CN117187103A - 一株石油降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一株石油降解菌及其应用，在页岩油泥中分离纯化出一株菌FM‑1，通过形态学、生化实验和16S rDNA测序鉴定为解蛋白芽孢杆菌Bacillus proteolyticus；对分离到的菌株FM‑1进行C12、C17、原油及污油泥样本的降解试验，利用气相色谱法和分光光度计法检测其对主要污染物石油烃类的降解效果；结果显示，该菌株能够利用C10至C40的石油烃作为唯一碳源，在本试验条件下七天的原油降解率为17.45％；对污油泥中的石油烃污染物的降解率在28天高达91.5％。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程菌株筛选及应用领域，具体是一株对石油污染物具有显著降解作用的微生物菌株。
背景技术
随着全球石油需求的不断增加，为了降低对国外石油的依赖程度，满足国内日益增长的石油需求，页岩油成为非常规石油资源的主要来源，对页岩油的开发已经作为国家、黑龙江省、大庆市重点发展战略，但是在开采的同时产生了大量污油泥，爆发式增长的油泥处理给油田页岩油发展提出了挑战。这些由水、粉、油组成的稳定的乳化废弃物，结构复杂，稳定性高，不易在自然界中降解，对环境的危害性较大，且这些危害具有累积效应。如果污油泥污染土壤，可改变土壤的形态及理化特性，降低土壤中酶类的活性，抑制植物生长，严重破坏生态环境。此前，我国对污油泥的主要处理办法分为热修复法和化学法两种。前者对污油泥高温处理以消除部分石油烃污染物，但是处理成本高，二次污染控制较难。后者利用一些化学试剂与石油烃反应达到消除目的，但是其反应程度低，二次危害不可控。因此，目前生物技术处理成为研究和应用的焦点。
近年来，利用微生物降解石油烃污染物的方法得到广泛研究，其生物降解特性解决了传统方法成本高的问题，同时生物处理技术以其巨大的环境友好、成本低廉、降解彻底等优势成为综合处理污油泥的关键手段之一。利用16S rDNA测序及宏基因组学分析可以有效地了解在石油污染地区的土著菌分类情况，并根据菌系种类进行分选，培育出高效石油烃类污染物降解菌。利用合适的碳源对土著菌进行驯化，使其降解功能大大增强，达到工业上大规模降解污油泥的目的。
现有技术中也存在着利用石油降解微生物处理石油污染物的方法，但是至今在菌株的发掘、降解效率方面仍然需要进一步研发。
发明内容
基于上述的现有技术缺陷，本发明在大庆页岩油井产出的污油泥中分离鉴定了一株解蛋白芽孢杆菌Bacillus proteolyticus FM-1，降解试验发现该菌株具有高效降解石油烃污染物以及处理污油泥的能力。通过国内文献和专利检索，发现该解蛋白芽孢杆菌是一种新的石油烃类降解菌，在页岩油污油泥处理中具有重要的应用价值，该菌株的分离鉴定为处理油泥提供了新的菌株资源。
本发明的第一个方面是提供一种对石油污染物具有降解作用的微生物菌株，其特征在于，所述的微生物菌株为解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)，其16S rDNA序列为SEQ ID NO:1所示；所述的菌株于2023年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.27048，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个方面提供一种降解石油污染物的菌剂，其特征在于，所述的菌剂包含本发明第一个方面所述的微生物菌株。
本发明第三个方面是提供本发明的第一个方面所述的微生物菌株在制备降解石油污染物的制剂中的用途；优选的，所述的石油污染为非常规页岩油或常规石油的石油污染。
本发明第四个方面是提供一种降解石油污染物的方法，所述的方法是利用本发明第一方面所述的菌株或第二方面所述的菌剂发酵分解污染样品；在一个优选的实施例中，所述的样品为石油污染样品；在另外一个具体的实施例中，将所述污染样品加入到含有吐温80 的无机盐培养基中，接种所述的微生物，在25～35℃黑暗中振荡培养，分别在培养后的7天、14天、21天和28天取样，利用气相色谱法测定污油泥中剩余石油烃的浓度。
