CN112940995B - 一株能降解正二十烷的节杆菌及其应用 - Google Patents
一株能降解正二十烷的节杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于有机污染物微生物修复技术领域,具体涉及一株能降解正二十烷的节杆菌及其应用。能降解正二十烷的节杆菌的名称为Arthrobacter sp.C20,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2021367。本发明的能降解正二十烷的节杆菌可以通过发酵降解正二十烷降解性能稳定,可有效降解焦化废水中的正二十烷和降低水体的CODCr。利用本发明的节杆菌可以通过发酵降解正二十烷,避免了传统的物理化学处理方法中成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题,对人类健康和公共环境不会造成任何危害。本发明的节杆菌可永久保存,为今后的机理研究和更进一步的产业应用打下基础。
Description
技术领域
本发明属于有机污染物微生物修复技术领域,具体涉及一株能降解正二十烷的节杆菌及其应用。
背景技术
已有研究证实,节杆菌属细菌可以降解诸多苯系物、多环芳烃、N-杂环化合物等环境有机污染物,这表明节杆菌属细菌能在劣势环境下生长且能够利用多种有机化合物作为其营养物质完成代谢,因此节杆菌属细菌被认为是能够应用于土壤、水体等环境生物修复的优良菌种。
正二十烷烃是长链烷烃中的一种重要成分,其水溶性低、难挥发,一旦进入环境就很难被消除,属于持久性污染物。当废水中含有油类物质时,油具有的较大的吸附性会黏附在菌胶团表面使得有机物难以进入菌体细胞壁中,且油类具有较轻的密度,会使得大量活性污泥随油污浮在水体表面,不能与废水充分接触,从而降低了微生物的降解效率。利用物理化学方法如隔油法、气浮除油法处理长链烷烃可以应用于污染物含量较大的场景,但其处理成本高且不能完全降解残余少量的油类物质,因此,可能不满足运行要求。微生物能够通过生物降解方式处理长链烷烃,具有费用低,效果好,对环境影响小等物理化学方法不可比拟的优势,且可以降解长链烷烃污染物的微生物种类繁多,多种微生物还可以混用来降解不同烷烃。如徐静等人利用铜绿假单胞菌SJTD-2降解石油污染物中的长链烷烃,在理论条件下有较好的降解效果,但在实际应用中存在不同菌株适用条件不一致、菌群稳定性差等问题,应用受到限制,因此筛选得到一株具有实际应用价值的烷烃降解菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株能降解正二十烷的节杆菌,降解性能稳定,降解成本低、过程简单、技术难度低、无二次污染。
本发明的目的之二在于提供一株能降解正二十烷的节杆菌的应用,用于降解正二十烷。
本发明的目的之三在于提供一株能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,对人体健康和公共环境不会造成任何危害,对实验条件要求较低,成本也相对较低。
本发明的目的之四在于提供一株能降解正二十烷的节杆菌的应用,降解焦化废水中的正二十烷和降低水体的CODCr。
本发明实现目的之一所采用的方案是:一株能降解正二十烷的节杆菌,其名称为Arthrobacter sp.C20,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2021367。
本发明实现目的之二所采用的方案是:一种所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用,将所述能降解正二十烷的节杆菌应用于降解正二十烷。
本发明实现目的之三所采用的方案是:一种所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,以所述能降解正二十烷的节杆菌为出发菌,在液体无机盐培养基中加入正二十烷为唯一碳源,培养4-8天以达到降解正二十烷的目的。
优选地,培养条件为:温度为20-35℃,初始pH值为5.0-9.0,初始接种量2%-10%。。
优选地,所述液体无机盐培养基中正二十烷的浓度200-800mg/L。
优选地,培养基中还包含浓度为300-700mg/L的表面活性剂,所述表面活性剂为吐温20,吐温80,SDS,鼠李糖脂中的任意一种。
本发明实现目的之四所采用的方案是:一种所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用,将所述降解正二十烷的节杆菌应用于降解焦化废水中的正二十烷和降低水体的CODCr。
本发明具有以下优点和有益效果:
本发明的能降解正二十烷的节杆菌可以通过发酵降解正二十烷降解性能稳定,可有效降解焦化废水中的正二十烷和降低水体的CODCr。
利用本发明的能降解正二十烷的节杆菌可以通过发酵降解正二十烷,避免了传统的物理化学处理方法中成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题,对人类健康和公共环境不会造成任何危害,对实验条件要求较低。
本发明的能降解正二十烷的节杆菌可永久保存,为今后的机理研究和更进一步的产业应用打下基础。
附图说明
图1是菌株C20的扫描电镜图;
图2是菌株C20的系统发育树;
图3是不同温度条件下菌株C20对正二十烷的降解效率图;
图4是不同初始浓度条件下菌株C20对正二十烷的降解效率图;
图5是不同初始pH值条件下菌株C20对正二十烷的降解效率图;
图6是不同初始接菌量条件下菌株C20对正二十烷的降解效率图;
图7是添加表面活性剂前后菌株C20对正二十烷的降解效率图;
