CN114752517A - 一种artp快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用 - Google Patents
一种artp快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用，所述的菌株为副地衣芽孢杆菌；保藏名称为副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路；保藏日期：2021年08月03日；保藏编号：CGMCC No.1.19152。本发明从芜湖炼油厂采集的土壤混合样中以期分离出石油降解菌，筛选环境适应强，该菌具有较强的石油降解能力，验证了微生物修复技术在土壤石油污染土壤具有良好的修复效果，对于生物技术修复石油污染的土壤有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用。
背景技术
近几十年来，随着原油工业的迅速扩张，原油在开采、运输、加工、储存过程中不可避免地会发生泄漏事故，造成土壤及水体的严重污染。石油的主要成分具有较大毒性，污染物进入土壤后难以去除，长期污染会引起土壤生物群落结构发生改变，从而损害作物生长并导致土地生产力急剧下降。污染物还会随着径流进入周围的流域和地下水，严重影响水域生物群落的正常生长繁殖、破坏种群间的信息传递，污染严重的区域会造成物种窒息死亡、水产品质量下降，对人体及生态系统造成严重的影响。
解决石油污染问题研究最多的是通过物理法与化学法，但存着成本较高、易造成二次污染等诸多问题。一种高效、经济和生态可承受的绿色清洁技术——生物修复技术，被广泛应用到环境污染治理领域，成为一种替代化学和物理技术的修复石油污染土壤的新技术，生物修复技术可直接快速地分解石油，具有环境友好、操作简单、处理费用低廉以及对操作人员危害小等诸多优点，同时有些菌株能很好的适应强酸强碱等极端环境，因此向石油污染土壤中投加环境适应强、降解效能高的菌种或菌群是提高生物修复效率的关键。
土壤作为最大的微生物资源库，土壤是分离石油降解菌的重要来源之一。已报道的能够降解石油的土壤微生物已有90余属200余种，其中包括假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假丝酵母属(Candida)等都是常被分离筛选出的石油降解菌群。
目前，缺乏一种广泛开展从原油污染土壤的土著微生物中筛选环境适应强、降解效能高的菌种并优选其作为生物强化剂的应用，可有效地促进石油污染土壤的生物修复效率。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，提供了一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种菌种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株，所述的菌株为副地衣芽孢杆菌；保藏名称为副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路；保藏日期：2021年08月03日；保藏编号：CGMCC No.1.19152。
本发明的所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的副地衣芽孢杆菌制备的副地衣芽孢杆菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的副地衣芽孢杆菌的发酵培养物；
(b)所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的制备方法，包括如下步骤：(1)石油降解菌的富集筛选：称取5.0g新鲜土样加入装有100mL0.9％无菌生理盐水的三角瓶中，振荡40min；
(2)静置后取5mL上清液接入到50mL LB液体培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养24h；取上述培养液按5％(V/V)接种量接入100mL含1％原油的富集培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养7d，按5％的接种量将富集液转接在含有2％石油的富集培养基中，在相同条件下培养7d，再次按5％的接种量转接于含有3％石油的富集培养基中振荡培养7d，进行富集驯化；
(3)将以上富集液吸取梯度稀释10-4～10-5，涂布于LB平板上，30℃培养2～3d，根据菌落形态将初筛菌株及时挑取在LB固体平板上划线，单菌落3～4次的连续划线，直至制得ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株。
进一步地，在步骤(3)中，将纯化后的菌株单菌落接种在LB固体平板上划线，37℃恒温培养2d，期间观察其生长情况，菌落形态，显微镜下观察革兰氏染色及芽孢染色特性。
