CN108034625B - 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株jn7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株含油污泥中石油烃类的高效降解菌JN7及其应用，属于生物修复技术领域。所述降解菌JN7保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14978，分类号为假单胞菌属Pseudomonas sp.。本发明所述的具有石油烃类降解功能的菌株JN7用途为以降解石油烃类的方式进行含油污泥的治理。该细菌30天内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为50.75％。该细菌以单一菌株对n‑C₁₀～n‑C₃₀的石油烃类具有明显的降解能力，通过GC‑MS分析表明，含油污泥中的石油烃类物质在该菌株的作用下发生氧化反应，形成大量酚、酮类中间产物。该细菌对石油污染物的最适降解条件为20‑50℃、pH值7‑11。该生物法用于含油污泥的修复技术，具有高效、成本低、环境友好等优点。

Description

一种含油污泥中石油烃类的降解菌株JN7及其应用

技术领域

本发明涉及生物修复技术领域，具体涉及一株含油污泥降解修复的菌株，及其在降解含油污泥中的应用。

背景技术

自20世纪以来，石油已成为人类最主要的能源之一，而在被大量开采和使用的同时，石油及其加工品对环境及人类造成的危害也日趋严重。我国自改革开放以来原油年产量已超过1亿t，成为世界十大产油国之一的中国拥有400多个勘探、开发的油田和油气田，以约占国土面积3％的比例分布于全国25个省(市)和自治区。然而在经济技术快速发展以及石油需求量不断上升的过程中，我们对油田区域进行采油的技术工艺仍然相对落后，环境影响评价体系相对不完善，同时对石油类污染的修复技术较缺乏，使得我国石油类污染程度远高于发达国家，且呈逐年累积加重态势。

油泥是中国各大油田普遍存在的主要废弃物污染问题，早在1998年国家环保总局就将油泥列为危险废物(废物类别HW08)，要求必须对含油污泥等废弃物进行无害化处理。由于含油污泥的来源不同，其组分、性质也不尽相同。通过对各类含油污泥的取样分析，含油污泥一般含油15％～50％。对环境危害较大。按照《中华人民共和国清洁生产促进法》要求必须对含油污泥进行无害化处理。目前国内外动用了大量人力、物力进行含油污泥有效处理的研究，相继尝试过固化填埋、焚烧、淋洗、化学氧化和生物修复等方法处理含油污泥。生物修复技术具有成本相对较低、安全性高、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，被认为是最有前景的修复手段。但由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。

生物处理方法分两类，一是向含油污泥中投加营养物质，曝气，促进污泥土著微生物生长增殖，从而实现对污染物的降解。二是向含油污泥中投加高效降解石油烃的微生物菌剂。生物处理技术的优点在于：一是不会形成二次污染或导致污染物转移；二是工艺简单，处理费用低；三是处理效果好，经过生化处理，污染物残留量可以大幅度降低。研究表明，投加石油烃降解菌可使降解率提高到50％以上。利用代谢表面活性剂微生物对含油污泥处理，提高石油烃类溶解度，可提高石油烃类的降解效率，利用生物处理可去除PAHs类有害物质，生物处理可同时降解含油污泥中脂肪烃和芳香烃，但是生物处理方法存在受环境因素影响大、处理周期长等局限性，因此生物处理含油污泥的处理技术在国内还没有投入规模化应用。同时，现有技术中也并没有使用单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解的技术方案。

CN1594549A公开了一种施氏假单胞菌菌株的制备及其在对含硫有机化合物脱硫中的应用技术，该菌株为Pseudomonas stutzeri UP-1；它主要来源于含硫较高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中，该菌株可通过特定的培养、分离和制备手段得到，它的培养基液体细胞、静息细胞和固定化细胞均能通过Kodama路线作用于含硫有机化合物，生成溶于水的含硫有机物。

CN101074425A公开了一株硝基还原假单胞菌及其应用。本发明的微生物是从石油化工厂污水处理厂的活性污泥中分离并经纯化培养得到的硝基还原假单胞菌Pseudomonasnitroreducens S1，其对苯并噻唑具有高效专一降解性能，适用于含苯并噻唑的废水、废气、污染的水及土壤的生物治理过程。

CN104001712A公开了一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，步骤如下：将石油降解菌剂与土壤以重量比按1:5比例混合均匀，撒入碱茅种子，浇水待植物发芽，按照植物正常生长要求管理；所述的石油降解菌剂为施氏假单胞菌与谷氨酸棒状杆菌按1:1混合；所述用于种植碱茅的土壤为总石油烃质量分数为10000+5000mg/kg的污染土壤。本方法是在石油污染的盐碱土壤中加入菌剂并混匀，然后播种碱茅种子，定期浇水，使得植物与微生物协同降解土壤中石油污染物质。碱茅除具有促进石油烃降解的作用外，还具有绿化的作用，加入微生物菌剂使得降解率和降解速度都得到提高，且微生物降解后得到的有机质作为植物肥料，植物与微生物互利共生，降解时间持续较长，使得石油烃类污染物质具有较好的去除效果。

CN104276738A提供了一种针对蜡质油污泥的快速无害化生物降解方法，通过制备种子液、加热分散蜡质油污泥、制备降解体系和生物降解来实现，专门针对采油炼油过程产生的蜡质油污泥，能够有效地降解蜡质油污泥中的物质，本发明的方法以铜绿假单胞菌NY3和施氏假单胞菌N2为菌源，能够有效地降解油污泥中的石油烃类物质，将部分石油烃转化为糖蛋白类物质，最终达到油污泥无害化处理的要求。利用生物处理工艺，不产生二次污染，对环境不产生影响；处理工艺简单，运行成本低；处理时间短，效率高。油污泥转化产物对油污泥的降解具有促进作用，这是在本发明试验过程中的一个意料之外的效果。

CN105254144A公开了一种无害化油泥处理工艺，包括油泥流态化、生物处理、污泥脱水和生物诱导四个步骤，所述的处理工艺步骤是向生物反应罐中投加保的解脂假丝酵母Y-57和恶臭假单胞菌P-101，经过曝气生物反应后，以绝干泥计油泥含油小于3％，水含油小于130mg/L；在水面上部浮油通过收油装置回收利用，底部细泥沙达标外排，油泥进入污泥脱水步骤。本发明将微生物处理法和生物诱导法及机械法联合应用，能使污泥含油率达到0.5％的标准，恢复污泥环境，达到资源化、无害化的目的。

CN106565066A公开了一种含油污泥无害化生物处理方法，其方法按如下步骤：1)添加原油解凝剂，解凝原油；2)添加辅助材料，厌氧堆腐；3)添加微生物菌剂，有氧发酵；4)植物辅助降解；其中微生物菌剂包括假单胞菌属的绿脓杆、菌微球菌属的藤黄微球菌、芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌、不动杆菌属的琼氏不动杆菌、醋杆菌属的醋化醋杆菌，其重量百分比例为1:1.5:1:1.6:2。本发明的目的是提供一种经济，环保，高效的含油污泥处理方法。

CN107299066A公开了一种含油污泥的微生物降解液的制备方法以及降解处理方法，所述的制备方法包括如下步骤：S1：配制微生物菌群第一培养基；S2：将复合微生物菌群在步骤S1的所述第一培养基中进行培养，得到第一菌群降解液，所述的复合微生物菌群为抗辐射不动杆菌、枯草芽孢杆菌、洛菲不动杆菌、琼氏不动杆菌、扁桃假单胞菌和分支节杆菌按照重量比1:1-2:0.3-0.7:1-1.4:1:2-3进行混合；S3：配制微生物菌群第二培养基；S4：将所述第一菌群降解液接种于所述第二培养基中进行培养，得到第二菌群降解液；S5：使用所述第二菌群降解液来降解含油污泥，完成微生物降解处理。所述方法通过独特的微生物菌群选择、培养方法和降解工艺操作等多个技术特征的综合组合和协同，从而取得了良好的降解效果。

发明人从辽河油田含油污泥中筛选出一株高效石油烃降解菌假单胞菌属(Pseudomonas sp.)CGMCC NO.14978，并进一步研究菌株对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。

发明内容

本发明目的是提供一株石油烃类降解菌株，并将其在含油污泥降解修复过程中的应用。

本发明所述的一株假单胞菌属及其在降解含油污泥中的应用，技术方案为：

一种石油烃类降解菌株，其特征在于，所述菌株为假单胞菌属(Pseudomonassp.)，于2017年12月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC NO.14978。

一种如上所述的从辽河油田某含油污泥中分离高效降解菌株来降解含油污泥中的石油烃类污染物的方法，其特征在于具体按照以下步骤实施：

取辽河油田某含油污泥10g放入装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温摇床上进行震荡，富集培养24h。

所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。

24h后接种静置后的上层菌液于筛选培养基中，筛选培养基初始的正十八烷的加入量为1g/L，其后不断提高筛选培养基中的正十八烷含量直至5d内无菌落生长。

所述无机盐培养基的组分为：NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂0.02g，MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。