本发明第五个方面提供一种培养第一方面所述微生物菌株方法，其特征在于，所述的方法中使用C10至C40的石油烃作为唯一碳源培养所述的微生物菌株。在一个优选的实施例中，其特征在于，所述的唯一碳源为C12或C17的正构烷烃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
利用气相色谱法和分光光度计法检测其对主要污染物石油烃类的降解效果。结果显示，FM-1为解蛋白芽孢杆菌Bacillus proteolyticus。该菌株能够
①FM-1可以在含有乙酸钠作为唯一碳源的培养基上生长，且液体培养基呈现淡绿色，表明菌株FM-1具有反硝化作用；
②利用C10至C40的石油烃作为唯一碳源；
③实施例中，七天的原油降解率为17.45％；对页岩污油泥中的石油烃污染物的降解率在28天高达91.5％。
附图说明
图1：FM-1平板培养菌落形态；
图2FM-1革兰氏染色；
图3FM-1在YPD、MRS和LB培养基中的生长曲线；
图4FM-1菌株进化树；
图5FM-1以C12唯一碳源的生长状况及残量检测；
图6FM-1以C17唯一碳源的生长状况及残量检测；
图7利用紫外分光光度计OD600处的吸光值，绘制标准曲线
图8分光光度计检测菌株FM-1对原油的七天降解效果；
图9气相色谱法检测菌株FM-1对页岩油泥的七天降解效果；
图10FM-1生长曲线与页岩油泥中石油烃剩余量对照图；
图11FM-1对石油烃降解偏好的气相色谱分布图。
具体实施方式
以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
本发明实验过程中使用的材料包括：
1、污油泥样品
本实验所用污油泥取自大庆页岩油井。经过简单离心处理后得到需要石油微生物降解的含油土。取样标准符合土壤环境监测技术规范，处理后的污油泥样本经检测干物质含量约占93.1％，含水率约为7.4％。
2、原油样品
本实验所用原油取自大庆油田(地处东经124°47′，北纬46°02′,温带季风气候)。黑色，果冻状，各组分含量分别为饱和烃64.34％，芳香烃20.12％，胶质5.47％，沥青质0.31％。棕色磨砂口瓶4℃保存。
3、培养基
1)酵母肉汤(YPD)培养基：10g蛋白胨、10g酵母提取物、8g葡萄糖，双蒸水溶解定容于1000mL。
2)无机盐(IS)培养基：6g K2HPO4、6g KH2PO4、6g(NH4)2SO4、12g NaCl、2.6gMgSO4·7H2O、0.16g CaCl2·H2O，双蒸水溶解定容于1000mL。
3)固体琼脂平板：10g蛋白胨、10g酵母提取物、8g葡萄糖和15g琼脂，双蒸水溶解定容于1000mL。
实施例1、菌株筛选分离和鉴定
1)从油田采集的污油泥样本中称取1g，加入100mL无机盐培养基反复冲洗，取200μL涂布在琼脂平板上培养10h，挑取单菌落接种5mL YPD液体培养基中，30℃150rpm培养8h。然后，划线接种于YPD平板上，30℃培养12h。培养结束后，挑取单菌落并接种5mL YPD液体培养基进行纯培养，30℃150rpm孵育过夜。重复上述步骤，分离的细菌接种于含有2g/L原油的无机盐液体培养基中驯化，分离纯化的菌株命名为FM-1；选择OD600值处于平台期的菌体做革兰氏染色鉴定。观察生长在YPD固体培养基超过一天的菌落形态。
结果显示：从污油泥中分离出一株杆状细菌，在YPD固体培养基30℃下生长>24h的FM-1菌落(0.5-1mm)呈乳白色、湿润圆形、边缘不整、表面光亮有皱褶(图1)。菌株FM-1经革兰氏染色后，在光学显微镜下(×400)观察颜色和状态，结果表明，该菌株呈蓝色，为革兰氏阳性菌(图2)
2)将活化的FM-1细菌接种于LB培养基、YPD培养基和MRS培养基中，30℃，150rpm震荡避光培养，培养后每间隔3h取样测定OD600吸光值，直至48h，绘制生长曲线。依据16S rDNA序列分析、伯杰氏细菌鉴定手册，以及选取解蛋白芽孢杆菌的代谢途径作为参考做生化试验。
结果显示：FM-1在LB培养基、YPD培养基和MRS培养基中的生长曲线相似，在MRS培养基生长相对较好(图3)。其生化特征见表1，显示菌株FM-1的代谢特征，生化鉴定显示FM-1可在葡萄糖发酵管中生长，但是不能在木糖和甘露醇发酵管中生长，接触酶阳性等，这些生化特征符合《伯杰氏细菌鉴定手册》蜡样芽孢杆菌的分类标准。通过酪蛋白实验对FM-1进一步鉴定发现其可以降解酪蛋白。