本发明所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株在制备生物强化制剂中的应用。
进一步地，所述的生物强化制剂为石油降解制剂。
进一步地，所述的石油降解制剂在修复石油污染方面的应用。
进一步地，所述的石油降解制剂在修复石油污染土壤方面的应用。
有益效果：本发明从芜湖炼油厂采集的土壤混合样中以期分离出石油降解菌，筛选环境适应强，该菌具有较强的石油降解能力，验证了微生物修复技术在土壤石油污染土壤具有良好的修复效果，对于生物技术修复石油污染的土壤有着良好的开发应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明为丰富石油降解微生物菌种库，筛选适应性更强的石油高效降解菌株，以原油为唯一碳源的基础培养基中进行富集纯化、驯化培养，在原油初浓度1g/L，200rpm·min-1的条件下降解7d的测定，结合排油活性，乳化指数(E24)与石油降解率的初步评价，从初筛的8株石油降解菌中筛选出1株高效降解菌株，命名为JZ3，其排油圈直径为6.6cm，乳化指数13.33％，石油降解率39.77％。
(2)利用常压室温等离子体(ARTP)方法对菌株JZ3进行快速诱变，经过3轮诱变筛选出两株正突变株Y1与Y3，两个突变株在7d后对1％原油降解率分别提高至41.78％与45.10％，与原始菌株差异达显著水平(P<0.05)。
(3)大量的原油及其制品进入环境造成严重的环境污染，生物修复治理是利用石油烃降解微生物菌株分解石油转化为无害物质，具有高效、无二次污染与经济等优点利用人工原油污染土壤，通过原位修复盆钵模拟试验研究，验证Y1与Y3适应性强，具有较强的石油降解能力。
附图说明
图1为本发明的原油标准曲线图。
图2为本发明的菌株在1％原油MSM培养基中石油降解率图。
图3为本发明的8株菌株排油圈的测定图。a:8株菌排油圈大小测定图；b:JZ3与JZ7的排油圈。
图4为本发明的8株菌的乳化指数E24图。
图5为本发明对菌株JZ3进行形态特征观察图。
图6为本发明的菌株JZ3和亲缘关系近的芽孢杆菌属的模式菌株之间关系的系统进化树图。
图7为本发明的菌株JZ3的致死率曲线图。
图8为本发明的含1％原油的MSM培养基菌株7d与14d的石油降解率图。
图9为本发明的对突变株的乳化指数E24的测定图。
图10为本发明的不同时间段菌株的石油降解率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明的一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株，所述的菌株为副地衣芽孢杆菌；保藏名称为副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路；保藏日期：2021年08月03日；保藏编号：CGMCC No.1.19152。
本发明的所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的副地衣芽孢杆菌制备的副地衣芽孢杆菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的副地衣芽孢杆菌的发酵培养物；
(b)所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的制备方法，包括如下步骤：(1)石油降解菌的富集筛选：称取5.0g新鲜土样加入装有100mL0.9％无菌生理盐水的三角瓶中，振荡40min；
(2)静置后取5mL上清液接入到50mL LB液体培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养24h；取上述培养液按5％(V/V)接种量接入100mL含1％原油的富集培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养7d，按5％的接种量将富集液转接在含有2％石油的富集培养基中，在相同条件下培养7d，再次按5％的接种量转接于含有3％石油的富集培养基中振荡培养7d，进行富集驯化；
(3)将以上富集液吸取梯度稀释10-4～10-5，涂布于LB平板上，30℃培养2～3d，根据菌落形态将初筛菌株及时挑取在LB固体平板上划线，单菌落3～4次的连续划线，直至制得ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株。
在步骤(3)中，将纯化后的菌株单菌落接种在LB固体平板上划线，37℃恒温培养2d，期间观察其生长情况，菌落形态，显微镜下观察革兰氏染色及芽孢染色特性。
本发明所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株在制备生物强化制剂中的应用。
所述的生物强化制剂为石油降解制剂。
所述的石油降解制剂在修复石油污染方面的应用。
