CN113680812B

CN113680812B - 具有Cr(VI)去除和石油烃降解的热带芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN113680812B
Application number: CN202110877627.5A
Authority: CN
Inventors: 姜岩; 彭蕾; 夏如馨
Original assignee: Chongqing Technology and Business University
Current assignee: Chongqing Technology and Business University
Priority date: 2021-08-01
Filing date: 2021-08-01
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2041-08-01
Also published as: CN113680812A; ZA202207654B

Abstract

本发明提供一种能有效共去除Cr(VI)‑石油烃的热带芽孢杆菌及用途。所述热带芽孢杆菌于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61680。在以酵母浸粉为唯一氮源的液体无机盐培养基中，该菌株能有效共去除50~100、1000~3000 mg/L的Cr(VI)‑废润滑油。Cr(VI)‑石油烃初始浓度为1305.28、9186.53 mg/kg的污染土壤经5个半月常温生物处理后，Cr(VI)含量降至6.37mg/kg以下，石油烃含量降至859.64 mg/kg以下。

Description

具有Cr(VI)去除和石油烃降解的热带芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能够有效同时去除Cr(VI)和降解石油烃的热带芽孢杆菌及用途。

背景技术

随着工业化的迅速发展，复合污染问题日益显著。主要是由电镀、油漆、石油炼制、金属冶炼等工业的副产品所造成，通常含有氮氧化物、多氯联苯、多环芳烃、重金属等，这些污染物一起进入环境中，形成复合污染场地。包括重金属之间的复合污染、重金属与无机物/有机物的复合污染等。其中，石油烃与重金属的复合污染尤为突出，成为研究的重点问题。重金属随石油烃污染相辅相生，是一直以来存在的问题，不仅是因为原油中本来就含有重金属。其次钻井开采、乳化油添加剂的使用及机械磨损等问题都会导致重金属与石油烃共存于环境中，而铬作为现代工业生产中常用的重金属，广泛存在于复合污染场地。

针对生物修复技术处理石油烃、重金属单一污染问题研究已逐渐成熟化，且经济有效、操作方便、对生态环境友好，使得生物修复技术成为当前研究的热点。已有许多微生物被发现具有修复石油烃、重金属的能力，但对于石油烃-重金属的复合污染生物修复研究不多。同时，可共降解复合污染物的微生物种类报道较少，可共去除的复合污染种类则更加有限。此外，由于复合污染的复杂性，从实际污染环境中分离筛选出具有能够共降解不同污染物的菌株则更具难度。

目前，国内外分离出的能够同时处理Cr(VI)及其它污染物的菌株，涵盖了真菌和细菌两大类，代表性菌种包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、无色杆菌属、希瓦氏菌属、曲霉属等。共去除的其它污染物涉及Cr、Zn、As等重金属；萘、五氯苯酚等有机物；硝酸盐等无机物。专利申请CN 111961633A公开了《具有六价铬去除和脱色的不动杆菌、分离纯化方法及应用》，其特征是该菌株可同时还原 Cr(VI)并对偶氮染料具有脱色作用，该研究对染料-重金属复合污染处理技术领域有极大的应用价值。专利申请CN 105838635A公开了《利用Pseudomonas fluorescens菌株LZ-4修复六价铬和萘复合污染环境的方法》，其特征是该菌株及其相关菌剂可以同时高效地还原低浓度的Cr(VI)并降解萘，这项研究表明多环芳烃-重金属复合污染生物修复技术具有良好的应用前景。基于此，我们成功从Cr(VI)-石油烃复合污染土壤中分离出一株热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)，据我们了解，这是第一次报道热带芽孢杆菌具有同时还原Cr(VI)和降解石油烃的能力，且对Cr(VI)-石油烃复合污染土壤具有较好的修复效果。

发明内容

本发明的目的是提供生物修复重金属-石油烃复合污染处理方法，以生物处理技术为切入点，以自主开发的微生物菌种资源为物质基础，提供一种利用热带芽孢杆菌对含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤进行生物去除的方法。