表1 FM-1的生化鉴定
Table 1 Biochemical identification of FM-1
3)将细菌液体培养物离心(6000rpm，5min)后，弃去上清液，并将样品立即放入干冰中运输到上海派森诺生物科技有限公司进行测序，根据16S rDNA测序结果构建菌株FM-1进化树。
结果显示：测序结果表明16S rDNA序列长度为1445bp，登录NCBI网站，将获得的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1所示)在核酸数据库中BLAST，剔除与受检菌株已知同源性低的序列，用MEGA7软件构建系统发育树，发现FM-1与解蛋白芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)亲缘关系最近，聚在了一起，序列同源性为99.86％(图4)。
综合菌体形态、染色特性、生化特性和16S rDNA序列分析，确定分离纯化的菌株FM-1为解蛋白芽孢杆菌。
实施例2菌株FM-1利用正构烷烃作为唯一碳源的生长测试
为了测试FM-1在以不同烷烃作为唯一碳源的培养基上的生长能力，在正构烷烃C12、C17作为唯一碳源的情况下，设置三个平行试验组。将在5mL YPD液体培养基中培养3天的菌液FM-1以8000rpm离心5min，收集菌体沉淀，然后用无机盐溶液洗涤两次，去除培养基中残余的碳源，之后将它们接种于C12和C17作为唯一碳源的100mL无机盐培养基中。锥形瓶中正构烷烃(C12、C17)的最终浓度是0.2％(v/v)。同时设置两组对照，一组含有细菌但不含烃，另一组含有烃但不含细菌，用于计算生长和降解的背景基线。所有的培养物菌液都在30℃的黑暗中振荡孵育(150rpm)。本研究中使用的所有化学品(正己烷、二氯甲烷、硅酸镁、氧化铝以及硅藻土)均为分析级(Aldrich，纯度>99％)。在培养的第4、7、11、14和21天取样，通过气相色谱(GC 2030，Shimadzu Research Laboratory，Shanghai，China)分析残余的正构烷烃含量，绘制降解曲线。在培养4d,7d,11d,14d和21d的各个时间点取培养液1mL，利用分光光度计(UV-1800型，翱艺仪器，上海)测定OD600吸光值，绘制生长曲线。
结果显示：当正构烷烃(C12和C17)作为菌株FM-1的唯一碳源时，可以观察到菌株FM-1的生长，在4天的滞后迟缓期后进入对数期，生长量开始逐渐上升；7d后上升幅度减缓，但仍保持上升趋势；14d生长处于最高峰值，然后曲线开始下滑，菌体繁殖速度受到限制，生长繁殖数量不断减少，最后进入衰亡期(图5,6)。根据气相色谱分析发现C12和C17的浓度在前14d下降很快，降解率达到了95.4％和89.2％，残量为3.8ppm和84.3ppm，然后进入稳定期(图5，6)。上述结果表明，菌株FM-1可以利用一些原油组分作为唯一碳源生长，该菌株具有很强的降解正构烷烃的能力。
实施例3FM-1降解原油能力的检测
30℃150rpm条件下，在YPD液体培养基中生长3天后，取5mL菌液8000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用双蒸水洗涤两次，并接种到含0.2％(w/v)原油的5mL无机盐培养基中。培养物在30℃黑暗中150rpm振荡培养7天，对西林瓶中的混合物进行取样，采用分光光度计法绘制标准曲线并测定降解后石油烃含量，气相色谱法检测残留的石油烃化合物的含量。设置两组对照，一组为加菌液不加原油的无机盐培养基，另一组为加原油不加菌液的无机盐培养基。加原油组用来测量石油烃含量。每组试验设置三组重复。取原油0.2g，石油醚(60～90℃，分析纯)进行2倍倍比稀释，测定OD600吸光值，绘制标准曲线，测定降解试验样品的OD600吸光值，计算降解率。
结果显示：通过紫外分光光度计法和气相色谱法测定原油培养基中剩余石油烃含量，计算菌株FM-1的降解率。原油倍比稀释后，利用紫外分光光度计OD600处的吸光值，绘制标准曲线(图7)，符合朗伯-比尔定律。取降解7d的培养液，测量OD600吸光值，对照组平均为x＝0.438，y＝2.0985，FM-1降解组平均吸光值为x＝0.3643，y＝1.7301，菌株FM-1对原油的七天降解率为17.6％(图8)。为了验证这一结果的可靠性，取另一组降解7d培养物溶于石油醚(60-90℃沸程)进行残量原油萃取，采用外标气相色谱法计算FM-1对原油的七天降解率为17.45％(图9)。
