CN113481133A - 一种海内氏芽孢杆菌a87、菌剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种海内氏芽孢杆菌A87、菌剂及应用。海内氏芽孢杆菌A87于2021年04月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61610。本申请的海内氏芽孢杆菌A87是一株高产生物表面活性剂的菌株，菌株发酵及制备生物表面活性剂的方法简单易行，制备的生物表面活性剂及菌剂的环境适应性好，能保持较高的表界面活力和乳化降粘能力，具有高效的原油去除能力，可满足环境修复领域的工程需求。
Description
技术领域
本申请涉及微生物领域，尤其涉及一种海内氏芽孢杆菌A87、菌剂及应用。
背景技术
随着经济的发展，人类对能源的需求也在不断扩大，石油是最重要的能源之一，被成为“工业的血液”。近些年来各国都加快了对油气资源的开发利用，从沙漠到海洋、从无人区到人口稠密区，越来越多的油气井出现在世界各地。随之土壤污染问题日益突出，石油对土壤的污染危害大，潜伏期长，涉及面广，有研究者将其比喻为“化学定时炸弹”，已经成为不容忽视的环境问题。
石油主要是由烃类化合物组成的一种复杂化合物，其组成复杂，含有致畸、致癌、致突变的物质(如卤代烃、苯系物、苯胺类、菲、苯并[a]芘等）。土壤作为人类、动植物和微生物赖以生存的重要环境基础，是自然界物质和能量参与转化、迁移和积累等循环过程的重要场所，土壤安全事关人类食品安全。石油一旦进入土壤，将对人类健康和生态环境造成严重危害。根据已公布的环境保护部和国土资源部发布的《全国土壤污染状况调查公告》显示，我国土壤总超标率高达16.1%。其中，有机类污染物，尤其是石油污染物已成为导致土壤安全问题的重要因素之一。据报道在我国，勘探和开发的油气田有400多个，覆盖面积达3.2×105km2，其中约4.8×106hm2的土壤受到不同程度的污染，部分油田周边土壤中的总石油烃（TPH)质量分数已经远远超过临界值500mg/kg，对人居安全和生态环境造成了严重的威胁。由此可见，石油污染土壤形势严峻，修复工作迫在眉睫。
发明内容
本申请提供一种海内氏芽孢杆菌A87、菌剂及应用，能够用于石油污染土壤处理。
本申请采用了下列技术方案：
第一方面，本申请提供了一种海内氏芽孢杆菌A87，于2021年04月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61610。
第二方面，本申请提供了一种生物表面活性剂的制备方法，包括如下步骤：将上述的海内氏芽孢杆菌A87接种于NB固体培养基进行培养，得到单菌落，然后将单菌落接种于种子培养基进行第一次振荡培养，得到种子液，接着将种子液接种于发酵培养基进行第二次振荡培养，离心，得到发酵液。将发酵液干燥，得到样品，向样品加入无水乙醇后进行振荡提取，离心，保留上清液，挥发无水乙醇，得到生物表面活性剂。
进一步地，培养的条件为：在30℃培养1d。第一次振荡培养的条件为：在30℃、150rpm下振荡培养2d。第二次振荡培养的条件为：种子液与发酵培养基的体积比为1:20，在30℃、150rpm下振荡培养2d。
进一步地，干燥为冻干或烘干，冻干的条件为：将发酵液在-80℃冷冻，冻结后在-51℃抽真空进行冻干。振荡提取的条件为：温度为30℃，转速为180rpm，时间为24h。
第三方面，本申请提供了一种菌剂，包括上述的海内氏芽孢杆菌A87的培养物。
进一步地，菌剂还包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，其中，海内氏芽孢杆菌A87的培养物的质量占比为50%，枯草芽孢杆菌的质量占比为25%，解淀粉芽孢杆菌的质量占比为25%。
第四方面，本申请提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在排油和/或除油中的应用。
第五方面，本申请提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在石油污染土壤处理中的应用。
第六方面，本申请提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在石油工业领域中的含油污水处理、钻井泥浆处理、老化油及油泥处理、原油污染的土壤生物处理中的应用。
第七方面，本申请提供了一种用于排油和/或除油的产品，包括上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂、上述的菌剂中的一种或几种。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
本申请的海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)A87是一株高产生物表面活性剂的菌株，菌株发酵及制备生物表面活性剂的方法简单易行，制备的生物表面活性剂及菌剂的环境适应性好，能保持较高的表界面活力和乳化降粘能力，具有高效的原油去除能力，可满足环境修复领域的工程需求。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本申请的限制。在附图中：
图1为菌株A87的菌落形态图；
图2为菌株A87的菌体和芽孢革兰氏染色镜检图；
图3为菌株A87发酵液的排油圈；
图4为菌株A87发酵液对石蜡油的乳化效果；
图5为菌株A87处理含油土壤降解率；
图6为菌剂处理含油土壤降解率。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
