CN113652368B - 一种耐重金属降解废机油的热带芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

针对现有背景技术的不足，本发明提供一种能够耐受重金属毒性并且有效降解废机油的热带芽孢杆菌及用途。所述热带芽孢杆菌于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61680。该菌株可以耐受高浓度重金属毒性，同时以废机油为碳源生长并降解废机油。该菌株可用于降解重金属存在土壤中的废机油。

Description

一种耐重金属降解废机油的热带芽孢杆菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐重金属有效降解废机油的热带芽孢杆菌及用途。

背景技术

传统的油污染问题依旧广泛存在且不断加剧。此外，在政策驱使下，以油企为代表的产污企业遗留下来的污染土地发展成为新问题。主要体现在两个方面：其一，随着我国工业化园区的建设，出现了很多企业搬迁“入园”事件，旧址土地一般都遭受了较为严重的油污染；其二，在国家严厉的环保政策及行业内部技术升级的驱使和推动下，部分“土炼油”和低产能等企业的关停也遗留了大面积油污染土壤，亟待开发行之有效的处理技术。

对于这类土壤的处置研究在以往基本忽略了重金属的干扰，而事实上油污染场地一定伴随着重金属污染。首先，原油本身就含有重金属，Zn、Cu、Pb、Cd、Ni、Mn、Co、V等金属元素与石油烃一起构成了石油的组分，二者相伴相生；其次，钻井开采过程中由于钻井液添加剂、低品质重晶石的使用，从而引入重金属污染；最后，对于润滑油而言，由于二烷基二硫代磷酸锌(ZDDP)等各类含金属添加剂的使用，以及机械磨损等过程均会混入重金属。同时，部分重金属污染土壤也会伴随着由机加工和其他操作引起的油污染，造成重金属与石油烃的复合污染。污染物渗透到土壤孔隙中并吸附在土壤颗粒上，随着毛细管和重力垂直移动，改变了土壤化学、物理、生物特性和组成。

与传统理化方法相比，生物法具有成本低廉、作用持久、易操作、无二次污染等优点。利用微生物处理环境中的污染物，主要物质基础就是获取具有高效降解能力的优势微生物。发明人发现，虽然从污染场地中种类多、数量大的微生物中筛选出具有降解特定污染物能力的菌种特别困难，但是相应的，经长期的污染物胁迫后筛选出的优势菌种具有良好的功能特性和环境适应性。

发明内容

本发明提供了一种在复合污染环境中具有优良除油性能的微生物菌种及其用途，以期为石油烃-重金属复合污染环境无害化处理提供物质基础。

本发明为了实现上述目的而采取的技术方案如下：

一种从废机油与重金属污染土壤驯化筛选分离出的具有多重抗性的热带芽孢杆菌，该菌种对于重金属有较强的耐受能力，对于废机油具有较高的生物降解能力。该菌种已于2021年 5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼，广东微生物研究所，邮编：510075)，保藏编号为GDMCCNo：61680，分类学名称：热带芽孢杆菌(Bacillustropicus)。

热带芽孢杆菌(GDMCCNo：61680)菌株特性如下：杆菌，菌落呈乳白色，不透明，菌落呈规则圆形，边缘整齐，革兰氏染色形态图如图1所示。革兰氏染色阳性。温度在15～45℃范围内均可以生长，最适生长温度为35℃、pH在5.0～9.0范围内均可以生长，最适生长pH 为7.0。可以耐受重金属毒性同时以废机油为唯一碳源生长。

本发明所述热带芽孢杆菌可应用于降解废机油；在35℃时，该菌株最大可降解废机油浓度为2089mg/L左右。

本发明所述热带芽孢杆菌可耐受Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的最大浓度分别约为535 mg/L、120mg/L、230mg/L、200mg/L左右。

本发明所述热带芽孢杆菌还可应用于对废机油与重金属复合污染土壤进行生物除油处理；初始含油量为9007-10804mg/L左右，共存有金属离子的土壤，播撒所述热带芽孢杆菌的发酵液后在35℃左右经75-105天的处理后，含油量可以控制在900mg/kg以内。

