有积极的作用；另外，施用本发明的微生物菌剂后土壤中总石油烃的降解率较单独施用微生物菌肥和空白对照分别提高了78.3％和177.8％。
对各组试验土壤理化性质如土壤pH、铵态氮、硝态氮、有效磷、有效钾、有机质等指标进行测定。试验结果如下：
从表中可以看出，施加本发明的微生物菌剂后土壤的理化性质也较对照发生明显的变化。
在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种降解石油的生物质微生物菌剂，其特征在于：由以下重量份的成分组成：
微生物菌肥80～85份；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)的混合发酵液10-15份；
所述微生物菌剂的含水量为5wt％～15wt％；
所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus SL-3，保藏号为CGMCC No.6072；所述蜡状芽孢杆菌为Bacillus cereus SL-7，保藏号为CGMCC No.6074；所述短小芽孢杆菌为Bacilluspumilus SL-9，保藏号为CGMCC No.6073；所述苏云金芽孢杆菌为Bacillus thuringiensis3-1，保藏编号CGMCC No.13005；所述弯曲假单胞菌为Pseudomonas geniculata 3，保藏编号CGMCC No.13004。
2.根据权利要求1所述的降解石油的生物质微生物菌剂，其特征在于：由以下重量份的成分组成：微生物菌肥89份，藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液11份；所述微生物菌剂的含水量为9.5wt％。
3.根据权利要求1所述的降解石油的生物质微生物菌剂，其特征在于：还包括生物质炭，所述生物质炭的重量份为2-5份。
4.根据权利要求1所述的降解石油的生物质微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌肥中有效活菌数不低于0.8亿个/g，有机质质量含量不低于25％，腐殖酸质量含量不低于20％，氮、磷和钾的总质量含量不低于5％。
5.根据权利要求1所述的降解石油的生物质微生物菌剂，其特征在于：混合发酵液中的藤黄微球菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL，蜡状芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×1010个/mL，短小芽孢杆菌含量为1.0×109个/mL～1.0×1011个/mL；苏云金芽孢杆菌含量为1.0×107个/mL～1.0×108个/mL；弯曲假单胞菌含量为1.0×108个/mL～1.0×109个/mL。
6.一种如权利要求1-5所述的降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)：将藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌分别接种于固体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌一级菌种、蜡状芽孢杆菌一级菌种、短小芽孢杆菌一级菌种、苏云金芽孢杆菌一级菌种和弯曲假单胞菌一级菌种；
步骤(2)：将步骤(1)中得到的一级菌种分别接种于液体培养基中进行培养，得到藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种；
步骤(3)：将步骤(2)中得到的藤黄微球菌二级菌种、蜡状芽孢杆菌二级菌种、短小芽孢杆菌二级菌种、苏云金芽孢杆菌二级菌种和弯曲假单胞菌二级菌种按照2～4∶3～5∶2～4∶2～4∶2～4的体积比混合后接种于发酵培养基中进行混合发酵培养，得到藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和弯曲假单胞菌的混合发酵液；
步骤(4)：将微生物菌肥或微生物菌肥与生物质炭与步骤(3)中得到的混合发酵液按重量份配比混合均匀，得到可降解石油的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基，培养的温度是37±1℃，培养时间为24h～36h。
8.根据权利要求6所述的降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养的温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
9.根据权利要求6所述的降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述发酵培养基的组成为：酵母粉40g～100g，K2HPO4 1g，CaCl2 0.1g，MgSO4·7H2O1.5g，MnSO4 0.1g，蒸馏水定容至1L，pH值为7.2～7.4。
10.根据权利要求6所述的降解石油的生物质微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述发酵培养的接种量为2％～8％，培养温度为28±1℃，培养时间为24h～36h。
CN201710528958.1A 2017-06-26 2017-06-26 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法 Pending CN107964402A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710528958.1A CN107964402A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710528958.1A CN107964402A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107964402A true CN107964402A (zh) 2018-04-27

Family

ID=61997406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710528958.1A Pending CN107964402A (zh) 2017-06-26 2017-06-26 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107964402A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226430A (zh) * 2020-10-19 2021-01-15 南京师盛生态环境研究院有限公司 一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法
CN114752517A (zh) * 2021-09-17 2022-07-15 安徽工程大学 一种artp快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1410397A (zh) * 2002-12-06 2003-04-16 赵鹏 一种生物有机无机复混肥料及其生产方法
CN1434004A (zh) * 2003-03-11 2003-08-06 赵鹏 一种生物有机无机复混肥料及其生产方法
CN102839137A (zh) * 2012-07-27 2012-12-26 长安大学 一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法
CN105154100A (zh) * 2015-09-02 2015-12-16 山东农大肥业科技有限公司 一种酸性土壤调理剂及其连续蒸压装置和方法
CN106635909A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 长安大学 一种原油降解混合菌、菌剂及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1410397A (zh) * 2002-12-06 2003-04-16 赵鹏 一种生物有机无机复混肥料及其生产方法
CN1434004A (zh) * 2003-03-11 2003-08-06 赵鹏 一种生物有机无机复混肥料及其生产方法
CN102839137A (zh) * 2012-07-27 2012-12-26 长安大学 一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法
CN105154100A (zh) * 2015-09-02 2015-12-16 山东农大肥业科技有限公司 一种酸性土壤调理剂及其连续蒸压装置和方法
CN106635909A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 长安大学 一种原油降解混合菌、菌剂及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226430A (zh) * 2020-10-19 2021-01-15 南京师盛生态环境研究院有限公司 一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法
CN114752517A (zh) * 2021-09-17 2022-07-15 安徽工程大学 一种artp快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102839137B (zh) 一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法
CN103981119B (zh) 含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用
CN102533619B (zh) 一种氯代烃高效好氧降解混合菌剂的制备方法与应用
CN109182178B (zh) 一株具有铬耐受和Cr(VI)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用
CN104803721B (zh) 一种油基钻井废弃物的生物堆肥处理方法
CN104911127A (zh) 一种根瘤菌及其菌剂和制备方法与应用
CN110217895A (zh) 一种用于水环境治理的复合微生物菌剂及其应用
CN109486726A (zh) 一株可降解石油烃的菌株及其应用
CN104403965B (zh) 一种降解水体四环素污染物的栖木槿假单胞菌及其应用
CN103215204A (zh) 高效降解菲的节杆菌菌株及其应用
CN106520604A (zh) 一株产acc脱氨酶的固氮菌及其在土壤生态修复中的应用
CN108795808A (zh) 一株巴达维亚芽胞杆菌及其应用
CN102757920B (zh) 一种短小芽孢杆菌及其应用
CN111482453A (zh) 一种利用植物和真菌联合修复重金属污染土壤的方法
CN108893436A (zh) 一株耐盐碱黄赭色链霉菌及其应用
CN109554305B (zh) 一种模拟微生态的益生菌的筛选方法、修复剂及其应用
CN107964402A (zh) 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法
CN103045500B (zh) 中慢生根瘤菌kdrm295及其应用
CN104818234A (zh) 一株具有耐镉特性的链霉菌及其应用
CN106244501B (zh) 一株抗锑细菌nxh1及其应用
CN107974415A (zh) 一株砷氧化菌在修复稻田三价砷污染方面的应用
CN104498408B (zh) 一株产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌utm104 及其应用
CN105154350B (zh) 一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备方法和应用
CN104560815B (zh) 一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用
CN104805018B (zh) 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp．)MT‑E

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180427

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication