CN112980746A

CN112980746A - 一株石油降解菌及其应用

Info

Publication number: CN112980746A
Application number: CN202110487521.4A
Authority: CN
Inventors: 任承钢; 刘正一; 秦松; 解志红; 王晓丽
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-05-06
Also published as: CN112980746B

Abstract

本发明属应用微生物技术领域，涉及一株可以高效降解石油组分的索诺拉沙漠芽孢杆菌DY157及其应用。索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）DY157，已于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20478，保藏地址为中国北京，分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.。该菌株具有较强的石油降解能力；能够直接将石油污染物作为唯一营养来源进行分解利用；同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接用于石油污染土壤的治理；具有开发成石油污染土壤修复的微生物菌剂的良好前景。

Description

一株石油降解菌及其应用

技术领域

本发明属应用微生物技术领域，涉及一株可以高效降解石油组分的索诺拉沙漠芽孢杆菌DY157及其应用。

背景技术

中国是石油生产、消费大国。随着我国石油工业的发展, 受石油污染土地的面积不断扩大。长期以来由于生产技术及生态观念等方面的落后，石油采集及后续加工使用过程造成的污染问题仍十分严重。

石油的主要组分有烷烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃。其中多环芳烃类具有强烈的致癌致畸作用。石油混入土壤后阻碍根系的呼吸和对水分的吸收，而且会随着径流进入周围的流域和地下水,给油田周围的环境带来严重的生态问题。

土壤的石油污染修复可按手段性质不同，分为物理方法、化学方法和生物方法。物理和化学方法具有见效快的优点，但修复费用昂贵、生态效应不佳且具有次生污染的风险。而生物修复则可以将石油组分转化为无害的无机化合物（水和二氧化碳），具有费用低、效率高、生态友好的优点，被视为一项具有广阔前景的高新技术, 近十几年来, 在国外得到较好发展。

现有关于土壤石油生物修复的研究多为外源添加氮、磷等复合营养物质刺激土壤中原生菌群的活性, 实现污染土壤的生物修复, 但由于土著微生物的数量有限、生长缓慢, 导致修复效率低下。因此，分离环境适应强、降解效能高的菌种或菌群，外源添加到石油污染土壤中有望成为提高石油污染土壤生物修复效率的有效手段。

发明内容

本发明目的在于提供一株可以高效降解石油组分的索诺拉沙漠芽孢杆菌DY157及其培养方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

从山东东营胜利油田地区被石油污染土壤中分离筛选出可高效降解石油的微生物。经筛选后得到一株可降解石油的芽孢杆菌，Bacillus sonorensis DY157。

对分离所得的菌株进行16S rRNA保守序列进行分析，并通过在GenBank中进行序列比对。结果发现，本发明芽孢杆菌的核糖体RNA保守序列与Bacillus sonorensis strainNB35似性最高，为99%。从而确定分离出来的菌株为Bacillus sonorensis，命名为Bacillussonorensis DY157。

本发明提供的芽孢杆菌Bacillus sonorensis DY157已于2020年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCCNo. 20478，分类命名为Bacillus sp.。

一种芽孢杆菌的应用，所述芽孢杆菌在降解土壤石油中的应用。

所述芽孢杆菌在作为石油污染土壤修复剂中的应用。

一种土壤修复剂，包括所述的芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）DY157。

所述土壤修复剂含芽孢杆菌Bacillus sonorensis DY157的菌株营养细胞或完整培养物。

所述土壤修复剂含芽孢杆菌Bacillus sonorensis DY157的培养物浓缩物、细菌悬液、发酵液或发酵清液。

一种土壤修复剂的应用，所述土壤修复剂在石油污染土壤修复中的应用。

本发明所具有优点：

本发明从山东东营胜利油田地区被石油污染土壤中分离筛选出可高效降解石油的微生物。经筛选后得到一株可降解石油的芽孢杆菌，Bacillus sonorensis DY157。所得菌株具有对石油降解迅速的特点。同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接用于石油污染土壤的治理，应用前景广阔。

附图说明

图1菌株DY157以石油为唯一碳源的平板生长照片（6天）；其中，左为菌株培养（0天），右为菌株培养（6天）。

图2不同初始石油含量下菌株DY157对培养基中石油的去除效果。

图3菌株 DY157对土壤石油的降解速率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1 : 芽孢杆菌的获得

从山东东营胜利油田附近区域采集被石油烃污染的土壤，去除表土后，用无菌器具收集被石油污染的 5∼15cm 土层土样。取一定量的石油污染土样接入含有10g/L原油（胜利油田孤东采油厂）的基础无机盐（MM)培养基的三角瓶中,培养基121°C 灭菌15min处理，MM培养基配方为（NH4）2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L,Na2HPO4 1.3g/L，FeCl3 0.5 mg/L，MgSO47H2O 0.5g/L，pH7.5，于30°C 、160r/min 条件下在摇床培养6d；然后取5mL培养液转接到新鲜培养基中继续培养。连续相同程序培养3次后，用接种环培养液于平板上划线，进行纯化培养（图1）; 经过多次划线纯化后, 将纯化菌株于试管斜面培养后-20°C保存。

（1）芽孢杆菌的鉴定

革兰氏染色及形态鉴定：将上述纯化获得菌株经革兰氏染色结果为阳性，该菌的菌落乳白色半透明，非圆形，湿润，直径1-3mm；细胞直径1m左右；产生芽孢，芽孢非圆形，为典型芽孢杆菌特征。

分子鉴定：为了确定本发明提供菌株的系统进化地位，对分离所得的菌株进行16SrRNA保守序列进行分析，并通过在GenBank中比对发现，本发明芽孢杆菌的核糖体RNA保守序列与Bacillus sonorensis strain NB35似性最高，为99%。从而确定分离出来的菌株为Bacillus sonorensis，命名为Bacillus sonorensis DY157。

Bacillus sonorensis DY157的16SrDNA保守序列：

上述菌株Bacillus sonorensis DY157对石油降解能力强，能以石油唯一碳源存活，且活力强，未进行遗传改造。当菌体被释放入自然环境后，对人、动植物无害，不污染环境，并能有效降解土壤中的石油类污染物。

所得Bacillus sonorensis DY157芽孢杆菌菌株的实验室保藏方式：短期保藏方式为，将菌株接种至LB固体斜面，LB培养基培配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH至7.3，待菌株长好后保藏于4°C冰箱内，此保藏方式不超过1个月；长期保藏方式为：将根瘤菌菌体加入终浓度为20%甘油中混匀并保藏至-80°C冰箱中，此保藏方式可达到10年以上。

（2）石油降解能力的测定

取-80°C保存的菌种涂布于活化培养基平板（LB培养基），28-32°C培养12-24h，挑取单菌落接种到种子液培养基中，32°C，180 r/min摇床培养24h。将菌体浓度OD600=1的发酵液作为接种剂。分别接种不同初始石油浓度的MM培养基进行降解实验，石油添加量分别为0.1，0.25，0.5,1,1.5,2和3g/L。将50ml上述接种剂添加到1L降解培养基中，32°C，180 r/min摇床培养7d。然后对培养基中的石油进行萃取，采用非分散红外石油仪测定(中华人民共和国国家标准GB /T16488-1996,1996) 剩余的石油含量（参见图2）。由图2可见当初始添加石油浓度在0.25,0.5和1g/L 时，菌株DY157对石油的7天降解率均维持在60%以上。

实施例2 Bacillus sonorensis DY157对模拟石油污染土壤的修复效果

（1）按上述方法对Bacillus sonorensis DY157 菌株进行活化，制成接种菌剂。

（2）取不含石油的干净园林土壤，风干过筛，添加石油20g/Kg，模拟石油污染土壤，进行土壤修复试验。取盆钵50个，设5处理，含对照组和处理组2,3，4和5；每个处理10个花盆。每盆装3±0.3 Kg土壤。对照组1为添加石油的土壤。在各处理组中对石油土壤添加不同量的接种菌剂，取对数期菌液（OD600=1；菌体浓度≈4×109cfu/mL），按0.03，0.1，0.3和1mL/Kg的浓度分别添加到处理组2,3，4和5中，以检测不同初始接种量对土壤石油降解速率的影响。土壤含水量保持在25%左右（以重量计）。连续修复一个月，测定污染土壤中石油的降解率（图3）。结果显示：初始菌剂接种量为1mL/Kg时，15天的石油降解率达到53.7%，而0.3mL/Kg接种量则需要20天达到50%的降解率。但是，在30天修复期结束时，0.1，0.3和1mL/Kg接种量的降解率十分接近，其中0.3mL/Kg接种量的30天降解率最高，达到62.5%,是比较理想的初始接种量。

序列表

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 一株石油降解菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> 1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 60

agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt 120

tcaattataa aaggtggctt ttagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta 180

gttggtgagg taacggctca ccaaggcnac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg 240

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 300

gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta 360

aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc 420

taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 480

gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 540

gcccccggct caaccggg 558

Claims

1.一株索诺拉沙漠芽孢杆菌，其特征在于，该菌株已于2020 年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.20478，分类命名为Bacillus sp.。

2.一种权利要求1所述的芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌在降解土壤石油中的应用。

3.一种权利要求1所述的芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌在作为石油污染土壤修复剂中的应用。

4.一种土壤修复剂，其特征在于：包括权利要求1所述的索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillussonorensis DY157。

5.按权利要求4所述的土壤修复剂，其特征在于：所述土壤修复剂含芽孢杆菌Bacillussonorensis DY157的菌株营养细胞或完整培养物。

6.按权利要求5所述的土壤修复剂，其特征在于：所述土壤修复剂含芽孢杆菌Bacillussonorensis DY157的培养物浓缩物、细菌悬液、发酵液或发酵清液。

7.一种权利要求4所述的土壤修复剂的应用，其特征在于：所述土壤修复剂在石油污染土壤修复中的应用。