CN110551662B

CN110551662B - 节杆菌菌株zj-h及其应用

Info

Publication number: CN110551662B
Application number: CN201910911001.4A
Authority: CN
Inventors: 刘宪斌; 刘佳博; 赵兴贵; 林颖青
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110551662A

Abstract

本发明提供了一株节杆菌菌株ZJ‑H及其在高盐碱环境下降解石油烃的应用。菌株ZJ‑H筛选自渤海油田的油基钻屑样品，由中海油碧海环保技术服务公司提供。菌株ZJ‑H对高盐碱环境的耐受能力强，可在盐度1～5％、pH7～11的环境下正常存活；菌株ZJ‑H在盐碱环境下对石油具有较高的降解率，达到74.45％；菌株ZJ‑H的代谢产物具有较好的乳化活性，对石油醚具有很好的乳化作用，有利于菌株对石油醚的进一步分解利用；菌株ZJ‑H对原油中正构烷烃(包括C20～C30的长链烷烃)有很好的降解能力，降解率超过83％，尤其是对C25～C30的降解率达到95％左右。

Description

节杆菌菌株ZJ-H及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物领域，特别是涉及一种节杆菌菌株ZJ-H及其在高盐碱环境下降解石油烃的应用。

背景技术

随着石油工业的发展，油气勘探、开采活动越发频繁，在油气生产开发过程中不断产生的油基钻屑进入土壤环境和地下水中，对人类健康造成严重的威胁。石油渗透到土壤会污染土层，造成透水性和透水量降低，板结化和盐碱化进一步加重，再加上油基钻屑具有含盐量高、受有机污染严重等特点，因此许多油田土壤环境常常会受到高盐碱和石油烃的双重污染。

微生物修复石油污染的土壤是一种经济环保且较为有效的方法，但是由于在高盐碱的环境下，微生物的生长通常会受到抑制作用，导致生物修复效果不佳。国内外有关石油烃降解微生物的筛选和鉴定已经有很多实例，但绝大多数是从含油废水或受石油污染的土壤中筛选获得的非嗜盐(嗜碱)菌，在盐碱化土壤的修复中存在很大局限。目前已检索到的相关专利包括：

专利CN109504616A，公开了一种雷氏普罗威登斯菌，该菌株代谢产物含有能降低油水界面张力的表面活性剂，可用于原油污染环境的生物修复，7天内对原油的降解率达到45.6～55.9％。

专利CN108034625A，公开了一株能高效降解石油的假单胞菌，该细菌30天内对含油污泥中的总石油烃降解率为50.75％，该细菌对石油污染物的最适降解条件为20～50℃、pH7～11。

专利CN105441351A，公开了一株嗜热菌株Y-1，对高温、pH和高盐度都有较强耐受力，在降解石油的过程中能产生生物乳化剂。菌株Y-1对原油的降解率在培养的第五天达到60.2％。

专利CN104877930A，公开了一种从石油污染的盐碱化土壤中筛选耐盐碱石油烃降解菌的方法，获得的菌株可在3％盐度、pH9的环境下正常生长，其中菌株B05最高可耐受11％的盐度，菌株B03和B04可耐受pH11的碱性环境。在石油降解效率方面仅对烷烃有较好的降解效果(专利文献中仅给出了对烷烃的降解率，并且降解过程中所处环境的盐碱度也未给出)。

上述现有技术也都存在盐碱耐受性和石油降解效率难以兼顾的问题。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的是提供一株对高盐碱环境耐受力强且对石油烃降解效率高的耐盐碱石油烃降解菌，可应用于高盐碱地区石油污染土壤的修复。

本发明提供的耐盐碱石油烃降解菌，名称为ZJ-H，分类名称为：节杆菌Arthrobacter sp.，保藏编号：CGMCC No.18247，保藏日期：2019年7月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供的耐盐碱石油烃降解菌ZJ-H为革兰氏阳性菌，固体培养基中菌落外观为圆形凸起，边缘整齐，颜色为淡黄色，表面湿润、光滑。如图1所示。

本发明提供的耐盐碱石油烃降解菌ZJ-H的16Sr DNA序列的GenBank登录号为：KF021806.1。

本发明提供的耐盐碱石油烃降解菌ZJ-H在降解石油烃中的应用。

进一步地，所述菌株ZJ-H在乳化、降解石油醚中的应用。

进一步地，所述菌株在降解原油正构烷烃中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、所述菌株ZJ-H对高盐碱环境的耐受能力强，可在盐度1～5％、pH7～11的环境下正常存活。

