CN113481128B

CN113481128B - 一株热带芽孢杆菌及其在还原Cr(VI)中的应用

Info

Publication number: CN113481128B
Application number: CN202110877626.0A
Authority: CN
Inventors: 姜岩; 彭蕾; 夏如馨
Original assignee: Chongqing Technology and Business University
Current assignee: Chongqing Technology and Business University
Priority date: 2021-08-01
Filing date: 2021-08-01
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-08-01
Also published as: CN113481128A

Abstract

本发明提供一种能够有效还原Cr(VI)的热带芽孢杆菌及用途。所述热带芽孢杆菌于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61680。该菌株在LB培养基中可耐受75～535mg/L的Cr(VI)，最大还原浓度为355mg/L。为实现工业化的应用，进一步对培养基进行优化，在以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基中，该菌株可耐受30～210mg/L的Cr(VI)，最大还原浓度为120mg/L。该菌株还可应用于Cr(VI)污染土壤生物处理；初始水溶性Cr(VI)浓度为267mg/kg、634mg/kg、1018mg/kg的铬污染土壤，播撒所述热带芽孢杆菌发酵液后在35℃下分别经6、12、30天处理后，Cr(VI)含量均可降至11.08mg/kg以下。

Description

一株热带芽孢杆菌及其在还原Cr(VI)中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能够有效去除Cr(VI)的热带芽孢杆菌及用途。

背景技术

随着工业化生产的进一步发展，重金属污染问题日趋严重。铬由于其良好的耐腐蚀性和硬度，被广泛应用于冶金、染料、电镀等行业。由于处理技术的不完善等因素导致含铬废物的处置问题未得到有效处置，使得铬进入到环境中，危害人类及动、植物。其有害成分主要是毒性较高的Cr(VI)，具有剧毒且强致癌。对于铬污染常用的处置方法有化学法、物理法、生物法。化学、物理法成本较高且易产生二次污染，植物法对环境要求高、生长周期较长。与前述方法相比，微生物法经济有效、操作方便且对生态环境友好，因此，利用微生物处理含铬工业废水及污染土壤已成为如今的研究热点。然而，从实际污染环境中分离筛选出具有强铬还原性的菌株具有一定难度。

环境中的铬主要以Cr(VI)和Cr(Ⅲ)的形式稳定存在，因此，常见处理方法是将Cr(VI)转化为Cr(Ⅲ)，两种价态的毒性及稳定性差别较大，Cr(VI)具有较好的流动性和溶解性，易于通过生物膜进入胞内，从而对细胞造成一系列遗传损伤。Cr(Ⅲ)毒性较前者小100倍，且难溶、不易被吸收。目前，虽然已分离出许多具有耐受Cr(VI)能力的菌株，但对于同时具有高耐铬性和还原性的菌株报道较少，且利用功能性菌株进行实际污染土壤/水体修复的报道则更少。这限制了微生物修复技术对于实际铬污染场地修复的广泛应用。

目前，国内外分离出的铬还原菌涵盖了真菌和细菌两大类，代表性菌种包括不动杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、放线菌属、短杆菌属、黑曲霉、木酶属等。专利申请CN 101418266A公开了《苍白杆菌CTS～325及其培养方法以及还原六价铬的应用》，其特征是通过向培养基中添加木糖、核糖、葡萄糖、果糖等的一种或其中任意几种的组合，该菌株可以将中、高浓度的Cr(VI)进一步完全还原，且在优化后的培养基中能够将含铬工业废水和铬渣浸出液中的Cr(VI)还原到污水排放标准。专利申请CN 104560738A公开了《还原六价铬的草酸青霉及其筛选方法》，其特征是该真菌从空气中获得，具有高耐铬性和还原性，且能够利用葡聚糖、蔗糖、水杨苷等多种不同碳源。专利申请CN 111659729A公开了《一种希瓦氏菌修复铬污染土壤的方法》，其特征是该菌株在厌氧条件下能够对不同浓度的铬污染土壤具有一定的修复效果。基于此，我们成功从铬污染土壤中分离出一株热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)，具我们了解，这是第一次报道热带芽孢杆菌具有高耐铬性和还原性，且对铬污染土壤具有较好的修复效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种在有氧条件下高效还原Cr(VI)性能的微生物菌种及其用途，以期为含铬污染场地的生物处理提供物质基础。

本发明为了实现上述目的而采取的技术方案如下：

一种从含铬污染土壤中筛选分离出的热带芽孢杆菌，该菌种对于中、高浓度的Cr(VI)具有较高的耐受、还原能力。该菌种已于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，广东微生物研究所，邮编：510075)，保藏编号为GDMCC No：61680，分类学名称：热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)。