所述的石油降解制剂在修复石油污染土壤方面的应用。
实施例1
本发明采集芜湖炼油厂附近长期受原油污染土壤混合样，分离筛选原油降解菌株，结合菌株的形态、生理特征及16S rRNA序列分析对其进行初步鉴定，通过菌株的降解特性分析，结合ARTP生物诱变育种技术构建高效的石油降解菌群，研究其对原油污染土壤的修复效果，以期为石油污染土壤的微生物修复提供高效菌源和理论依据。
1材料与方法(materials andmethods)
1.1样品采集
供试土壤：土壤样品采集于芜湖炼油厂附近。共设置4个样地，每个样地按照五点取样法，采样时剖开表层土，取新鲜土壤5cm～10cm处污染土壤1.0kg左右，将每个样地5份土样混匀装入无菌袋中带回实验室备用。
1.2主要试剂
原油：主要组成成分为烷烃，是一种粘稠的深褐色液体，由芜湖中油石油公司提供。
1.3培养基
原油无机盐培养基(MSM,g/L)：NaCl 10.0，NH4Cl 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.5，CaCl2 0.2，KCl 0.1，FeCl2·4H20 0.02，ddH2O 1.0L，原油1.0～3.0g，pH 7.0。此培养基用于降解菌的富集筛选。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，ddH2O 1.0L，
pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.0，(NH4)2SO4 2.5，KH2PO4 10.0，Na2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，ddH2O 1.0L，pH 7.0，115℃条件下灭菌30min。
培养条件：以上原油无机盐培养基与LB培养基在0.103×106pa，121℃条件下灭菌20min，接种后均在30℃恒温培养箱中振荡培养。
1.4方法
1.4.1石油降解菌的分离纯化和富集筛选
石油降解菌的富集筛选：称取5.0g新鲜土样加入装有100mL 0.9％无菌生理盐水的三角瓶中，振荡40min；静置后取5mL上清液接入到50mL LB液体培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养24h；取上述培养液按5％(V/V)接种量接入100mL含1％原油的富集培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养7d，按5％的接种量将富集液转接在含有2％石油的富集培养基中，在相同条件下培养7d，再次按5％的接种量转接于含有3％石油的富集培养基中振荡培养7d，进行富集驯化。将以上富集液吸取梯度稀释10-4～10-5，涂布于LB平板上，30℃培养2～3d，根据菌落形态将初筛菌株及时挑取在LB固体平板上划线，单菌落3～4次的连续划线，直至得到单一菌株。
1.4.2菌株的显微观察与16S rRNA基因序列分析
细菌的简单染色和芽孢染色，生理生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版进行。
形态特征观察：将纯化后的菌株单菌落接种在LB固体平板上划线，37℃恒温培养2d，期间观察其生长情况，菌落形态，显微镜下观察革兰氏染色及芽孢染色特性。
生理生化特性分析：利用氧化酶活性、吲哚试验、甲基红反应、乙酰甲基甲醇试验、糖类发酵试验、接触酶试验、硫化氢产生试验、明胶液化试验、淀粉水解试验等实验对菌株进行生理生化特性分析。
16S rRNA基因序列分析：利用Uniq-10柱式DNA抽提试剂盒提取细菌的基因组DNA，采用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(与16SrRNA5’端匹配)和反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(与16S rRNA 3’端匹配)，将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，提交给上海生物工程技术有限公司进行测序，测序结果利用网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST同源性搜索，采用MEGA-X软件，按照邻接法(Neighbor-joining)法聚类，选择1000个重复做Bootstrap值分析，构建系统进化树。利用BankIt向NCBI在线提交16S rRNA基因序列，申请菌株在Genbank中的序列登录号。
1.4.3石油标准曲线的测定
称取0.100g原油溶于正己烷中，移至50mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀。移取1mL溶液至100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，此溶液的浓度为20mg·L-1。取4个25mL容量瓶，分别移取5、10、15、20mL上述溶液，用正己烷稀释至刻度线，摇匀，所得即为一系列不同浓度的标准原油使用溶液。在225nm波长处，用10mm石英比色皿，根据测定不同浓度原油溶液的吸光度值(如表1)，所得出的结果绘制出标准曲线。原油标准液OD值如表1所示：
表1
1.4.4菌株的原油降解率的测定
将分离筛选的纯菌株接入到已经灭菌的原油培养基中，于200rpm·min-1，30℃的摇床培养7d后，观察原油降解效果。采用称重法测石油降解率。将培养7d的培养液倒入250mL的分液漏斗，取10mL正己烷冲洗摇瓶后一并倒入分液漏斗中，加盖充分振荡2min，并注意放气，静置，待分层后分离。收集上层液用10mL正己烷洗涤3次，合并上层液转入干净的50mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，在分光光度计λ225nm波长处以正己烷为参比液测定样品的OD值，根据回归方程计算：
1.4.5石油降解菌降解性能的测定
油扩散法测定排油活性：将菌株接种到50mL发酵培养基中，于200rpm·min-1，30℃条件下振荡培养3d后，将发酵液于8000rpm·min-1，离心10min，去除发酵液中的细胞体，用上清液测定排油活性。将0.5g苏丹III溶于100mL液体石蜡中，过滤除杂，121℃灭菌20min制成排油圈测定液，于常温下保存备用。取直径90mm规格的培养皿，加入ddH2O 20mL，加入苏丹III测定液200μL于ddH2O中，形成稳定油膜。将100μL发酵液滴加于油膜中央，待排开后，测量其排油圈直径，连续3次，取平均值作为菌株排油圈直径。
乳化指数E24的测定：将5.0mL的液体石蜡和5.0mL的无细胞上清液在10mL玻璃试管中高速涡旋2min，设置平行对照，0.75％的SDS溶液为阳性对照，不加菌株的新鲜发酵培养基为阴性对照，室温静置24h。E24的计算公式如下：
式(2)中HEl为乳液层高度，HTl为总混合物高度。
1.4.6ARTP诱变选育
将菌体培养至对数生长期后期，加无菌水稀释至细胞密度OD600nm值为1.0～1.2，利用清华大学化工系自主研发的ARTP诱变育种机(Ⅱ型)装置对稀释好的菌悬液进行诱变，在一定的工作条作下，诱变可变操作参数是处理时间。为了寻找最佳的诱变处理时间，如表1所示的ARTP操作条件下，分别考察照射时间从30s开始依次增加到150s，诱变完成后，再将处理的样品在适当稀释度下涂平板，通过CFU来计算致死率。
致死率按如下公式计算：
Lethality UT(％)＝(U-T)/U×100％ (3)
式(3)中U为不经过诱变处理对照菌的总菌落数，T为经诱变处理后对应的总菌落数。ARTP诱变条件参数如表2所示：
表2
将获得的突变株接种于发酵培养基中，30℃恒温培养箱中振荡培养7d，结合上面的2.4.4与2.4.5方法测定突变株的石油降解性能。
1.4.7土壤修复模拟试验
原油污染土壤处理：供试土壤为安徽工程大学花园土10～20cm，试验前经粉碎、除杂、风干及混匀处理过2mm筛目，经测定土壤湿容重为1.7～1.9g/cm3，干容重为1.49g/cm3，自然含水量9.5％，pH 8.1，于600℃灭菌4h，以杀灭土壤中其他微生物。准确称取500.0g灭菌供试土壤，使土样均匀分布于预先灭菌的塑料盆(直径15cm，高15cm)，加入原油标准溶液5g·L-1，加入原油后，土壤在塑料容器密封处理14d，以允许原油在土壤基质中充分分散和吸附，待溶剂完全挥发后，形成石油烃质量浓度为5.0g·kg-1的油土固体培养基。
室内模拟修复实验：菌株接种入LB液体培养基，在30℃条件下，200rpm·min-1振荡培养24h，每个土壤样品均匀接入3mL OD600值为1.0～1.2的菌液，再加入30mL的MSM液体培养基，分别用小型喷壶均匀地喷洒在石油污染的土壤中，以不加菌液的MSM液体培养基作为空白对照。根据土壤水分蒸发状况，每天用喷壶均匀补充水分，使土壤含水量保持在15％-20％左右，每隔3d翻动土壤以保证充氧量，使土壤疏松。降解时间持续30d，每10d从空白对照组和试验组分别采集约2.0g湿土样品，每组处理3个平行，分析土壤中石油的降解去除含量，整个实验在室温下进行。
土壤中石油烃的测定：利用重量法测定处理后土壤中残余总石油烃含量。土壤称取2.0g，装入5mL离心管中，加入3mL正己烷，160rpm·min-1振荡20min后，5000rpm·min-1离心5min，提取土壤样品中的石油。离心后溶液移入预先称重的灭菌的离心管，蒸发浓缩24h，每组实验平行3次，对处理后的残余石油进行称重，并通过式(4)计算石油降解率。
式(4)中，η为石油降解率，C0是石油的初始含量，Ci是试样中剩余石油含量。
2结果与分析(Results and analysis)
2.1石油标准曲线的绘制
在最佳吸收波长225nm下，绘制正己烷溶解原油溶液吸光度值标准曲线，如图1所示，当原油质量浓度在8mg·L-1～20mg·L-1之间时，与吸光度值的关系符合朗伯-比尔定律。图1为本发明的原油标准曲线图。Figure.1 Standard absorbance curve of crudeoil with different concentration。标准曲线线性回归方程为：y＝0.0271x+0.0098，R2＝0.9966。
2.2石油降解菌的初筛
以1％原油为唯一碳源的无机盐液体培养基进行富集、驯化培养，从中挑选生长旺盛的16株进行转接，分别编号为JZ1、JZ2、JZ3、JZ4、JZ5、JZ6、JZ7、JZ8、JZ10、JZ11、JZ12、JZ13、JZ14、JZ15、JZ16、JZ17，对各菌株菌落形态特进行观察，各菌落形态特征如表3所示。
表3
2.4菌株的原油降解实验
2.4.1原油降解率的测定
图2为本发明的菌株在1％原油MSM培养基中石油降解率图。将16株菌株接种入100mL原油含量1％的无机盐培养基中，200rpm·min-1，30℃下振荡培养7d，8株降解效果较好，其中编号分别为JZ1、JZ3、JZ6、JZ7、JZ8、JZ11、JZ12、JZ14，它们其对原油的降解现象及降解率如表3所示与图2所示，由表4可知，8株菌中，JZ3与JZ7降解效果优于其它菌株，它们的石油降解率分别为39.77％与37.19％。7d后菌株对石油的降解情况及降解率如表4所示：
表4
2.4.2菌株排油圈与乳化指数E24的测定
将分离纯化得到的8株石油降解菌发酵培养3d后，按照第2.4.5的方法对从细菌培养液中获得的无细胞上清液测定其排油活性，筛选出了6株排油圈直径大于5.0cm菌株，而注入新鲜LB培养基的对照组(CK)的含油表面没有任何变化，表明细菌发酵液中含有某种表面活性物质，其中JZ3和JZ7的排油活性最好，排油圈直径分别为6.6cm与6.0cm，图3为本发明的8株菌株排油圈的测定图。a:8株菌排油圈大小测定；b:JZ3与JZ7的排油圈；Figure.3The oil displacement activity of 8 strains。
乳化试验可证实分离菌株的生物表面活性剂产量和乳化潜力，如图4所示，在8株菌中JZ3和JZ7的E24值分别为13.33％与12.72％，明显高于其他菌株，与阳性对照SDS的50.68％相比，这两种菌株均具有产生大量表面活性化合物的潜力，这一特性可能是原油生物降解的关键。图4为本发明的8株菌的乳化指数E24的示意图。
结合石油降解率、乳化指数E24与排油圈的综合考虑，最终选取JZ3作为后续的鉴定及ARTP诱变选育的原始菌株。
2.5原油高效降解菌JZ3的鉴定
2.5.1菌株的形态特征观察
图5为本发明对菌株JZ3进行形态特征观察图，JZ3菌落呈圆球形，菌落边缘整齐，表面光滑湿润，呈白色，显微检测菌体形态呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，图5b所示中空的芽孢着生于细胞中央(绿色箭头)，芽孢染色图5c中，红色为营养体，绿色为芽孢(位于中央)。图5为本发明的菌株菌落形态及革兰氏染色与芽孢染色图；a:JZ3的菌落形态；b:革兰氏染色(G+)；c:芽孢染色(绿色为芽孢，红色为营养体)；Figure.5 Colony morphology onPlate(a),Gram stain(b)and spore stain(c)
2.5.2菌株JZ3的生理生化特征分析
菌株JZ3的生理生化试验结果如表5所示。
表5
注：+表明反应阳性；-表明反应阴性
2.6 16S rRNA基因序列的分析
根据菌株形态观察与多项生理生化实验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》等，可初步鉴定菌株JZ3为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
提取菌株JZ3的基因组DNA作模板，利用16S rRNA基因通用引物27F/1492R进行PCR扩增。将产物提交上海生工克隆测序，核苷酸序列全长为1372bp，将该序列与GenBank数据库中报道的16S rRNA基因序列进行BLAST比对，菌株JZ3与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)相似性为99％，按相似度高低选取相关的模式菌株，运用邻接法(NJ)构建系统发育树，如图6所示。结合菌株的形态观察结果及生理生化试验结果，初步确定JZ3为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)，GenBank号为MZ 411462，目前菌株JZ3已提交保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号CGMCC No.1.19152。图6为本发明的菌株JZ3和亲缘关系近的芽孢杆菌属的模式菌株之间关系的系统进化树图；Figure.6 Phylogenetictree of the relationship among strain JZ3 relative to the type strains ofspecies in the genera Bacillus。