2、所述菌株ZJ-H在盐碱环境下对石油具有较高的降解率，达到74.45％。

3、所述菌株ZJ-H的代谢产物具有较好的乳化活性，对石油醚具有很好的乳化作用，有利于菌株对石油醚的进一步分解利用。

4、所述菌株ZJ-H对原油中正构烷烃(包括C20～C30的长链烷烃)有很好的降解能力，降解率超过83％，尤其是对C25～C30的降解率达到95％左右。

附图说明：

图1固体培养基上的菌株ZJ-H菌落形态。

图2固体培养基上的菌株ZJ-B菌落形态。

图3菌株ZJ-H在不同盐度和碱性环境下的生长曲线变化趋势图。

图4菌株ZJ-H对含有原油的石油醚溶液的乳化效果，左侧试管为加入菌液的实验组，右侧试管为加入无菌水的对照组。

图5菌株ZJ-H在不同盐度下的原油降解效率。

图6菌株ZJ-H在不同pH下的原油降解效率。

图7菌株ZJ-H在不同温度下的原油降解效率。

图8菌株ZJ-H对原油正构烷烃降解效果的GC-MS分析谱图，其中A为对照组，C为经过菌株ZJ-H降解处理的实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

1.菌株ZJ-H的筛选

(1)取样：油基钻屑样品来源于渤海油田，取自中海油碧海环保技术服务公司，其含水率为15％，pH为7.9，盐度为1.5％。原油取自渤海油田采油厂。发明人通过前期的取样及筛选研究发现，从油基钻屑中分离筛选出的菌株较之从含油废水或受石油污染的土壤中筛选获得的菌株往往具有更强的原油降解能力。

(2)富集驯化：称取10g油基钻屑样品加入至经过高温灭菌的100ml富集培养基中，在30℃、150r/min条件下摇床培养7d，然后取富集液10ml接种至石油培养基中，在相同条件下培养7d后再进行转接，连续培养至少4次。

(3)分离纯化：经过驯化的培养液按梯度稀释后涂布在涂有原油的LB固体培养基上，30℃恒温培养48h。之后再挑去形态不同的单菌落(部分菌落周围还可观察到白色或透明的排油圈，说明其生长过程中已经产生了表面活性物质)进行划线分离、纯化，获得菌株ZJ-H。纯化获得的菌株ZJ-H经过37℃培养24h后，其菌落外观为圆形凸起，边缘整齐，颜色为淡黄色，表面湿润、光滑(图1)。

上述富集驯化及分离纯化所涉及的培养基的主要成分如下：

富集培养基：酵母粉3g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 4g/L，根据需要调节pH；

石油培养基：酵母粉3g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 10g/L，KH₂PO₄ 4g/L，原油10g/L，根据需要调节pH；

LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，加入琼脂粉15～20g/L。

在筛选获得菌株ZJ-H的同时还获得另一株纯化菌株ZJ-B，菌株ZJ-B也具有一定的盐碱耐受力以及石油降解能力。ZJ-B的革兰氏染色呈阳性，其菌落外观为白色圆形凸起，边缘较粗糙，表面相对干燥(图2)。

2.菌株ZJ-H的鉴定

利用细菌基因组DNA试剂提取盒31516KC4对菌株进行DNA提取，采用的引物为27Fprimer AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R TACGGYTACCTTGTTACGAC。PCR扩增反应体系如表1所示：

表1菌株基因组DNA的PCR扩增反应体系

反应过程如表2所示：

表2菌株基因组DNA的PCR扩增反应过程

16Sr DNA测序由北京美吉桑格生物医药科技有限公司测定。测序结果在Genbank中进行序列比对，根据同源性得出菌株ZJ-H和ZJ-B分别属节杆菌Arthrobacter sp.和芽孢杆菌Bacillus sp.菌株ZJ-H的GenBank登录号为：KF021806.1，ZJ-B的GenBank登录号为：MH890518.1。

3.菌株ZJ-H的性能测试

(1)耐盐碱性测试：

耐碱性测试：将分离纯化得到的菌株ZJ-H和ZJ-B接种于LB液体培养基(菌液接种量为1％)，pH分别设置为7、8、9、10、11，盐度为1％，每组设置三个平行样。在150r/min转速、30℃下摇床培养24h后用分光光度计测量菌液的OD值。

耐盐性测试：将菌株ZJ-H和ZJ-B接种于LB液体培养基(菌液接种量为1％)，盐度分别设置为1％、2％、3％、5％、7％，pH调至7～7.2，每组设置三个平行样。在150r/min转速、30℃下摇床培养24h后用分光光度计测量菌液的OD_600nm值(以下简称OD值)。

耐碱性测试结果如图3A所示，菌株ZJ-H在pH7～11的范围内均能正常生长，对应的OD值均在1.4以上，体现出良好的活性，其中在pH为8时最高，OD值接近2.0。