本发明为了实现上述目的而采取的技术方案如下：

一种含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤的生物去除方法，包括如下步骤：

1)种子液制备：

将斜面保藏的热带芽孢杆菌接种至LB培养基中经2次活化后，控制第二代发酵液OD_600nm＝1.3±0.05，用做接种体；

2)污染土壤预处理：

将采集的土壤样品进行筛选、粉碎、过筛处理，将土壤样品平铺开，厚度不超过30cm。

3)污染土壤生物共去除Cr(VI)和石油烃：

将第二代发酵液以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀；生物处理期间不定期补水使污染土壤湿度控制在30％～50％，且补水后不能有游离水析出；污染土壤处理可以在环境温度20～40℃进行。

进一步地，复合污染土壤恒温处理温度为35℃，常温处理温度为20～40℃左右。

进一步地，生物处理期间每天早、中、晚各翻土搅拌一次。

进一步地，生物处理期间补加相应的液体培养基，初次投加时，酵母浸粉用量为11g/L，无机盐培养基用量为10mL/kg；当Cr(VI)浓度降至初始一半时，酵母浸粉用量为7g/L，无机盐培养基用量为25mL/kg；在处理后期，Cr(VI)浓度降至10mg/kg以下，含油量降至初始的20％～30％时，仅添加无机盐培养基(以 NH₄NO₃为唯一氮源)，用量为20mL/kg。采用上述方法对Cr(VI)-石油烃复合污染土壤进行恒温、常温生物去除处理，恒温处理开始后每4天检测一次水溶性 Cr(VI)含量，每8天检测一次石油烃含量；常温处理开始后每15天左右检测一次水溶性Cr(VI)和石油烃含量。

采用上述方法对实际Cr(VI)-石油烃复合污染土壤进行生物处理，Cr(VI)-石油烃初始浓度分别为275.28、9085.46；691.87、9326.81；1173.96、10382.59mg/kg 的污染土壤于恒温生物处理下，Cr(VI)浓度分别经12、20、36天后均降至9.76 mg/kg以下；石油烃浓度分别经40、56、72天后均降至1890.85mg/kg以下。Cr(VI)- 石油烃初始浓度为1305.28、9186.53mg/kg的污染土壤于常温下经过5个半月的生物处理后，Cr(VI)含量降至6.37mg/kg以下，石油烃含量降至859.64mg/kg以下。(以上均为水溶性Cr(VI)浓度)

进一步地，本发明提供一种从含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤中筛选分离出的热带芽孢杆菌，该菌种对于Cr(VI)和石油烃具有共去除性。该菌种已于2021 年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，广东微生物研究所，邮编：510075)，保藏编号为GDMCC No：61680，分类学名称：热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)。

热带芽孢杆菌GDMCC No：61680菌株特性如下：杆菌，菌落呈乳白色，不透明，菌落呈规则圆形，边缘整齐，革兰氏染色阳性；pH在6.8～7.5范围内均保持较高活力，最适生长范围在7.0左右，在碱性环境中活力急剧下降；环境温度在20～40℃以内波动，菌株保持良好的生长特性，但超过40℃，细胞生长受到抑制；此外，该菌株在LB培养基中可耐受并还原75～355mg/L的Cr(VI)，且在以石油烃为唯一碳源的无机盐液体培养基中能够有效降解500～2500mg/L的废润滑油。

(1)菌种对废润滑油的降解能力研究。

为研究热带芽孢杆菌对于石油烃的耐受性及最大降解能力，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含不同浓度废润滑油的无机盐培养基(石油烃的初始浓度分别500、1000、1500、2000、2500mg/L)中，初始pH调节为 7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌降解废润滑油的摇瓶实验，分别检测2个指标：1)测定样液的OD_600nm值，OD_600nm值的大小反映了菌种在以废润滑油为唯一碳源的无机盐液体培养基中细胞生长情况；2)样液中的废润滑油浓度测定并计算废润滑油降解率，废润滑油降解率的高低代表菌种对废润滑油降解能力的强弱。

图1反映了热带芽孢杆菌以废润滑油为唯一碳源的生长情况及降解能力。可见，热带芽孢杆菌对不同浓度的废润滑油具有不同的降解效果，当初始浓度分别为500、1000、1500mg/L时，分别经5、7、9d后均能实现完全降解；当初始浓度为2000、2500mg/L时，经10d处理后，降解率分别为93.63％、87.31％。

(2)不同氮源对热带芽孢杆菌在MM培养基中生长及共去除Cr(VI)-石油烃的影响。

为研究氮源对热带芽孢杆菌在无机盐液体培养基(MM)中的生长情况和 Cr(VI)-废润滑油共去除能力的影响，以不添加任何氮源的MM液体培养基为对照组，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL分别含10g/L的牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为唯一氮源的MM 液体培养基(Cr(VI)初始浓度为50mg/L，废润滑油初始浓度为2000mg/L)中，初始pH值调为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌还原Cr(VI)的摇瓶实验，分别检测3个指标：1)样液中的Cr(VI)浓度并计算Cr(VI) 还原率；2)样液中的废润滑油浓度并计算废润滑油降解率；3)样液的OD_600nm值。

图2反映了热带芽孢杆菌在不同氮源MM液体培养基中的生长情况及共去除能力，可见有机氮源酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨对细胞生长和共去除有一定的促进作用，在处理108h后，Cr(VI)还原率分别提高了为73.12％、33.25％、 40.12％，石油烃降解率分别提高了32.46％、17.71％、10.18％。尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等无机氮源对Cr(VI)的还原和废润滑油的降解均无促进作用。后续研究中选用酵母浸粉为氮源助剂加入MM培养基中促进Cr(VI)-废润滑油的共去除。

(3)热带芽孢杆菌在以酵母浸粉为唯一氮源MM培养基中生长及共去除 Cr(VI)-石油烃的情况。

为研究热带芽孢杆菌在以酵母浸粉为唯一氮源MM液体培养基条件下生长情况及Cr(VI)-废润滑油共去除能力，将细胞第二代发酵液以10％的接种量接种于60mL含不同搭配浓度Cr(VI)-废润滑油的优化MM液体培养基(Cr(VI)-废润滑油初始浓度分别为50、1000；50、2000；50、3000；100、1000；100、2000； 100、3000mg/L)中，初始pH值调为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌共去除Cr(VI)-废润滑油的摇瓶实验，在处理108h后，分别检测2个指标：1)样液中的Cr(VI)浓度并计算Cr(VI)还原率；2)样液中的废润滑油浓度并计算废润滑油降解率；3)样液的OD_600nm值。

图3反映了热带芽孢杆菌在含不同浓度Cr(VI)、废润滑油搭配的优化MM 液体培养基中的生长情况及转化能力，可见不同浓度搭配下，均呈现出Cr(VI)- 石油烃的共去除，当Cr(VI)浓度一定时，500～2000mg/L废润滑油对Cr(VI)的还原无明显作用；当废润滑油浓度一定时，随着Cr(VI)含量的增加，对废润滑油降解具有一定的抑制作用。

有益效果：

本发明提供了一种具有同时还原Cr(VI)和降解废润滑油的热带芽孢杆菌，该菌株能够利用废润滑油为唯一碳源进行生长代谢，并对500～2500mg/L废润滑油具有较好的降解效果，在添加一定量酵母浸粉作为氮源助剂的作用下，可同时还原Cr(VI)和降解废润滑油，达到有效地共去除Cr(VI)和废润滑油的能力。本发明利用该菌株的高效还原Cr(VI)及降解废润滑油特性，对Cr(VI)-石油烃实际污染土壤提供了一种可行的生物处理方法，处理后的Cr(VI)和石油烃含量得到有效控制。恒温(35℃)条件下，水溶性Cr(VI)含量一般控制在9.76mg/kg以下，废润滑油含量一般在1890.85mg/kg以下，室温环境下，水溶性Cr(VI)含量降至6.37 mg/kg以下，石油烃含量降至859.64mg/kg以下，并且避免了以往的理化处理的诸多弊端及不适用性，该方法具有费用低廉、处理效果好、无二次污染、操作简便等优点。有效避免了环境污染，并节约了处理成本，对生物修复重金属-石油烃复合污染的有序发展作出了有益贡献。