图8是将该菌株运用于焦化废水处理工艺中对水中CODCr去除率改进图。
具体实施方式
为更好的理解本发明,下面的实施例是对本发明的进一步说明,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1菌株C20的筛选、分离纯化以及鉴定
一、一株正二十烷降解菌株C20的筛选方法
1.材料准备
菌株筛选土壤来源:取自湖北省黄石市某焦化厂污染土,土样用采样袋密封,4℃带回实验室保存并备用。
LB培养基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,NaCl 10.0g/L,pH值7.0~7.2。固体培养基另加1.5%琼脂粉。121℃高压灭菌20min。
无机盐培养基(MSM):KH2PO4 338.8mg/L、(NH4)2SO4 234.0mg/L、Na2CO3 100.0mg/L、CaCl2 3.9mg/L、MgSO4·7H2O 59.3mg/L、Na2HPO4·12H2O 890.7mg/L、FeSO4 0.3mg/L、1.0mL/L、胰蛋白胨500mg/L、微量元素溶液(FeCl2·4H2O 1500.0mg/L、CoCl2·6H2O190.0mg/L、MnSO4·7H2O 100.0mg/L;ZnCl2 70mg/L、NiCl2·6H2O 24mg/L、NaMoO4·2H2O24mg/L、MnCl2·4H2O 6mg/L、CuCl2·2H2O 2mg/L)混匀,pH 7.0~7.2。115℃高压灭菌30min。
2.正二十烷降解菌株C20富集筛选及分离纯化
(1)菌株的筛选
将50g土样加入到100mLMSM培养基中,放入30℃,200rpm摇床中培养7d,培养基额外加0.5g/L葡萄糖。将扩大培养后的菌液静置,待泥水分离后,取上清液用无菌水稀释104倍,取100μL涂布于1000mg/L正二十烷作为唯一碳源的固体MSM培养基中。将上述涂布后的平板倒置于30℃恒温培养箱中培养,直至长出菌落。不断增加对应有机物浓度,直至平板上菌落种类较少,筛选出的菌落即为能适应高浓度有机物的降解菌。
(2)菌株分离与纯化
挑取高浓度有机物MSM固体培养基上长势最好的一株菌落接种于LB液体培养基中,置于30℃,200rpm摇床中培养12h。取20uL菌液划线分纯于LB培养基中,重复划线多次确保平板上长有单一菌种。
二、菌落形态特征观察
1.菌株C20在LB培养基上生长较快,可在30℃生长。其菌落呈淡黄色,菌落较小,呈规则圆形,表面光滑湿润,质地粘稠易挑起,该菌株为长约1μm的杆状菌,表面较为光滑,一端有长约150nm的菌毛(如图1)。
2.16S rDNA鉴定
取该节杆菌于LB液体培养基中扩大培养,取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组。将提取得到的基因组,用通用引物27F和1492R进行PCR扩增,PCR体系为:2xTaq Plus PCR Master Mix 12.5μL、ddH2O 11.5μL、通用引物27F 0.5μL、通用引物1492R0.5μL、模板DNA 0.5μL。将PCR扩增得到的产物,于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳检测,切下DNA条带,送测序公司测序。
测序结果如下,该序列的NCBI GenBank登记号为MW867036:TGCTTACCATGCAGTCGAACGATGACCTCCAGCTTGCTGGGGTGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCCGTGAAAGTCCGGGGCTCAACTCCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGATGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCATTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGGGCCGGACCGGGCTGGAAACAGTCCTTCCCCTTTGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTCGAAG
将获得的16S rDNA基因序列上传至Ez biocloud网站比对发现菌株C20与菌株Arthrobacter oryzae有99.50%的同源性。菌株C20的系统发育树见图2。
三、菌株C20鉴定为一种新功能菌株
根据菌株C20菌落形态特征和分子生物学鉴定结果,将菌株C20鉴定为节杆菌属的一株菌Arthrobacter sp.C20。该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCM2021367,保藏日期为2021年4月12日,保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例2菌株C20在以正二十烷为唯一碳源的无机盐液体培养基中对正二十烷的降解
1、正二十烷的降解及回收
(1)将菌株C20于LB平板划线培养后,挑取单菌落接种于LB液体培养基中,于30℃,200rpm的摇床中培养24h;
(2)将培养24h后的菌液离心处理,弃掉培养基,用无菌水重悬,再次离心弃上清加无菌水重悬,此过程重复三次;将最后一次重悬得到的菌液用无菌水调至OD600=1.0,转接于50mL二十烷作为唯一碳源的的MSM液体培养基中培养7d,200rpm震荡培养7d;以不添加菌株C20为对照;控制单一因素变量,探究环境因素:温度、初始底物浓度、培养基初始pH、初始接菌量对正二十烷降解率的影响,以及表面活性剂的加入效果,得到菌株C20降解的最适环境。