2.7 ARTP诱变选育
2.7.1 ARTP诱变致死曲线的测定
按照本发明方法1.4.6，对菌株JZ3的ARTP致死率曲线进行了测定，如图7所示。图7为本发明的菌株JZ3的致死率曲线图；Fig.7 Variation of the lethal rate of JZ3with the ARTP treatment time；
菌株JZ3的诱变处理时间从30s到150s，随着时间的增加，菌株的致死率不断上升。处理90s致死率接近70％，处理120s以后致死率达到了72.3％，由于菌体在等离子体轰击下突变具有随机性，致死率和正突变之间的关系并不呈线性相关，为提高石油降解能力和生存能力较强菌株的几率，综合考虑能源节约等因素，本发明将致死率控制在70％以上，故选取处理时间为90s的条件作为ARTP研究中获得正突变株的诱变时间。
2.7.2高效石油降解菌突变株的筛选
实验经过连续3轮ARTP诱变之后，突变率趋于稳定，因此，挑选第3次诱变后生长旺盛的菌落进行转接，连续3次，得到4株突变株，编号Y1～Y4，将它们移入100mL石油含量为1％的MSM液体培养基中，在200rpm·min-1、30℃下振荡培养14d，其对1％原油的降解率如图8所示。图8为本发明的含1％原油的MSM培养基菌株7d与14d的石油降解率图；Figure 6Comparison of degradation rates of mutants in MSM medium containing 1％crudeoil；从图8看出，原始菌株JZ3石油降解率7d与14d分别为39.82％与52.92％，诱变获得的4株突变株中Y1与Y3对1％的原油降解率7d为41.78％与45.10％，14d分别为56.11％与58.24％，均明显优于原始菌株与其他突变株，差异达显著水平(P<0.05)，降油效果表现较好，其中突变株Y2与Y4的降油率均小于JZ3。
同时对突变株的乳化指数E24的测定结果中看出(图9)，突变株Y1与Y3的E24值分别达到15.79％与18.33％，均高于其他菌株，且高于原始菌株JZ3的E2413.38％。
在以上实验过程中，在整个降解实验过程中，空白对照组的原油油滴聚集物悬浮在MSM介质的表面，在14d内始终保持清晰和透明，而突变株在试验瓶的油滴较为均匀地分散在培养基的顶层，并随着降解时间的延长原油逐渐被乳化，原油以微滴状态存在，摇动后易于分散在培养基中。E24的测定表明突变株均具有较强的表面疏水性，并产生生物乳化剂，使原油分散，从而降低原油粘度。将Y1与Y3转接4次考察其遗传稳定性，培养7d后石油降解率稳定41～45％之间，遗传稳定，因此选择Y1与Y3做后续石油污染的生物修复模拟试验。
2.7.3土壤修复模拟试验
石油烃类进入土壤，由于石油的低溶解性，吸附在石油表面的土壤颗粒不易被水浸润，水分在土壤中行不成有效的通道，导致表层土壤出现板结现象，降低土壤的透气性能。本发明为了验证微生物对土壤的修复能力，分别测试了单个菌株和混合菌株的降解能力，将菌株Y1、Y3，以及Y1与Y3复合菌群(V/V＝1:1)分别加入含石油量5g·kg-1的土壤中进行修复模拟试验，10d，20d，30d定期取土样，石油降解率结果如图10所示。图10为本发明的不同时间段菌株的石油降解率图；Figure.10 Changes of Petroleum degradation rateof strains with different time；
从整个模拟实验周期观察，微生物技术在土壤石油污染修复中是具有一定实效的。试验早期由于土壤样品与空气之间的接触面积较大，有利于低沸点组分如短链烷烃的挥发，随着培养时间的延长，试验组对土壤中的原油组分表现出不同程度的降解作用。在降解前期土壤中原油量丰富，微生物需经过了一个适应期或是细菌的延滞期(lag phase)，而后进入增殖期也是对数期(logarithmic phase)成功存活并迅速增殖，生物量的增加促进了原油的降解进程，因此在10d后单个菌株与混合菌株的石油降解率分别达到28.21％、30.67％和38.23％，前期对原油污染土壤的修复效果较佳，而对照区未加微生物的土壤石油含量变化不大，说明自然条件下，土壤中石油降解是缓慢的。
试验中期，随着时间的推移，原油残留量减少，且土壤中难降解难挥发的高分子碳烷烃、环烷烃和芳烃组分的累积，弱化了微生物的降解作用，导致原油降解速率减缓，20d单个菌株与混合菌株的石油降解率分别为37.17％、41.68％和45.79％；在试验30d末期，微生物可能产生分解石油的诱导酶，致使石油的降解率又有所升高，混合菌株石油降解率已达到65.32％，混合菌株试验组的原油去除率高于两个单菌株的试验组，表明微生物群落的协同作用能够更有效地处理各种碳氢化合物的降解，对提高石油污染土壤的生物修复具有成效。其中空白对照土壤原油去除率在10d后稳定在2～4％左右，30d时原油去除率为3.85％，空白组的石油去除率主要由自然条件下低分子量石油烃的挥发及土壤的物理吸附作用导致的检出率损失等形成。这与Murygina等研究试验结果基本一致。