筛选培养基(烷烃培养基)：在无机盐培养基中添加正十八烷作为唯一碳源。

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述无菌落生长的前一浓度的筛选培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落，将其接种于保存培养基斜面上于4℃的冰箱保存备用。

上述菌株的菌落形态为：菌落呈淡黄色，近透明，表面光滑无褶皱，边缘不整齐，如图1。菌体呈杆状，细菌形态见扫描电镜图2。

上述菌株的16S ribosomal RNA基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其DNA序列表如序列表所示。

使用前将其在LB液体培养基中活化24h制成菌液，将菌液以10％的接种量接种于含油污泥中。

优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，温度25℃、pH为11的条件下降解效果最佳。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)JN7源于含油污泥，因此该菌株进入含油污泥后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性。

2、本发明的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)JN7是以正十八烷为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变含油污泥中石油烃类物质的性质，使含油污泥中石油烃类的组分发生变化。

3、本发明的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)JN7以单一菌株对n-C₁₀～n-C₂₆的石油烃类具有明显的降解能力，通过GC-MS分析表明，含油污泥中的石油烃类物质在该菌株的作用下发生氧化反应，形成大量酚、酮类中间产物。

4、本发明的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)JN7是以单一的菌种实现较为优异的含油污泥中石油烃类的降解，减少混合菌剂制备过程中各菌株分别活化并按比例混合的复杂步骤，易于控制含油污泥石油烃类降解的最佳反应条件，且单一的菌株降解避免降解后的反应产物复杂，易于联合其他方法对含油污泥中的石油烃类物质进一步降解。

附图说明

图1为菌株JN7的群落形态。

图2为菌株JN7的扫描电镜图。

图3Pseudomonas sp.JN7对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图4Pseudomonas sp.JN7在不同pH下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

图5Pseudomonas sp.JN7在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明内容进行进一步详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

一种含油污泥中石油烃类的降解菌株，菌株为假单胞菌属。

(一)材料准备

从辽河油田某地取回含油污泥，4℃保存，运回实验室后将其接种到LB培养基中进行活化。

2.培养基：

无机盐培养基的组分为：正十八烷1g，NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂ 0.02g，MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。

微量元素溶液：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g,FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂粉20蒸馏水1000mL，调节pH为7

3.实验仪器和设备

恒温振荡器

电热恒温培养箱

高压灭菌锅,

UV-1750紫外可见分光光度计-----上海棱光技术有限公司,

超净工作台,

OIL 480红外分光测油仪-----北京华夏科创有限公司，

PCR仪。

(二)菌株的分离筛选与驯化

取含油污泥10g放入装有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h；

24h后取1ml培养液用涂布棒涂布到含有正十八烷的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；

待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。将单菌落在液体LB培养基中扩繁，并保存在4℃，备用。使用前将保存的菌株在LB液体培养基中活化。

下面为具体实施例部分。

实施例1：辽河油田含油污泥的降解修复试验

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛，备用。挑取单菌落于灭菌的LB液体培养基中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃活化24h。称取上述风干研磨过筛后的含油污泥40g，按照10％的接种量加入OD600＝1的Pseudomonas sp.JN7活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养，每隔5d取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量，降解曲线如附图3所示。由图可知该细菌对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果，30天内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为43.49％。

Pseudomonas sp.JN7降解30天前后的含油污泥的GC-MS分析结果可以看出(表1)，原始的含油污泥中的主要成分是萘烷、正十四烷、十八烯、四甲基十五烷、四甲基十六烷、茚烷、高雄烃、N-(2-三氟甲基苯)-3-吡啶甲酰胺肟(C₁₃H₁₀F₃N₃O)、二十六碳烯、藿烷。Pseudomonas sp.JN7微生物降解后的含油污泥中含有别孕烷、2,2'-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、C₁₆H₅₀O₇Si₈、C₁₇H₁₄O₄和异甲基紫罗兰酮，可见含油污泥中的石油烃类物质在该菌株的作用下发生氧化反应，形成大量酚、酮类中间产物。说明Pseudomonas sp.JN7使含有污泥中的石油烃类污染物发生了分子结构的变化，大分子结构的污染物质在微生物的作用下被氧化分解成小分子结构。通过GC-MS分析发现，Pseudomonas sp.JN7以单一菌株对n-C₁₀～n-C₂₆的石油烃类具有明显的降解能力，且该菌株对含油污泥中的萘烷(C₁₀H₁₈)、十四烷、十八烯、茚烷、高雄烃和二十六碳烯的降解能力较强，降解率达100％。Pseudomonas sp.JN7降解30天后，含油污泥中仍有部分石油烃类物质残留，可以延长增加微生物降解时间和改变微生物降解条件等方式进一步降解。

表1Pseudomonas sp.JN7降解30天前后的含油污泥的GC-MS结果

实施例2：Pseudomonas sp.JN7在不同pH值下对含油污泥中石油烃类的降解效果

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，用稀H2SO4和NaOH调节土壤的pH分别为1、3、5、7、9、11，按照10％的接种量加入OD600＝1的Pseudomonas sp.JN7活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30℃的恒温培养箱中静置培养并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同pH条件下菌株Pseudomonas sp.JN7对含油污泥中的石油烃类的降解效果如图4所示。由图4可知，本发明所述菌株在pH 7-11范围内对含油污泥中的石油烃类具有较好的去除效果，pH 11的条件下降解效果最佳。

实施例3：Pseudomonas sp.JN7在不同温度下对含油污泥中石油烃类的降解效果

取辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛。称取上述含油污泥40g于锥形瓶中，按照10％的接种量加入OD600＝1的Pseudomonas sp.JN7活化的菌液，并用蒸馏水调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将锥形瓶分别放置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的恒温培养箱中静置培养，并于25天后取样，采用红外分光测油仪测定含油污泥中总石油烃类含量。在不同温度下菌株Pseudomonas sp.JN7对含油污泥中的总石油烃类的降解效果如图5所示。由图5可知，本发明所述菌株在20-50℃范围内对含油污泥中的石油烃类具有一定的降解效果，且降解率在20-50℃范围内相差不大，25℃条件下降解效果最佳。

实施例4：假单胞菌属Pseudomonas sp.JN7修复实际含油污泥

在以上实施例的基础上，将假单胞菌属Pseudomonas sp.JN7用于修复实际含油污泥，实验具体步骤如下：

(1)菌株Pseudomonas sp.JN7的菌悬液制备：挑取菌株JN7的单菌落于LB液体培养基中，放置于摇床中，于40℃，120rpm条件下培养24h。采用发酵罐进行发酵培养，将上述培养的种子液按5％的接种量接种于LB培养基中，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min，定时取样检测OD600值，生长至对数生长期后备用。

(2)供试含油污泥：采自辽河油田某处含油污泥，经自然风干，过8目筛(3mm筛)。将含油污泥样品装入有机玻璃容器中，按照10％的接种量加入OD600＝1的Pseudomonassp.JN7活化的菌液，并用无机盐培养基调节液土比为2:5，用透气封口膜封口。

(3)将添加了菌液和无机盐培养基的含油污泥放置于恒温培养箱中静置培养，为达到最佳的降解效果，调节土壤的pH值为11，并维持温度在25℃。

经过30天的生物降解处理后对含油污泥进行检测，发现对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为50.75％，对含油污泥中的石油烃类具有较好的降解效果。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种含油污泥中石油烃类的降解菌株JN7及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1405

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

tgcagtcgag cggatgaggg tagcttgcta cctgattcag cggcggacgg gtgagtaatg 60

cctaggaatc tgcccgatag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac 120

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gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900

gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt 960

ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020

tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgttatggt 1080

gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140

tcatggccct tacggccagg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca 1200

agccgcgagg tggagctaat ctcacaaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260

cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1320

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagcta 1380

gtctaacctt cggggggacg gtacc 1405

Claims (2)

1.一种含油污泥降解修复的菌株JN7，其特征在于，所述菌株为假单胞菌属Pseudomonas sp.，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.14978。

2.根据权利要求1所述的一种含油污泥降解修复的菌株JN7的应用，其特征是，包括如下步骤：

(1)挑取Pseudomonas sp.JN7单菌落于灭菌的LB液体培养基的锥形瓶中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃，活化24h制成种子培养液；

(2)将上述培养的种子液按5％的接种量接种于含LB培养基发酵罐进行培养，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200r/min，培养至对数生长期；

(3 )将辽河油田含油污泥，风干研磨、过1mm筛后，按照10％的接种量加入OD600＝1的Pseudomonas sp.JN7活化的菌液，并用无机盐培养基调节液土比为2:5，用透气封口膜封口；

(4 )将添加了菌液和无机盐培养基的含油污泥放置于恒温培养箱中静置培养，为达到最佳的降解效果，调节土壤的pH值为11，并维持温度在25℃；所述的LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，调节pH为7所述的无机盐培养基的组分为：NaCl 30g，NH₄NO₃ 3g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，CaCl₂ 0.02g，MgSO₄ 0.5g，琼脂粉20g， 去离子水1L， 微量元素溶液10ml；微量元素溶液的组分为：CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，FeSO₄·7H₂O 0.05g，去离子水50ml。

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