MSM液体培养基组成为:KH2PO4 338.8mg/L,(NH4)2SO4 234.0mg/L,Na2CO3100.0mg/L,CaCl2 3.9mg/L,MgSO4·7H2O 59.3mg/L,Na2HPO4·12H2O 890.7mg/L,FeSO40.3mg/L,FeCl2·4H2O 1.5mg/L,CoCl2·6H2O 0.19mg/L,MnSO4·7H2O 0.1mg/L,ZnCl20.07mg/L,NiCl2·6H2O 0.024mg/L,NaMoO4·2H2O 0.024mg/L,MnCl2·4H2O 0.006mg/L,CuCl2·2H2O0.002mg/L,胰蛋白胨500mg/L。
(3)培养7d后,向锥形瓶中加入10mL的正己烷、1mL用正己烷溶解的500mg/L的正十五烷作标,充分震荡后,将此混合液倒入250mL分液漏斗中剧烈震荡并萃取,静置,待液体分层后收集上层有机相。再向水相中加入10mL正己烷萃取并收集上层有机相,此过程重复两次,合并萃取液并用正己烷定容至30mL。
2、正二十烷降解率的测定
(1)将萃取有机相定容并混合充分后取少量液体用0.22μm滤器过滤后,取1μL滤液进行测定;
(2)使用气相色谱-质谱联用仪进行检测;
用的气相色谱-质谱联用仪型号是450GC-350MS;GC-MS检测条件为:色谱柱型号为HP530m×0.25mm石英毛细柱,载气为氦气流量为1mL/min,进样温度为280℃,升温程序为60℃恒温3min,20℃/min升温到290℃保持10min,进样量为1μL,质谱离子源为电子轰击温度为200℃,发射电流为50μA,电子能量为70eV,电子倍增器电压≥1000eV,质量扫描范围为30-800质量单位,次数为2次/s;
(3)S为对应峰面积,降解率计算方法:
3、菌株C20降解正二十烷最适条件
(1)如图3所示,菌株C20在20-35℃环境下均可对正二十烷有一定降解效果,最优选降解温度为30-35℃;
(2)如图4所示,菌株C20对200-800mg/L初始浓度的正二十烷均可降解,最优选降解浓度为500mg/L;
(3)如图5所示,菌株C20在初始培养基pH为5.0-9.0时对正二十烷均可有一定程度降解,最优选降解pH为7.0;
(4)如图6所示,菌株C20在初始接菌量为2.0%-10%时对正二十烷均可有一定程度降解,最优选降解pH为6%-10%;
(5)如图7所示,添加500mg/L表面活性剂鼠李糖脂后,菌株C20对正二十烷的降解率大幅提升。
实施例3菌株C20在含正二十烷的实际排放的焦化废水A/A/O处理工艺的好氧池试验装置中的应用
(1)将菌株C20于LB平板划线培养后,挑取单菌落接种于LB液体培养基中,于30℃,200rpm的摇床中培养24h;
(2)将培养24h后的菌液离心处理,弃掉培养基,用无菌水重悬,再次离心弃上清加无菌水重悬,此过程重复三次;将最后一次重悬得到的菌液用无菌水调至OD600=1.0,转接于运行装置中废水进行重悬后的水体中,采用闷曝的方式使其生长及适应。以加入菌体前7d出水水样作为对照组,加入菌体闷爆后7d装置出水水样作实验组。采用《HJ/T 399-2007水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法》对焦化废水的COD进行分析。
如图8所示,结果表明,未加菌株C20前COD去除率为76.78%,加入后COD去除率为79.84%。装置出水水质有所改善。
以上所述是本发明的优选实施方式而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和变动,这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一株能降解正二十烷的节杆菌,其特征在于:其名称为Arthrobactersp. C20,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2021367,将所述降解正二十烷的节杆菌应用于降解焦化废水中的正二十烷和降低水体的CODCr。
2.一种如权利要求1所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用,其特征在于:将所述能降解正二十烷的节杆菌应用于降解正二十烷。
3.一种如权利要求2所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,其特征在于:以所述能降解正二十烷的节杆菌为出发菌,在液体无机盐培养基中加入正二十烷为唯一碳源,培养4-8天以达到降解正二十烷的目的。
4.根据权利要求3所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,其特征在于:培养条件为:温度为20-35℃,初始pH值为5.0-9.0,初始接种量2%-10%。
5.根据权利要求3所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,其特征在于:所述液体无机盐培养基中正二十烷的浓度200-800 mg/L。
6.根据权利要求3所述的能降解正二十烷的节杆菌的应用的方法,其特征在于:培养基中还包含浓度为300-700mg/L的表面活性剂,所述表面活性剂为吐温20,吐温80,SDS,鼠李糖脂中的任意一种。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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