在30d的土壤模拟试验期间，一方面通过翻耕处理与改善了土壤的透气性能，增加了土壤中氧气的含量，从而增强了好氧性原油降解菌群的代谢活性；另一方面试验期间保持土壤的含水率在15～20％之间，尽量减弱含水率对土壤微生物降解石油的效果。含水量对土壤原油降解具有双重性，过低的土壤含水率影响微生物正常生理代谢所需水分的供应，造成微生物代谢活性的减弱，从而导致原油的降解率降低；而含水率过高时，原油悬浮于水面，抑制氧气的传质，从而弱化微生物对石油烃的降解性能。
3结论与讨论(Conclusions and Discussions)
石油主要是由链烷烃、环烷烃和芳香烃这些烃类化合物组成。在适宜条件下，微生物以石油烃作为碳源为其生长繁殖提供所需的能量，经过一系列自身代谢反应如氧化还原、分解合成等生化作用，将石油降解成无害的CO2与H2O等。一般情况下，只有1％的微生物可以降解石油烃，但是在石油污染区域的微生物可在自然条件下驯化产生大量的石油烃降解菌，降解石油烃的微生物比例可提高到10％。许多微生物是以石油烃为碳源和能源进行生长繁殖，因此科研人员定向筛选可降解石油烃微生物，并在实验室和受污水域对石油烃进行降解。研究证实有效降解石油烃的细菌天然存在于炼油厂复杂的废物中。
微生物降解石油大部分是通过酶促反应实现的，微生物种类不同其代谢途径及物质传递方式也不相同。目前已发现能降解石油烃的微生物有200多种，石油的降解是一个极为复杂的过程，需要多种微生物的共同参与协同完成。生物修复相对于物理、化学修复已经取得明显的工程技术优势，但其自身依然存在着诸多的问题。如降解机理和影响因素有待进一步深入分析；需要筛选更多的高效降解菌和更好地理解微生物菌群之间的代谢合作关系；修复周期长、易受环境影响、难以实现废物资源化等问题。
本发明自芜湖炼油厂样品中分离得到一株原油降解菌JZ3，该菌株培养7d对1％原油的降解率为为39.77％，产表面活性剂特性明显，能够很好乳化降解原油。经形态观察、生理生化特性测定及其16S rRNA基因序列分析，鉴定为副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)。利用常压室温等离子方法进行诱变，将原始菌株JZ3通过ARTP快速诱变改良后，突变株的石油降解率有所提高。为了验证突变株降解石油的遗传稳定性，通过3次连续传代培养，结果表明ARTP诱变后突变株Y1与Y3降解石油率变化稳定，两个突变株在7d内对1％原油降解率分别提高至41.78％与45.10％，与原始菌株差异达显著水平(P<0.05)。
通过30d的石油残油污染土壤的生物修复模拟实验研究，比较了混合菌群与两种单一纯菌株的生物修复技术，并辅以翻耕调湿等实现供氧、保持水分的调控改善土壤条件，验证了微生物修复技术在土壤石油污染土壤具有良好的修复效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽工程大学
<120> 一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1372
<212> DNA
<213> 人工序列(副地衣芽孢杆菌菌株的16S rRNA核苷酸序列)
<400> 1
atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 60
tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttga ttgaaccgca 120
tggttcaatt ataaaaggtg gcttttagct accacttaca gatggacccg cggcgcatta 180
gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct gagagggtga 240
tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300
ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat 360
cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga atagggcggt accttgacgg 420
tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 480
aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta agtctgatgt 540
gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga 600
ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg 660
cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcgaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc 780
gccctttagt gctgcagcaa acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 840
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900
agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga gatagggctt 960
ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc 1080
actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1140
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gaacaaaggg cagcgaagcc 1200
gcgaggctaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac 1260
tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tc 1372
Claims (10)
1.一种ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述的菌株为副地衣芽孢杆菌；保藏名称为副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路；保藏日期：2021年08月03日；保藏编号：CGMCC No.1.19152。
2.权利要求1所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的16SrRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌制备的副地衣芽孢杆菌菌剂。
4.根据权利要求3所述的副地衣芽孢杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得副地衣芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。
5.权利要求1所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)石油降解菌的富集筛选：称取5.0g新鲜土样加入装有100mL0.9％无菌生理盐水的三角瓶中，振荡40min；
(2)静置后取5mL上清液接入到50mL LB液体培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养24h；取上述培养液按5％(V/V)接种量接入100mL含1％原油的富集培养基中，30℃，200rpm·min-1振荡培养7d，按5％的接种量将富集液转接在含有2％石油的富集培养基中，在相同条件下培养7d，再次按5％的接种量转接于含有3％石油的富集培养基中振荡培养7d，进行富集驯化；
(3)将以上富集液吸取梯度稀释10-4～10-5，涂布于LB平板上，30℃培养2～3d，根据菌落形态将初筛菌株及时挑取在LB固体平板上划线，单菌落3～4次的连续划线，直至制得ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株。
6.根据权利要求5所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，将纯化后的菌株单菌落接种在LB固体平板上划线，37℃恒温培养2d，期间观察其生长情况，菌落形态，显微镜下观察革兰氏染色及芽孢染色特性。
7.权利要求1或2所述的ARTP快速诱变石油降解的副地衣芽孢杆菌菌株在制备生物强化制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的生物强化制剂为石油降解制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的石油降解制剂在修复石油污染方面的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的石油降解制剂在修复石油污染土壤方面的应用。
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