相关技术中，生物表面活性剂是一种可降解的表面活性剂，是微生物在一定条件下代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。与化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂的分子结构也由两部分组成，疏油亲水的极性基团和疏水亲油的非极性基团；生物表面活性剂不仅具有化学表面活性剂具有的各种表面性能，而且还拥有下列优点：1、适应范围广，几乎可以用于各种领域；2、分子结构类型多样，部分类型具有许多特殊的官能团，表面性能优异；3、生物毒性极低、对环境友好，100%可生物降解；4、适用于极端温度、pH和盐度。5、原料在自然界广泛存在且价廉，发酵生产是典型的“绿色”工艺等，这是一般化学合成的表面活性剂难以匹敌的。生物表面活性剂拥有庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强，因其具有许多独特的优良特性，从而吸引着越来越多的研究者。
在石油污染土壤的处理技术中，与传统物理和化学处理方法相比，生物处理技术具有作用持久、低成本、环境友好等优势，具有广阔的开发与应用前景。针对石油中难降解的有机物，利用能够高效降解这些污染物的优良菌种，调控生态因子，从而使污染物达到排放标准具有重要的工业价值。
海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)为革兰氏阳性芽孢杆菌，其生长过程中可以产生大量生物表面活性剂，生长速度快，稳定性好。芽孢杆菌作为工业生产脂肽类生物表面活性剂的优良菌种，其中报道最多的是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。目前，暂无海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)及其生物活性产物在环境修复领域中应用的相关报道。
本申请提供了一种海内氏芽孢杆菌A87，分类命名为：Bacillus haynesii，保藏单位名称为：广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为：2021年4月19日，保藏编号为：GDMCC No:61610。
本申请提供了一种生物表面活性剂的制备方法，包括如下步骤：
将上述的海内氏芽孢杆菌A87接种于NB固体培养基进行培养，得到单菌落，然后将单菌落接种于种子培养基进行第一次振荡培养，得到种子液，接着将种子液接种于发酵培养基进行第二次振荡培养，离心，得到发酵液。
将发酵液干燥，得到样品，向样品加入无水乙醇后进行振荡提取，离心，保留上清液，挥发无水乙醇，得到生物表面活性剂。
其中，
采用的培养基及其组成如下：营养肉汤固体培养基(NB固体培养基)：琼脂粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，最终pH7.2±0.2。种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0±0.2。发酵培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0±0.2。
培养的条件为：在30℃培养1d。第一次振荡培养的条件为：在30℃、150rpm下振荡培养2d。第二次振荡培养的条件为：种子液与发酵培养基的体积比为1:20，在30℃、150rpm下振荡培养2d。
干燥为冻干或烘干，冻干的条件为：将发酵液在-80℃冷冻，冻结后在-51℃抽真空进行冻干。振荡提取的条件为：温度为30℃，转速为180rpm，时间为24h。
本申请还提供了一种菌剂，包括上述的海内氏芽孢杆菌A87的培养物。具体地，海内氏芽孢杆菌A87的培养物可以为海内氏芽孢杆菌A87的种子液、发酵液，也可以为海内氏芽孢杆菌A87的发酵产物。
菌剂还包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，其中，海内氏芽孢杆菌A87的培养物的质量占比为50%，枯草芽孢杆菌的质量占比为25%，解淀粉芽孢杆菌的质量占比为25%。
本申请还提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在排油和/或除油中的应用。
本申请还提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在石油污染土壤处理中的应用。
本申请还提供了一种上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂或上述的菌剂在石油工业领域中的含油污水处理、钻井泥浆处理、老化油及油泥处理、原油污染的土壤生物处理中的应用。
本申请还提供了一种用于排油和/或除油的产品，包括上述的海内氏芽孢杆菌A87、上述的制备方法制得的生物表面活性剂、上述的菌剂中的一种或几种。
下面结合实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。
下述实施例采用的培养基及其组成如下：
血平板培养基配方(每升)：酪蛋白胰酶消化物10.0g、心胰酶消化物3.0g、玉米淀粉1.0g、肉胃酶消化物5.0g、酵母浸出粉5.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、无菌脱纤维羊血50-100mL、蒸馏水1000mL，最终pH7.3±0.2。