附图说明

图1为热带芽孢杆菌以废润滑油为唯一碳源的生长情况及降解能力

图2为不同氮源对热带芽孢杆菌在MM液体培养基中生长及Cr(VI)-废润滑油共去除的影响

图3为热带芽孢杆菌在优化后的MM培养基中对不同浓度搭配Cr(VI)-废润滑油共去除情况

图4为热带芽孢杆菌恒温下对Cr(VI)-石油烃污染土壤共去除情况

图5为热带芽孢杆菌室温下对Cr(VI)-石油烃污染土壤共去除情况

具体实施方式

下面通过具体的实施方案，进一步叙述本发明。除非特别说明，实施方式中未描述的技术手段均可以用本领域技术人员所公知的方式实现。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分、用量等进行的各种修改、替换、改进也属于本发明的保护范围，并且本发明所限定的具体参数应有可允许的误差范围。

除非特别说明，下述实施方式中所用的Cr(VI)污染土壤取自于重庆市沙坪区某化工厂旧址的污染场地，初始Cr(VI)浓度为267.52～4348.15mg/kg，初始含油质量浓度为9000～10804mg/kg，初始pH值为6.8，初始含水量35.8％。

除非特别说明，下述实施方式中所用热带芽孢杆菌为菌种GDMCC No： 61680。

除非特别说明，Cr(VI)含量及石油烃含量的测定方法分别如下。

(1)溶液中Cr(VI)含量测定

溶液中低浓度Cr(VI)含量测定采用二苯碳酰二肼分光光度法进行检测，所用波长为540nm。具体步骤如下：

①取适量溶液于离心管中，离心

②取50μL上清液于50mL比色管中，加水稀释至刻度线，摇匀

③加入0.5mL硫酸溶液(1:1)和0.5mL磷酸溶液(1:1)，摇匀。

④再加入2mL显色剂，摇匀。

⑤静止5～10min后在540nm处用10mm比色皿以水作为参比，测定吸光度。

(2)土壤中水溶性Cr(VI)含量测定

土壤中水溶性Cr(VI)含量采用二苯碳酰二肼分光光度法进行检测，所用波长为540nm。具体步骤如下：

①预处理：称取5g土壤样品于250mL三角瓶中，加入50mL去离子水，振荡1小时，离心，取上清液测定其中Cr(VI)含量。

②上清液Cr(VI)测定：采取溶液中Cr(VI)测定方法。

(3)溶液中石油烃含量测定

溶液中石油烃含量测定采用紫外分光光度法测定，所用波长为256nm。具体步骤如下：

①将溶液全部倾入分液漏斗中，按照一定比例加入硫酸溶液(1:1)，氯化钠，摇匀使溶解。

②用石油醚洗涤采样瓶，将洗涤液倒入分液漏斗中，充分摇匀3min(注意放气)，静置分层，将水样放入原采样瓶中，收集石油醚萃取液于25mL容量瓶中。另取一定量的石油醚按上述步骤再萃取一次，合并萃取液于25mL容量瓶中，加石油醚定容至刻度线，摇匀。

③用无水硫酸钠脱水，以同批石油醚为参比，于256nm波长测定吸光度。

(4)土壤中石油烃含量测定

土壤中石油烃含量的检测方法采用超声-索氏提取-紫外法测量，所用波长为256nm。实验具体步骤如下：

①将样品研磨过100目筛称重后，置于已知质量的干燥三角瓶中。

②将三角瓶放置在105～110℃烘箱中4h，称重，此后每隔4h称重1次至恒重，计算质量差，由此求出土壤含水量。

③称取10g风干土样，用滤纸包好放入50mL离心管中，加入25mL石油醚，盖紧，超声，超声时间选取15min，超声萃取后，用镊子将纸包夹到索氏提取器中，提取3次，并收集每次的提取液，以同批石油醚为参比，于256nm波长测定吸光度。