实施例4气相色谱法测定页岩油泥石油烃含量
根据中华人民共和国国家环境保护标准HJ 1021-2019《土壤和沉积物石油烃(C10-C40)的测定气相色谱法》中的实验原理，土壤和沉积物中的石油烃(C10-C40)经提取、净化、浓缩、定容后，用带氢火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪检测，根据保留时间窗定性，外标法定量。处理具体方法如下：将除水处理后的待测污油泥样本加入适量的硅藻土，搅拌均匀后全部放入玻璃纤维滤筒中，略微填实，放入索氏提取装置中，在圆底烧瓶中加入100mL二氯甲烷(农残级，科密欧)，提取16～18h，回流速度控制在8～10次/h，冷却后收集所有提取液。将提取液用旋转蒸发仪旋蒸，加入少量正己烷溶解，倒入到含有1cm活化硅酸镁的吸附柱中净化，收集净化液并用正己烷(农残级，科密欧)定容至10mL，装入气相瓶中降解后石油烃含量。
结果显示：为了测定菌株FM-1是否能够处理污油泥中的石油烃污染物，我们采用气相色谱法，测定经FM-1处理一段时间后的污油泥中石油烃残量，实验参照《土壤和沉积物石油烃(C10～C40)的测定：气相色谱法》环境标准，外标法定量。将处理组经萃取、浓缩、净化后，上样测定其中的石油烃残量，以此确定菌株FM-1降解效果。随着污油泥中石油烃污染物的减少，FM-1的菌数逐渐升高，在第21天达到最大值，之后细菌数量开始下降。前14d石油烃降解率达到最高，14d开始石油烃降解总量减少，趋于平缓(图10)。
比较各处理组峰面积可知，石油烃总量随着FM-1的增长而减少，当下降到一定程度时，总量不再减少，同时缺乏碳源的FM-1的菌数也会减少。根据FM-1对石油烃偏好分布图来看，C10～C30为主要降解化合物，其中，以C10、C11、C13以及C19降解效果最好，C15、C16、C17、C22以及C28降解效果次之(图11)。总体上，FM-1对污油泥中的石油烃污染物的降解率在7天可达55％，在28天可以达到91.5％(图11)。
Claims (9)
1.一种对石油污染物具有降解作用的微生物菌株，其特征在于，所述的微生物菌株为解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)，其16S rDNA测序所得序列为SEQ ID NO:1所示；所述的菌株于2023年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCCNo.27048，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种降解石油污染物的菌剂，其特征在于，所述的菌剂包含权利要求1所述的微生物菌株。
3.权利要求1所述的微生物菌株在制备降解石油污染物的制剂中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的石油污染为非常规页岩油或常规石油的污染物。
5.一种培养权利要求1所述微生物菌株方法，其特征在于，所述的方法中使用C10至C40石油烃作为唯一碳源培养所述的微生物菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的唯一碳源为C12或C17的正构烷烃。
7.一种降解石油污染物的方法，所述的方法是利用权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂发酵分解污染样品。
8.根据权利要求7所述的方法，所述的样品为石油污染样品。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，将所述污染样品加入到含有吐温80的无机盐培养基中，接种所述的微生物，在25～35℃黑暗中振荡培养，分别在培养后的7天、14天、21天和28天取样，利用气相色谱法测定污染样品中剩余石油烃的浓度。
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