营养肉汤固体培养基(NB固体培养基)：琼脂粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，最终pH7.2±0.2。
营养肉汤液体培养基(NB培养基)：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化钠5g/L，最终pH7.2±0.2。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0±0.2。
发酵培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0±0.2。
实施例1产生物表面活性剂菌株的筛选及鉴定
1.产生物表面活性剂菌株的筛选
(1)菌株来源：实验室筛选一批厨余垃圾降解高温菌。
(2)菌株产生物表面活性剂初筛：将菌株接种于血平板培养基上，放于30℃培养箱中培养。将有溶血圈的菌株接种至斜面培养基中，4℃保存，备用。
(3)菌株复筛：将保存的菌种接种至NB培养基中，30℃、160rpm振荡培养24h。取上述菌液，12000r/min条件下离心后测定上清液的表面张力，其中编号为A87的菌株表面张力最低，测定值为27.4mN/m。
2.菌株A87的鉴定
(1)菌体特征：细胞呈短杆状，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌株A87的菌体和芽孢革兰氏染色镜检图具体见图2。
(2)菌落特征：菌落形态为中间有褶皱凸起，边缘不整齐，菌落表面粗糙无光泽。菌株A87的菌落形态图具体见图1。
(3)理化性质：经鉴定该菌株为好氧，革兰氏阳性菌。
(4)遗传学特征：经16SrRNA基因序列分析，表明其属于海内氏芽孢杆菌(Bacillushaynesii)，定名为A87。
该菌株已在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为GDMCC No:61610，保藏日期为2021年04月19日。
实施例2菌株A87发酵产物的提取
菌株A87的发酵：将海内氏芽孢杆菌A87菌种接种于NB固体培养基上，在30℃培养1d，将单菌落接种于种子培养基内，在30℃、150rpm下振荡培养2d，成为种子液，种子液按照体积比1:20接入发酵培养基中，在30℃、150rpm下振荡培养2d，离心，得发酵液。
提取A87中的发酵产物：取冻干盘，将发酵液倒入，于-80℃冷冻，待发酵液冻结后，-51℃抽真空进行冻干。发酵液冻干后，收集样品放入血清瓶（瓶盖须有密封垫片防止漏液），加入无水乙醇，置于摇床振荡提取，温度：30℃、转速：180rpm，提取24h。提取完毕后，12000转离心，保留上清，可采用晾干、水浴、真空减压干燥等方法加快乙醇挥发，待乙醇完全挥发后得发酵产物-生物表面活性剂。
2.5μL纯化后的生物表面活性剂，可形成直径约5cm的排油圈。
实施例3菌株A87生物活性物质性能的测定
对实施例2得到的菌株A87的发酵液进行如下的测定。
(1)发酵液排油圈测定：将8mL的橄榄油加入到装有60mL纯化水的9cm平皿中，平皿表面形成一层均匀分散的油膜后，在油膜中心慢慢滴入菌株A87发酵液0.2mL，观察排油圈大小，结果如图5所示，结果表明A87能产生较大排油圈，直径约4cm。菌株A87发酵液的排油圈具体见图3。
(2)液体石蜡乳化率：取液体石蜡5mL，在刻度试管内分别与等体积的菌株A87发酵液混合，漩涡振荡器震荡1min，混合后静置，15min后观察乳化层高度，结果表明A87发酵液对液体石蜡乳化率可达72%。菌株A87发酵液对石蜡油的乳化效果具体见图4。其中，A:乳化前，B:乳化后，C:乳化后静置15min。
实施例4菌株A87处理含油土壤试验
发酵培养基中接入含油量约1000mg/L的含油土壤样品，高温高压灭菌后，接入A87种子液，接种量为10%，150rpm培养8d后，加入适量的石油醚萃取至发酵液无色，经无水硫酸钠脱水，保证萃取液不浑浊，在430nm的波长下比色。结果表明菌株A87能够将含油量1000mg/L的含油土壤降解至370mg/L，降解率达63%，菌株A87对含油土壤有较好的处理效果。菌株A87处理含油土壤降解率见图5。
实施例5菌剂处理含油土壤试验
菌剂配比：菌株A87的培养物：50%、枯草芽孢杆菌：25%、解淀粉芽孢杆菌：25%。
发酵培养基中接入含油量约1000mg/L的含油土壤样品，高温高压灭菌后，加入菌剂，加入量为10%，150rpm培养8d后，加入适量的石油醚萃取至发酵液无色，经无水硫酸钠脱水，保证萃取液不浑浊，在430nm的波长下比色。结果表明菌剂能够将含油量1000mg/L的含油土壤降解至230mg/L，降解率达77%，菌剂对含油土壤有较好的处理效果。菌剂处理含油土壤降解率具体见图6。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 碧沃丰工程有限公司
碧沃丰生物科技（广东）股份有限公司
<120> 一种海内氏芽孢杆菌A87、菌剂及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atttgtcact tcggcggctg gctccaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 60
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact 180
gagaacagat ttgtgggatt ggcttagcct cgcggcttcg ctgccctttg ttctgcccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat 360