(5)Cr(VI)转化率的计算

(6)石油烃降解率的计算

除非特殊说明，所采用的培养基配方如下：

(1)LB培养基的配方：

蛋白胨：10g/L

酵母浸出液：5g/L

NaCl：10g/L

(2)无机盐培养基(MM)的配方：

K₂HPO₄：0.8g/L

NaCl：0.2g/L

CaCl₂：0.05g/L

MgSO₄：0.05g/L

FeSO₄：0.05g/L

MnSO₄·H₂0：0.01g/L

Na₂MoO₄·H₂0：0.01g/L

NH₄NO₃：1g/L(仅用于土壤修复处理后期无机盐培养基，用于补充氮源)

实施例1.利用热带芽孢杆菌对Cr(VI)-废润滑油复合污染土壤生物去除的方法，包括以下步骤：

1)种子液制备：

斜面保藏的热带芽孢杆菌接种至LB培养基中，过夜培养14h左右，只要培养液不出现显著浑浊即可(一般OD_600nm＝0.8～1.3)；以0.5％～2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中进行二次活化培养，控制第二代培养液OD_600nm＝1.3±0.05，二代培养液用作接种体进行Cr(VI)-石油烃复合污染土壤生物去除使用；整个培养过程在35℃，160r/min条件下摇床培养。

2)污染土壤预处理：

采集的土壤样品进行筛选、粉碎、过16目筛处理后，将土壤样品平铺开，厚度不超过30cm，在处理前期向其中均匀喷洒以酵母浸粉为唯一氮源的无机盐培养基，在处理后期向其中均匀喷洒以NH₄NO₃为唯一氮源的无机盐培养基，搅拌混合均匀；

3)污染土壤生物共去除Cr(VI)-废润滑油：

将第二代发酵液(OD_600nm＝1.3±0.05)以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀；生物处理期间每天早、中、晚各搅拌一次，且不定期补水使污染土壤湿度控制在30％～50％；污染土壤处理可以在环境温度20～40℃左右进行，35～37℃处理效果更好。在生物处理期间，根据Cr(VI)及石油烃含量的变化生物处理期间补加相应的液体培养基，初次投加时，酵母浸粉用量为11g/L，无机盐培养基用量为10mL/kg；当Cr(VI)浓度降至初始一半时，酵母浸粉用量为7g/L，无机盐培养基用量为25mL/kg；在处理后期，Cr(VI)浓度降至10mg/kg 以下，含油量降至初始的20％～30％时，仅添加无机盐培养基(以NH₄NO₃为唯一氮源)，用量为20mL/kg。采用上述方法对Cr(VI)-石油烃复合污染土壤进行恒温(35℃)、常温(20～40℃左右)进行生物去除处理，恒温处理开始后每4 天检测一次水溶性Cr(VI)含量，每8天检测一次石油烃含量；常温处理开始后每 15天左右检测一次水溶性Cr(VI)浓度和石油烃含量。

实施例2.优化条件下恒温环境处理Cr(VI)-石油烃复合污染土壤实例

以采集的Cr(VI)-石油烃复合污染土壤(Cr(VI)浓度范围：267.52～4348.15 mg/kg；初始含油质量浓度为9000～10804mg/kg左右)为起始材料，按不同比例进行掺混，得到不同复合浓度的污染土壤，Cr(VI)-石油烃初始浓度分别为275.28、 9085.46；691.87、9326.81；1173.96、10382.59mg/kg。取以上不同搭配复合污染土壤各约3kg置于塑料培养格，每个搭配浓度设置3个平行样，分别记为1-1， 1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3。将第二代发酵液以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀。并通过实例1的方法添加相应液体培养基且生物处理期间不定期补水使污染土壤湿度控制在30～50％，翻耕频率为12 小时一次，并置于恒温35℃下进行处理。