有益效果：

本发明提供了一种具有优良除油性能的热带芽孢杆菌，能够以废机油为唯一碳源生长，并可以耐受复合污染环境中重金属的毒性。本发明进一步利用该菌株的除油特性，对废机油污染土壤提供一种可行的生物处理方法，处理后的土壤含油量得到有效控制，并且避免了以往的理化处理的诸多弊端及不适用性，该方法具有费用低廉、处理效果好、无二次污染、操作简便等优点。

附图说明

图1：热带芽孢杆菌革兰氏染色形态图；

图2：热带芽孢杆菌降解废机油能力研究；

图3：热带芽孢杆菌对Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的耐受能力研究；

图4：热带芽孢杆菌对Cd(Ⅱ)的耐受能力研究；

图5：单金属胁迫下热带芽孢杆菌降解废机油能力研究；

图6：多金属胁迫下热带芽孢杆菌降解废机油能力研究；

图7：废机油与重金属复合污染土壤35℃恒温环境中的生物除油情况。

具体实施说明

下面通过具体的实施方案，进一步叙述本发明。除非特别说明，实施方式中未描述的技术手段均可以用本领域技术人员所公知的方式实现。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分、用量、尺寸、形状进行的各种修改、替换、改进也属于本发明的保护范围，并且本发明所限定的具体参数应有可允许的误差范围。

除非特别说明，下述实施方式中所用热带芽孢杆菌为菌种GDMCCNo：61680。

除非特别说明，水中含油量的测定方法如下：

(1)样品萃取

取水样全部倾入分液漏斗中，加入0.5％(v/v)硫酸溶液(1+1)，2％(m/v)NaCl，摇匀使溶解。用适量石油醚(沸程60～90℃或30～60℃；石油醚应不含芳烃类杂质。以纯水为参比在256nm透光率应大于85％，否则应纯化)洗涤采样瓶，将洗涤液倒入分液漏斗中，充分振荡摇匀，静置分层，将水样从分液漏斗下端放入原采样瓶中，收集石油醚萃取液于25mL具塞比色管中。另取适量石油醚按上述步骤再萃取一次，合并萃取液于25mL具塞比色管中，加石油醚至刻度线定容，摇匀。

(2)紫外分光光度法测量

于8支10mL具塞比色管中，分别加入机油标准溶液0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 8.0mL，用石油醚稀释至刻度，配成含机油为50、100、200、300、400、500、600、800mg/L的标准系列。于256nm波长，1㎝石英比色皿，以石油醚为参比，测量样品管和标准系列的吸光度。绘制标准曲线，从曲线上查出水样的废机油质量浓度。

(3)计算

水样中机油的质量浓度见公式：

式中：

ρ——水样中机油的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)。

ρ₁——从标准曲线上查得的机油质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)。

V₁——萃取液定容体积，单位为毫升(mL)。

V——水样体积，单位为毫升(mL)。

生物除油率的计算见公式：

除非特殊说明，所采用的培养基配方如下：

(1)LB培养基的配方：

蛋白胨：10g/L

酵母浸出液：5g/L

NaCl：10g/L

(2)无机盐培养基的配方：

NH₄NO₃：1g/L

KH₂PO₄：0.4g/L

K₂HPO₄：0.8g/L

NaCl：0.2g/L

CaCl₂：0.05g/L

MgSO₄：0.05g/L

FeSO₄：0.05g/L

MnSO₄·H₂0：0.01g/L

Na₂MoO₄·H₂0：0.01g/L

除非特别说明，土壤中含油量的测定方法参照《土壤和沉积物石油烃(C₁₀-C₄₀)的测定气相色谱法HJ1021-2019》。

实施例1

菌种对废机油最大降解能力研究。

为研究热带芽孢杆菌对于废机油的最大降解能力，将细胞发酵液(OD_600nm＝1.3±0.02) 以10％的接种量接种于100mL含不同浓度废机油的无机盐培养基(废机油的初始浓度分别为488、1017、2089、3070、4000mg/L)中，初始pH值调节为7.0，温度为35℃，于160r/min 下振荡培养进行热带芽孢杆菌降解废机油的摇瓶实验，分别监测2个指标：1)样液中的废机油浓度并计算废机油降解率，废机油降解率的高低代表菌种在此浓度下降解能力的强弱；2) 测定样液的OD_600nm值，OD_600nm值的大小反映了菌种在此浓度下的细胞生长情况。图2反映了热带芽孢杆菌降解不同初始浓度废机油的情况，可见当初始浓度分别为488、1017、2089 mg/L时处理120、168、264h后均实现完全降解。热带芽孢杆菌可完全降解废机油的最大浓度可达2089mg/L左右，含油量在4000mg/L以上降解效果不明显。