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggaagccct atctctaggg ttgtcagagg 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga 600
gtgcttaatg cgtttgctgc agcactaaag ggcggaaacc ctctaacact tagcactcat 660
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgcgcct 720
cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg 780
catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc 840
caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcgc 900
gcgctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag taccgtcaag 1000
Claims (10)
1.一种海内氏芽孢杆菌A87，其特征在于，于2021年04月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61610。
2.一种生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87接种于NB固体培养基进行培养，得到单菌落，然后将所述单菌落接种于种子培养基进行第一次振荡培养，得到种子液，接着将所述种子液接种于发酵培养基进行第二次振荡培养，离心，得到发酵液；
将所述发酵液干燥，得到样品，向所述样品加入无水乙醇后进行振荡提取，离心，保留上清液，挥发所述无水乙醇，得到生物表面活性剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述培养的条件为：在30℃培养1d；
所述第一次振荡培养的条件为：在30℃、150rpm下振荡培养2d；
所述第二次振荡培养的条件为：所述种子液与所述发酵培养基的体积比为1:20，在30℃、150rpm下振荡培养2d。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述干燥为冻干或烘干，所述冻干的条件为：将所述发酵液在-80℃冷冻，冻结后在-51℃抽真空进行冻干；
所述振荡提取的条件为：温度为30℃，转速为180rpm，时间为24h。
5.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87的培养物。
6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，还包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，其中，所述海内氏芽孢杆菌A87的培养物的质量占比为50%，所述枯草芽孢杆菌的质量占比为25%，所述解淀粉芽孢杆菌的质量占比为25%。
7.一种权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87、权利要求2-4任一所述的制备方法制得的生物表面活性剂或权利要求5或6 所述的菌剂在排油和/或除油中的应用。
8.一种权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87、权利要求2-4任一所述的制备方法制得的生物表面活性剂或权利要求5或6 所述的菌剂在石油污染土壤处理中的应用。
9.一种权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87、权利要求2-4任一所述的制备方法制得的生物表面活性剂或权利要求5或6 所述的菌剂在石油工业领域中的含油污水处理、钻井泥浆处理、老化油及油泥处理、原油污染的土壤生物处理中的应用。
10.一种用于排油和/或除油的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的海内氏芽孢杆菌A87、权利要求2-4任一所述的制备方法制得的生物表面活性剂、权利要求5或6 所述的菌剂中的一种或几种。
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Denomination of invention: A Bacillus subtilis A87, its preparation and application Effective date of registration: 20231120 Granted publication date: 20211119 Pledgee: Guangdong Nanhai Rural Commercial Bank branch branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Beverly Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd.|BIO-FORM ENGINEERING CO.,LTD.|Biwofeng ecological environment Co.,Ltd. Registration number: Y2023980066506 |