图4反映了Cr(VI)-石油烃复合污染土壤在35℃恒温环境中的Cr(VI)还原及石油烃降解情况。Cr(VI)-石油烃初始浓度分别为275.28、9085.46；691.87、 9326.81；1173.96、10382.59mg/kg的污染土壤，Cr(VI)浓度分别经12、20、36 天后均降至9.76mg/kg(平均浓度)以下；石油烃浓度分别经40、56、72天后均降至1890.85mg/kg(平均浓度)以下。(以上均为水溶性Cr(VI)浓度)

实施例3.优化条件下室温环境温度处理Cr(VI)-石油烃复合污染土壤实例

以采集的Cr(VI)-石油烃复合污染土壤(Cr(VI)浓度范围：267.52～4348.15 mg/kg；初始含油质量浓度为9000～10804mg/kg左右)为起始材料，按一定比例进行掺混，得到Cr(VI)-石油烃初始浓度分别为1305.28、9186.53mg/kg。取以上复合污染土壤约3kg置于塑料培养格，设置3个平行样并做好标记，将第二代发酵液以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀。并通过实例 1的方法添加相应液体培养基且生物处理期间不定期补水使污染土壤湿度控制在30～50％，翻耕频率为12小时一次，并置于室温环境下进行处理(环境温度在20～40℃左右波动)，检测热带芽孢杆菌在不同处理时间的Cr(VI)及石油烃含量并计算Cr(VI)还原率和石油烃降解率。

图5反映了Cr(VI)-石油烃复合污染土壤在室温环境中的Cr(VI)还原及石油烃降解情况。相比于恒温(35℃)下的生物处理，在室温条件下Cr(VI)还原和石油烃降解则慢了许多。在经过5个半月的生物处理后，Cr(VI)含量降至6.37mg/kg 以下，石油烃含量降至859.64mg/kg以下，Cr(VI)和石油烃去除趋势与环境温度吻合，在温度较高的7～9月，环境平均温度为35～38℃左右，生物还原及降解速率较快。(以上均为水溶性Cr(VI)浓度) 。

Claims

1.一种含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤的生物处理方法，包括步骤如下：

1)种子液制备

将斜面保藏的热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)接种至LB培养基中经2次活化后，控制第二代发酵液OD_600nm＝1.3±0.05，用做接种体；所述热带芽孢杆菌的保藏编号为GDMCCNo：61680；

2)污染土壤预处理

采集的土壤样品进行筛选、粉碎、过筛处理后，将土壤样品平铺开，厚度不超过30cm，向其中均匀喷洒以酵母浸粉为唯一氮源的无机盐培养基，搅拌混合均匀；无机盐培养基配方为0.8g/L K₂HPO₄，0.2g/L NaCl，0.05g/L CaCl₂，0.05g/LMgSO₄，0.05g/L FeSO₄，0.01g/LMnSO₄·H₂0，0.01g/L Na₂MoO₄·H₂0；

3)污染土壤生物共去除Cr(VI)-石油烃

将第二代发酵液以10％(v/m)的用量，均匀播撒到污染土壤中，搅拌混匀；生物处理期间不定期补水使污染土壤湿度控制在30％～50％；污染土壤处理在环境温度20～40℃进行。

2.如权利要求1所述的一种含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤的生物处理方法，其特征在于，污染土壤分别置于35℃恒温、20～40℃常温进行生物处理且生物处理期间每早、中、晚各翻土搅拌一次。

3.如权利要求1所述的一种含Cr(VI)-石油烃复合污染土壤的生物处理方法，其特征在于，生物处理期间补加相应的液体培养基，初次投加时，酵母浸粉用量为11g/L，无机盐培养基用量为10mL/kg；当Cr(VI)浓度降至初始一半时，酵母浸粉用量为7g/L，无机盐培养基用量为25mL/kg；在处理后期，水溶性Cr(VI)浓度降至10mg/kg以下，含油量降至初始的20％～30％时，仅添加以硝酸铵为唯一氮源的无机盐培养基，硝酸铵用量为1g/L，无机盐培养基用量为20mL/kg。