热带芽孢杆菌GDMCC No：61680菌株特性如下：杆菌，菌落呈乳白色，不透明，菌落呈规则圆形，边缘整齐，革兰氏染色阳性，镜检图片如图1所示。该菌株可以利用葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢，对溶氧要求较高，当摇床转速低于120r/min时，在含铬培养基中的生长代谢受到明显抑制；pH在6.8～7.5范围内均保持较高活力，最适生长范围在7.0左右，在碱性环境中活力急剧下降；在20～40℃下，菌株保持良好的生长特性，但超过40℃，在Cr(VI)污染的环境中难以生长。

本发明所述热带芽孢杆菌在LB培养基中可耐受并还原75～355mg/L的Cr(VI)，在以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基(MM)中可耐受并还原30～120mg/L的Cr(VI)。

本发明所述热带芽孢杆菌还用于生物修复铬污染土壤，初始水溶性Cr(VI)含量为267mg/kg、634mg/kg、1018mg/kg的铬污染土壤，播撒所述热带芽孢杆菌发酵液后在35℃下，分别经6、12、30天处理后，水溶性Cr(VI)含量均可降至11.08mg/kg以下。

有益效果：

本发明提供了一种具有优良去除Cr(VI)性能的热带芽孢杆菌，能够在LB液体培养基中，对高浓度的Cr(VI)具有显著的还原效果。本发明考虑工业化应用的成本控制问题，对液体培养基进行优化，最终菌株能够在以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基中有效还原中、高浓度的Cr(VI)。并进一步利用该菌株去除Cr(VI)的特性，对含铬污染土壤提供一种可行的生物处理方法，处理后的Cr(VI)含量得到有效控制，水溶性Cr(VI)含量一般在11.08mg/kg以下，并且避免了以往的理化处理的诸多弊端及不适用性，该方法具有费用低廉、处理效果好、无二次污染、操作简便等优点，有效避免了环境污染，并节约了处理成本，对生物修复重金属污染的有序发展作出了有益贡献。

附图说明

图1为热带芽孢杆菌菌落形态图

图2为热带芽孢杆菌在LB培养基中的生长及Cr(VI)还原情况

图3为不同碳源对热带芽孢杆菌在MM培养基中还原Cr(VI)的影响

图4为热带芽孢杆菌在优化后的MM培养基中的Cr(VI)还原情况

图5为温度对热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的影响

图6为pH对热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的影响

图7为转速对热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的影响

图8为接种量对热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的影响

图9为热带芽孢杆菌对Cr(VI)污染土壤的还原能力

具体实施方式

下面通过具体的实施方案，进一步叙述本发明。除非特别说明，实施方式中未描述的技术手段均可以用本领域技术人员所公知的方式实现。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分、用量等进行的各种修改、替换、改进也属于本发明的保护范围，并且本发明所限定的具体参数应有可允许的误差范围。

除非特别说明，下述实施方式中所用的Cr(VI)污染土壤取自于重庆市沙坪区某化工厂旧址的污染场地，初始Cr(VI)浓度范围为267.52～4348.15mg/kg，初始pH值为6.8，初始含水量35.8％；实验复配模拟污染土壤取自高山无污染土壤。

除非特别说明，下述实施方式中所用热带芽孢杆菌为菌种GDMCC No：61680。

除非特别说明，Cr(VI)含量的测定方法如下。

(1)溶液中Cr(VI)含量测定参照《水质六价铬的测定》(GB7467-87)