耐盐性测试结果如图3B所示，菌株ZJ-H在1～7％的盐度范围内均能正常生长，在1～5％的盐度范围生长较好，OD值超过1.5，体现出良好的活性。最适盐度为3％，相应的OD值达到2.0。

上述测试结果表明菌株ZJ-H对高盐碱环境的耐受能力强，可在盐度1～5％、pH7～11的环境下正常存活。

(2)乳化效果测试：

将菌株ZJ-H于5％盐度、pH9、30℃下摇床培养至对数期后，去5mL菌液加入10mL含有原油的石油醚溶液中，以加入无菌水的相同的石油醚溶液为空白对照组。将实验组和对照组溶液于试管中漩涡震荡1h，静止10min后观察乳化效果。结果如图4所示：左侧试管为加入菌液的石油醚溶液，通过肉眼可见溶液油层出现明显浑浊乳化现象，乳化效果明显，油层乳化成分散的油滴增大了油、水中的微生物接触面积，使微生物能更好地利用、分解油污。

(3)不同培养条件下的原油降解率测试：

将菌株ZJ-H和ZJ-B接种到添加有原油的液体培养基中(原油添加量为5％)，进行7d的摇床培养实验，采用分光光度法测定培养基中的含油量，降解率通过下式计算获得：

培养条件分别按盐度变化组、pH变化组和温度变化组设定，具体设定如下：

盐度变化组：盐度分别为：1％、2％、3％、5％、7％，pH为7.2，温度为30℃；

pH变化组：pH分别为：7、8、9、10、11，盐度为1％，温度为30℃；

温度变化组：温度分别为：25、30、35、40、45、50℃，盐度为1％，pH7.2。

上述每组条件设置三个平行，以不加菌株的空白培养基为对照组。

盐度变化组的测试结果如图5所示：菌株ZJ-H在1～5％的盐度环境下都具有较高的降解效率，其中在3％盐度下的降解效率最高，达到54.77％，在5％盐度下的降解率仍达到46.84％。在1～2％的盐度下，菌株ZJ-B的原油降解率略高于ZJ-H，但在3％～7％的盐度下菌株ZJ-H的原油降解率均明显高于ZJ-B，体现出在高盐环境下优异的原油降解能力。

pH变化组的测试结果如图6所示：菌株ZJ-H在pH7～10的碱性环境下都具有较高的原油降解率，当pH为9时降解率最高，达到74.45％。菌株ZJ-H在所测试的碱性环境下的原油降解率均高于ZJ-B，在碱性较强的pH9～11环境下，二者的差异尤其明显，ZJ-H的降解率几乎是ZJ-B的两倍左右。

温度变化组的测试结果如图7所示：菌株ZJ-H在25～30℃下的原油降解率为35％左右，在35～45℃下的降解率均超过60％，其中40℃下的降效率最高，达到73.71％。ZJ-B同样体现出较高温度下的降解优势，在40℃下的降解率接近70％，在50℃下的降解率仍维持在45％左右。

(4)原油正构烷烃的降解率测试：

将菌株ZJ-H接种到添加有原油的液体培养基中(原油的添加量为5％，培养基盐度为5％，pH为9)，于40℃下降解处理7d，之后加入20ml正己烷充分搅拌，无水硫酸钠干燥过滤后重复萃取2次，收集萃取液。收集到的滤液再通过硅胶层析柱去除沥青质后浓缩至样品瓶。以氘-C24烷为内标物质，对石油烃组分进行定量分析。

GC-MS分析正构烷烃色谱条件：进样口温度280℃，进样量1μL；色谱柱流量1.1ml/min，横流模式；升温程序：35℃保持1min，以15℃/min的速率升温至340℃，保持7min直至所有组分流出。质谱条件：离子源温度230℃，电离方式：EI，电力能量70eV，扫描方式为全扫描。

图8为GC-MS分析谱图，其中A为对照组，C为经过菌株ZJ-H降解处理的实验组。从图中可以看出经过菌株ZJ-H降解处理的石油烃组分中的烷烃(C13～C30)含量均显著下降，用内标法对石油烃各组分进行定量分析，结果如表3所示，菌株ZJ-H对C12～C19的降解率超过90％(其中C12降解率为100％)，对长链烷烃(C20～C30)的降解率也超过83％，尤其是对C25～C30的降解率达到95％左右，体现出优异的降解性能。

表3菌株ZJ-H对原油中正构烷烃的降解率

Claims

1.一种节杆菌(Arthrobacter sp.)菌株ZJ-H，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.18247，保藏日期：2019年7月18日。

2.根据权利要求1所述的节杆菌菌株ZJ-H在降解石油烃中的应用。

3.根据权利要求1所述的节杆菌菌株ZJ-H在乳化、降解石油醚中的应用。

4.根据权利要求1所述的节杆菌菌株ZJ-H在降解原油正构烷烃中的应用。