CN116083314A - 一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及土壤微生物修复技术领域，具体公开了一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂及其制备方法和应用，高效菌剂包括体积比为(0.5：5)‑(5：0.5)的石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌；石油烃降解复合功能菌包括蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌；多环芳烃降解复合功能菌包括乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌中的两种及以上。本发明一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂能够修复含有多环芳烃(苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、萘、二苯并[a,h]蒽)和石油烃(C10‑C40)等多种污染物的土壤。
Description
技术领域
本发明涉及土壤微生物修复技术领域，更具体的说是涉及一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
土壤中的复合有机污染物主要来源于石油化工等行业废弃物的处理和大气的沉降等，其中主要包括多环芳烃、石油烃等有机污染物，通过挥发、淋溶和由浓度梯度产生的扩散等在城市土壤中迁移或逸入空气、水体中，对大气、水体、生态系统和人类的生命造成极大危害。同时，随着城市化和工业化进程的加快，城市和工业区附近的土壤有机污染日益加剧。
目前对土壤的主要修复技术包括物理、化学和微生物修复，物理和化学法因为处理成本高和造成二次污染问题现已被逐渐替代，而微生物处理技术在经过多次试验和应用中因为其较低的成本投入和较好的环境效益而逐渐成为目前应用最为广泛的处理方法。
其中，微生物修复技术是指利用环境中的土著微生物或利用经过驯化、改良的高效降解微生物，在改善环境生存条件的基础上，以加快污染物降解，达到环境修复的目的。微生物修复技术在所有修复手段中，属于研究较多且较为成熟的技术，也是目前有机污染物修复方向最为活跃和集中的热点。随着生物组学技术的发展，筛选降解菌株早已不在是难题，并且当前已筛选出大量具有降解多环芳烃和石油烃能力的细菌和真菌。
但目前，微生物降解多环芳烃和石油烃的研究往往停留在对单一菌株的降解效果以及对单一污染物去除的研究。然而在实际污染的环境中，有多种污染物和微生物共存，如兰炭工业复合污染场地的污染物通常包括多环芳烃(苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、萘、二苯并[a,h]蒽等)和石油烃(C10-C40)；且由于污染物和其中间代谢物的毒性以及与其它微生物的竞争的影响，各地区兰炭场地工艺不同，从而导致复合有机污染物的性质、组分存在差异，因此单一降解菌株难以对各种复合有机污染物均取得良好的降解效果，导致很多重要的生化过程无法完成。而多个菌株具有不积累有毒中间产物的情况下降解有毒底物的优势和能力。
因此亟需一种能够同时处理多种污染物、用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够同时处理如多环芳烃(苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、萘、二苯并[a,h]蒽等)和石油烃(C10-C40)等多种污染物的用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂，包括体积比为(0.5：5)-(5：0.5)的石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌；
所述石油烃降解复合功能菌包括蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌；
所述多环芳烃降解复合功能菌包括乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌。
进一步的，所述石油烃降解复合功能菌中蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的体积比为1：1：1。
进一步的，所述多环芳烃降解复合功能菌中乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌按体积比等比例混合。
进一步的，所述多环芳烃降解复合功能菌包括体积比为1：1：1：1：1的乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌。
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)固体平板培养：将蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种到生长固体培养基中37℃恒温培养2d；所述生长固体培养基配方为：蛋白胨0.5％—1％，牛肉膏0.3％—0.5％，氯化钠0.8％—1％，琼脂1.5％—2％，其余为水，且pH为7.0—7.2；
2)种子液培养：将步骤1)中培养的蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种于液体生长培养基中，37℃，130r/min下培养1d，当OD600值达到0.8时停止培养，分别获得对应的种子液；所述液体生长培养基配方为：蛋白胨0.5％—1％，牛肉膏0.3％—0.5％，氯化钠0.8％—1％，其余为水，且pH为7.0—7.2；
3)高效菌剂制备：将步骤2)中得到的蛋白水解芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液和铜绿假单胞菌种子液按照1：1：1的体积比混合得到石油烃降解复合功能菌；
将步骤2)中得到的乙酸钙不动杆菌种子液、热带芽孢杆菌种子液、细长赖氨酸芽胞杆菌种子液、短小芽孢杆菌种子液和海内氏芽孢杆菌种子液按照1：1：1：1：1的体积比混合得到多环芳烃降解复合功能菌；
将石油烃降解复合功能菌、多环芳烃降解复合功能菌按照(0.5：5)-(5：0.5)的体积比混合，得到高效菌剂。
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂在土壤修复工程中的应用，应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.2％—0.3％，磷酸氢二钾0.1％—0.3％，磷酸二氢钾0.05％—0.2％，氯化钠0.1％—0.2％，七水硫酸镁0.05％—0.1％，氯化钙0.005％—0.01％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.0—7.2。
进一步的，所述待修复土壤中污染物包括多环芳烃和石油烃(C10-C40)。
进一步的，所述土壤中多环芳烃包括苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、萘、二苯并[a,h]蒽所述多环芳烃功能降解菌为乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌等中的一种或几种。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂及其制备方法和应用，该发明适用于兰炭工业复合有机污染场地，高效菌剂中石油烃降解复合功能菌包括蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌；多环芳烃降解复合功能菌包括乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌中进行两种或两种或以上不同功能菌复配，复配后稳定性良好，去除效率均高于单一菌株的降解效果，对提高对复合有机污染物的降解能力的应用有重要作用。
本发明通过调整高效菌剂中各菌种的生长培养基和降解培养基配方和比例，使得高效菌剂对复合有机污染物的降解性能提升及扩宽了菌剂的适用范围；本发明还公开了上述高效菌剂用于处理兰炭场地复合有机污染物的应用，最终处理效果均可达到GB 36600-2018《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》第一类用地筛选值标准和DB21/T2274—2014《多环芳烃污染农田土壤生态修复标准》。
附图说明
图1为本发明实施例1一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂具体应用于修复有机污染土壤时五种不同投加方案对高山村某兰炭废弃场污染土壤的降解情况示意图；
图2为本发明实施例2一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂具体应用于修复有机污染土壤时五种不同投加方案对新窑村某兰炭废弃场污染土壤的降解情况示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体内容做进一步详细解释说明。
实施例
实施例1
以陕西省榆林市高山村某兰炭废弃场污染土壤为例，初始污染浓度多环芳烃总浓度为7.58mg/kg(苯并[a]蒽1.7mg/kg，苯并[a]芘1.3mg/kg，苯并[b]荧蒽3.1mg/kg，萘1.48mg/kg)，石油烃2.14×103mg/kg。
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)固体平板培养：将蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种到生长固体培养基中37℃恒温培养2d，使菌株充分生长；生长固体培养基配方为：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.8％，琼脂1.5％，其余为水，该生长培养基的pH为7.0。
2)种子液培养：将步骤1)中培养的蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种于液体生长培养基中，37℃，130r/min下培养1d，当OD600值达到0.8时停止培养，分别获得对应的种子液，蛋白水解芽孢杆菌为种子液A，枯草芽孢杆菌为种子液B，铜绿假单胞菌为种子液C，乙酸钙不动杆菌为种子液D，热带芽孢杆菌为种子液E，细长赖氨酸芽胞杆菌为种子液F，短小芽孢杆菌为种子液G，海内氏芽孢杆菌为种子液H；液体生长培养基配方为：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.8％，其余为水，该生长培养基的pH为7.0。
将种子液A、种子液B、种子液C按照体积比为1:1:1混合，得到石油烃降解复合功能菌。
将种子液D、种子液E、种子液F、种子液G、种子液H按照体积比为1:1:1:1:1混合，得到多环芳烃降解复合功能菌。
应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌混合得到的高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.2％，磷酸氢二钾0.1％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.1％，七水硫酸镁0.05％，氯化钙0.005％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.0。
本实施例中应用高效菌剂修复有机污染土壤时具体分为以下五种投加方案：
方案一：只有10％的石油烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和复合有机污染土壤。
方案二：只有10％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和复合有机污染土壤。
方案三：5％的石油烃降解复合功能菌，5％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
方案四：2％的石油烃降解复合功能菌，8％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
方案五：8％的石油烃降解复合功能菌，2％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
由图1可得，初始多环芳烃总浓度为7.58mg/kg，石油烃浓度为2.14×
103mg/kg，经过7天的降解之后，不同菌剂投加方案对复合有机污染物质降解情况如下：方案一中经过降解后多环芳烃浓度降至5.69mg/kg，石油烃浓度降至384mg/kg；方案二中经过降解后多环芳烃浓度降至0.81mg/kg，石油烃浓度降至1028mg/kg；方案三中经过降解后多环芳烃浓度降至1.66mg/kg，石油烃浓度降至487mg/kg；方案四中经过降解后多环芳烃浓度降至1.29mg/kg，石油烃浓度降至752mg/kg；方案五中经过降解后多环芳烃浓度降至3.17mg/kg，石油烃浓度降至443mg/kg。由此可得：按照本发明公开的比例加入两种降解功能菌剂对复合有机污染物质有着较好的处理效果并且降解效果明显优于单一功能降解菌剂。
实施例2
以陕西省榆林市新窑村某兰炭废弃场污染土壤为例，初始污染浓度多环芳烃总浓度为73.9mg/kg(苯并[a]蒽19.5mg/kg，苯并[a]芘7.9mg/kg，萘35.6mg/kg，苯并[b]荧蒽9.87mg/kg，二苯并[a,h]蒽1.03mg/kg)，石油烃25801mg/kg。
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)固体平板培养：将蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种到生长固体培养基中37℃恒温培养2d，使菌株充分生长；生长固体培养基配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，其余为水，该生长培养基的pH为7.2。
2)种子液培养：将步骤1)中培养的蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种于液体生长培养基中，37℃，130r/min下培养1d，当OD600值达到0.8时停止培养，分别获得对应的种子液，蛋白水解芽孢杆菌为种子液A，枯草芽孢杆菌为种子液B，铜绿假单胞菌为种子液C，乙酸钙不动杆菌为种子液D，热带芽孢杆菌为种子液E，细长赖氨酸芽胞杆菌为种子液F，短小芽孢杆菌为种子液G，海内氏芽孢杆菌为种子液H；液体生长培养基配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠1％，其余为水，该生长培养基的pH为7.2。
将种子液A、种子液B、种子液C按照体积比为1:1:1混合，得到石油烃降解复合功能菌。
将种子液D、种子液E、种子液F、种子液G、种子液H按照体积比为1:1:1:1:1混合，得到多环芳烃降解复合功能菌。
应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌混合得到的高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.3％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钾0.2％，氯化钠0.2％，七水硫酸镁0.1％，氯化钙0.01％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.2。
本实施例中应用高效菌剂修复有机污染土壤时具体分为以下五种投加方案：
方案一：只有10％的石油烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和复合有机污染土壤。
方案二：只有10％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和复合有机污染土壤。
方案三：5％的石油烃降解复合功能菌，5％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
方案四：2％的石油烃降解复合功能菌，8％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
方案五：8％的石油烃降解复合功能菌，2％的多环芳烃降解复合功能菌，其余为降解培养基和油泥。
由图2可得，初始多环芳烃总浓度为73.9mg/kg，石油烃浓度为25801mg/kg，经过7天的降解之后，不同菌剂投加方案对复合有机污染物质降解情况如下：方案一中经过降解后多环芳烃浓度降至60.58mg/kg，石油烃浓度降至11725mg/kg；方案二中经过降解后多环芳烃浓度降至27.11mg/kg，石油烃浓度降至20092mg/kg；方案三中经过降解后多环芳烃浓度降至35.47mg/kg，石油烃浓度降15465mg/kg；方案四中经过降解后多环芳烃浓度降至34.01mg/kg，石油烃浓度降19542mg/kg；方案五中经过降解后多环芳烃浓度降至48.97mg/kg，石油烃浓度降14896mg/kg。由此可得：按照本发明公开的比例加入两种降解功能菌剂对复合有机污染物质有着较好的处理效果并且降解效果明显优于单一功能降解菌剂。
实施例3
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于：
步骤1)中生长固体培养基配方为：蛋白胨0.8％，牛肉膏0.4％，氯化钠0.9％，琼脂1.8％，其余为水，该生长培养基的pH为7.1；
步骤2)中液体生长培养基配方为：蛋白胨0.8％，牛肉膏0.4％，氯化钠0.9％，其余为水，该生长培养基的pH为7.1；
且高效菌剂由石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌按照0.5:5的体积比混合得到，应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.25％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.15％，七水硫酸镁0.075％，氯化钙0.0075％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.1。
实施例4
一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于：高效菌剂由石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌按照5:0.5的体积比混合得到，应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.25％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.15％，七水硫酸镁0.075％，氯化钙0.0075％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.1。
Claims (8)
1.一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂，其特征在于：包括体积比为(0.5：5)-(5：0.5)的石油烃降解复合功能菌和多环芳烃降解复合功能菌；
所述石油烃降解复合功能菌包括蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的混合物；
所述多环芳烃降解复合功能菌包括乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌中的两种及以上。
2.如权利要求1所述的一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂，其特征在于，所述石油烃降解复合功能菌中蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的体积比为1：1：1。
3.如权利要求1所述的一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂，其特征在于，所述多环芳烃降解复合功能菌中乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌按体积比等比例混合。
4.如权利要求1所述的一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂，其特征在于，所述多环芳烃降解复合功能菌包括体积比为1：1：1：1：1的乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)固体平板培养：将蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种到生长固体培养基中37℃恒温培养2d；所述生长固体培养基配方为：蛋白胨0.5％—1％，牛肉膏0.3％—0.5％，氯化钠0.8％—1％，琼脂1.5％—2％，其余为水，且pH为7.0—7.2；
2)种子液培养：将步骤1)中培养的蛋白水解芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、热带芽孢杆菌、细长赖氨酸芽胞杆菌、短小芽孢杆菌和海内氏芽孢杆菌分别接种于液体生长培养基中，37℃，130r/min下培养1d，当OD600值达到0.8时停止培养，分别获得对应的种子液；所述液体生长培养基配方为：蛋白胨0.5％—1％，牛肉膏0.3％—0.5％，氯化钠0.8％—1％，其余为水，且pH为7.0—7.2；
3)高效菌剂制备：将步骤2)中得到的蛋白水解芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液和铜绿假单胞菌种子液按照1：1：1的体积比混合得到石油烃降解复合功能菌；
将步骤2)中得到的乙酸钙不动杆菌种子液、热带芽孢杆菌种子液、细长赖氨酸芽胞杆菌种子液、短小芽孢杆菌种子液和海内氏芽孢杆菌种子液按照1：1：1：1：1的体积比混合得到多环芳烃降解复合功能菌；
将石油烃降解复合功能菌、多环芳烃降解复合功能菌按照(0.5：5)-(5：0.5)的体积比混合，得到高效菌剂。
6.一种如权利要求1-4中任意一项所述的用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂在土壤修复工程中的应用，其特征在于，应用高效菌剂修复土壤时投加方案为：将高效菌剂投加到降解培养基中，且所述高效菌剂的投加体积比为降解培养基的10％；所述降解培养基中包括氯化铵0.2％—0.3％，磷酸氢二钾0.1％—0.3％，磷酸二氢钾0.05％—0.2％，氯化钠0.1％—0.2％，七水硫酸镁0.05％—0.1％，氯化钙0.005％—0.01％，质量分数为2％的污染土壤，其余为水，该降解培养基的pH为7.0—7.2。
7.如权利要求6中所述的一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂在土壤修复工程中的应用，其特征在于，所述待修复土壤中污染物包括多环芳烃和石油烃(C10-C40)。
8.如权利要求7中所述的一种用于降解兰炭工业复合有机污染物的高效菌剂在土壤修复工程中的应用，其特征在于，所述土壤中多环芳烃包括苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、萘、二苯并[a,h]蒽。
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