溶液中Cr(VI)含量测定采用二苯碳酰二肼分光光度法进行检测，所用波长为540nm。具体步骤如下：

①取适量溶液于离心管中，离心。

②取50μL上清液于50mL比色管中，加水稀释至刻度线，摇匀。

③加入0.5mL硫酸溶液(1:1)和0.5mL磷酸溶液(1:1)，摇匀。

④再加入2mL显色剂，摇匀。

⑤静止5～10min后在540nm处用10mm比色皿以水作为参比，于540nm波长测定吸光度。

(2)土壤水溶性Cr(VI)含量测定

土壤中水溶性Cr(VI)含量采用二苯碳酰二肼分光光度法进行检测，所用波长为540nm。具体步骤如下：

①预处理：称取5g土壤样品于250mL三角瓶中，加入50mL去离子水，振荡1小时，离心，取上清液测定其中Cr(VI)含量。

②上清液Cr(VI)测定：采取溶液中Cr(VI)测定方法。

(3)Cr(VI)还原率的计算

除非特殊说明，所采用的培养基配方如下：

(1)LB培养基的配方：

蛋白胨：10g/L

酵母浸出液：5g/L

NaCl：10g/L

(2)无机盐培养基(MM)的配方：

NH₄NO₃：1g/L

K₂HPO₄：0.8g/L

NaCl：0.2g/L

CaCl₂：0.05g/L

MgSO₄：0.05g/L

FeSO₄：0.05g/L

MnSO₄·H₂0：0.01g/L

Na₂MoO₄·H₂0：0.01g/L

实施例1.热带芽孢杆菌在LB培养基中的生长情况和Cr(VI)还原能力检测

为研究热带芽孢杆菌对Cr(VI)的最大还原能力，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含不同浓度Cr(VI)的LB液体培养基(Cr(VI)初始浓度分别为75、145、215、285、355、415、475、535mg/L)中，初始pH值调为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行Cr(VI)还原的摇瓶实验，分别检测2个指标：1)样液中的Cr(VI)浓度并计算Cr(VI)还原率，Cr(VI)还原率的高低代表菌种在此浓度下还原能力的强弱；2)测定样液的OD_600nm值，OD_600nm值的大下反映了菌种在此浓度下的细胞生长情况及Cr(VI)耐受情况。

图2反映了热带芽孢杆菌对不同初始浓度Cr(VI)的还原情况，可见当初始浓度为75、145mg/L时分别处理12、24小时后实现完全还原。当初始浓度为215、285、355mg/L时处理72小时后，还原率分别为69.37％、44.17％、20.17％，当初始浓度为415、475、535mg/L时，细胞生长受到明显抑制，且无Cr(VI)还原作用。

实施例2.不同碳源对热带芽孢杆菌在MM培养基中还原Cr(VI)的影响

为研究碳源对热带芽孢杆菌在MM液体培养基中生长情况及Cr(VI)转化能力的影响，以不添加任何碳源的MM液体培养基为对照组，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL分别含10g/L的葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、乳糖为唯一碳源的MM液体培养基(Cr(VI)初始浓度为75mg/L)中，初始pH值调为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的摇瓶实验，分别检测2个指标：1)样液中的Cr(VI)浓度并计算Cr(VI)还原率；

2)样液的OD_600nm值。

图3反映了热带芽孢杆菌在含不同碳源的MM液体培养基中的生长情况和Cr(VI)还原能力，可见葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、乳糖对细胞生长具有一定的促进作用，且在处理5d后，还原率分别为69.04％、56.62％、45.64％、69.04％、11.57％。考虑其工业应用及成本问题，后续研究选用葡萄糖为助剂加入MM培养基中促进Cr(VI)的还原。

实施例3.热带芽孢杆菌在以葡萄糖为唯一碳源的MM培养基中还原Cr(VI)情况

为研究热带芽孢杆菌在优化后的MM液体培养基中的生长情况及Cr(VI)还原能力，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含不同浓度Cr(VI)的优化MM液体培养基(Cr(VI)初始浓度分别为30、60、90、120、150、180、210mg/L)中，初始pH值调为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的摇瓶实验，分别检测2个指标：1)样液中的Cr(VI)浓度并计算Cr(VI)还原率；2)测定样液的OD_600nm值。

图4反映了热带芽孢杆菌在含不同浓度Cr(VI)的优化MM液体培养基中的还原能力，可见当初始浓度为30、60、90、120mg/L时处理5d后，转化率分别为100％、84.53％、54.16％、24.33％。当初始浓度为150、180、210mg/L时，细胞无Cr(VI)还原作用。

实施例4.环境因子对热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的影响

1、温度对Cr(VI)还原的影响

为研究温度对热带芽孢杆菌Cr(VI)还原能力的影响，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含100mg/LCr(VI)的优化MM液体培养基中，温度分别设置为25、30、35、40、45℃，初始pH值为7.0，于160r/min下振荡培养。不同温度条件下，菌株在5d内的还原率如图5所示，在20～35℃范围内，培养液中Cr(VI)还原率随着温度升高而增大，当温度达到35℃时，Cr(VI)还原率最大，为49.04％；随着温度升高，Cr(VI)还原作用受到抑制，45℃时，还原率为14.86％。结果表明，该菌株对Cr(VI)还原的最适温度为35℃。

2、pH对Cr(VI)还原的影响

为研究pH对热带芽孢杆菌Cr(VI)转化能力的影响，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含100mg/LCr(VI)优化MM液体培养基中，pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，初始温度为35℃，于160r/min下振荡培养。不同pH条件下，菌株在5d内的还原率如图6所示，菌株在弱酸及偏中性条件下对Cr(VI)还原效果较好，碱性条件下对Cr(VI)还原具有一定的抑制作用，当pH为6.0、7.0时，Cr(VI)还原率分别为42.84％、49.04％，当pH为5.0、8.0、9.0、10.0时，Cr(VI)还原率分别为36.62％、39.72％、33.5％、21.06％。结果表明，该菌株对Cr(VI)还原的最适pH为7.0。

3、转速对Cr(VI)还原的影响

转速高低代表着溶氧量情况，对于好氧生物而言，一般来讲，转速越高，溶氧量越高，生长代谢越好，但达到饱和不再上升。为研究转速对热带芽孢杆菌Cr(VI)转化能力的影响，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含100mg/LCr(VI)优化MM液体培养基中，转速分别设置为70、100、130、160、190r/min，初始pH为7.0，于35℃下振荡培养。不同转速条件下，菌株在5d内的还原率如图7所示，当转速范围在70～160r/min内，培养液中Cr(VI)还原率随着转速升高显著增大，当转速高于160r/min时，Cr(VI)还原率有所降低，可能是培养瓶溶氧量达到饱和状态。结果表明，该菌株对Cr(VI)还原的最适转速为160r/min。

4、接种量对Cr(VI)还原的影响

为研究接种量对热带芽孢杆菌Cr(VI)转化能力的影响，分别以4％、6％、8％、10％、12％、14％的接种量将细胞第二代发酵液于60mL含100mg/LCr(VI)优化MM液体培养基中，初始pH为7.0，初始温度为35℃，于160r/min下振荡培养。不同接种量条件下，菌株在5d内的还原率如图8所示，当接种量在4～10％范围内，培养液中Cr(VI)还原率随着接种量升高显著增大，当接种量大于10％时，Cr(VI)还原率基本保持不变，维持在49.04％。结果表明，该菌株对Cr(VI)还原的最适接种量为10％。

实施例5.利用热带芽孢杆菌处理模拟Cr(VI)污染土壤

以高山无污染土壤为起始材料，以重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)为Cr(VI)源，复配初始水溶性Cr(VI)含量为267mg/kg、634mg/kg、1018mg/kg的铬污染土壤，在室内开展恒温生物修复研究，pH维持在为7.0左右。复配不同浓度污染土壤约900g置于塑料盒中，每个浓度设置3个平行样，将第二代发酵液(OD_600nm＝1.3±0.05)以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀，生物处理期间不定期补水使污染土壤湿度控制在30～50％，翻耕频率为12小时一次，并置于恒温35℃下进行处理。生物处理期间根据不同浓度污染土壤修复效果补加优化后的MM液体培养基，初期用量较少，一般为10mL/kg污染土壤；接近中期时，即Cr(VI)含量降至50％左右时，用量提高到20mL/kg污染土壤；在处理中后期Cr(VI)含量降至初始的20％～30％时，用量提高到30mL/kg污染土壤，且生物处理期间每3天测定Cr(VI)含量。菌株在30天内对不同浓度铬污染土壤的还原率如图9所示，267mg/kg、634mg/kg、1018mg/kg的铬污染土壤分别经6、12、30天处理后，Cr(VI)含量均可降至11.08mg/kg(平均浓度)以下。

Claims

1.一种具有Cr(VI)还原能力的热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)，其保藏编号为GDMCC No：61680。

2.如权利要求1所述的热带芽孢杆菌的用途，其特征在于，所述热带芽孢杆菌用于将Cr(VI)还原为Cr(Ⅲ)，降低铬污染毒性。

3.如权利要求2所述的热带芽孢杆菌的用途，其特征在于，所述热带芽孢杆菌在LB培养基中可耐受75～535mg/L的Cr(VI)，可还原Cr(VI)的最大浓度为355mg/L。

4.如权利要求2所述的热带芽孢杆菌的用途，其特征在于，所述热带芽孢杆菌在含10g/L葡萄糖的无机盐培养基中，可耐受30～210mg/L的Cr(VI)，可还原Cr(VI)的最大浓度为120mg/L，所述无机盐培养基的配方为：NH₄NO₃ 1g/L、K₂HPO₄0.8g/L、NaCl 0.2g/L、CaCl₂0.05g/L、MgSO₄ 0.05g/L、FeSO₄ 0.05g/L、MnSO₄·H₂O 0.01g/L、Na₂MoO₄·H₂O 0.01g/L。

5.如权利要求4所述的热带芽孢杆菌的用途，其特征在于，还原Cr(VI)的最适pH为7.0，最适温度为35℃，最适转速为160r/min。

6.如权利要求2所述的热带芽孢杆菌的用途，其特征在于，初始水溶性Cr(VI)浓度为267mg/kg、634mg/kg、1018mg/kg的铬污染土壤，播撒所述热带芽孢杆菌发酵液后在35℃下分别经6、12、30天处理后，Cr(VI)含量均可降至11.08mg/kg以下。