实施例2

菌种耐受Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)能力研究。

为研究热带芽孢菌对于Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)耐受能力，分别将细胞发酵液 (OD_600nm＝1.3±0.02)以2％的接种量接种于30mL含有不同浓度Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、 Pb(Ⅱ)的LB培养基(Cr(Ⅵ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的实际浓度分别为50mg/L～550mg/L梯度升高； Cd(Ⅱ)的实际浓度分别为2mg/L～120mg/L梯度升高)，初始pH值调节为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养24h进行热带芽孢菌耐受重金属Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的摇瓶实验，监测样液中OD_600nm值。图3-4反映了热带芽孢菌耐不同初始浓度Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、 Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的情况。可见热带芽孢杆菌对Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的最大耐受浓度分别为535mg/L、120mg/L、230mg/L、200mg/L。超过该浓度，热带芽孢杆菌生长受到抑制。

实施例3

菌种在单金属胁迫下废机油降解能力研究。

为研究热带芽孢菌在单金属胁迫下废机油降解能力，将细胞发酵液(OD_600nm＝1.3±0.02) 以10％的接种量接种于60mL含有不同浓度重金属的无机盐培养基(Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)、 Cd(Ⅱ)的浓度为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、 90mg/L)中，初始废机油浓度为500mg/L，初始pH值调节为7.0，温度为35℃，于160r/min 下振荡培养120h进行热带芽孢杆菌降解废机油的摇瓶实验，监测样液中的废机油浓度，图5 反映了热带芽孢杆菌在不同浓度、不同种类重金属胁迫下降解废机油的情况。可见当Pb(Ⅱ)、 Cu(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)浓度升高至50mg/L时，仍可以保持过半的降解效率。

实施例4

菌种在多金属胁迫下废机油降解能力研究。

为研究热带芽孢菌在多种金属胁迫下废机油降解能力，将细胞发酵液(OD_600nm＝1.3± 0.02)以10％的接种量接种于100mL含有不同种类重金属的无机盐培养基(Cr(Ⅵ)、Pb(Ⅱ) 与Cu(Ⅱ)的浓度为10mg/L；Cd(Ⅱ)的浓度为1mg/L)中，初始废机油浓度为500mg/L，初始pH值调节为7.0，温度为35℃，于160r/min下振荡培养进行热带芽孢杆菌降解废机油的摇瓶实验，监测样液中的废机油浓度。图6反映了热带芽孢杆菌在多种重金属胁迫下降解废机油的情况。可见初始含油量为500mg/L，接种10％所述热带芽孢杆菌的发酵液在35℃下培养后，当Pb(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)共存时，168h后废机油降解率达到79.00％；当Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)、 Cu(Ⅱ)共存时，168h后废机油降解率达到74.56％；在Cr(Ⅵ)、Cd(Ⅱ)共存时，120h后废机油降解率达到94.56％；在Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)共存时，120h后废机油降解率达到84.20％；在Pb(Ⅱ)、 Cu(Ⅱ)共存时，144h后废机油降解率达到78.59％。

实施例5

利用热带芽孢杆菌对含重金属的废机油污染土壤生物除油方法，包括如下步骤：

1)种子液制备：

将斜面保藏的热带芽孢菌接种至LB培养基中，经2次传代活化后，控制第二代发酵液 OD_600nm＝1.3±0.05，用做接种体；

2)土壤预处理：

土壤经粉碎过16目筛后平铺开，厚度不超过30cm，以无机盐培养基做助剂向其中喷洒，搅拌混合均匀；

3)土壤生物除油：

将第二代发酵液以8％(v/m)的用量，均匀播撒到土壤中，搅拌混匀；生物处理期间定期补水，使土壤含水率控制在30％-50％左右，以不超过50％为宜；土壤处理可以在环境温度 20-40℃中进行，最适温度为35℃。

进一步地，生物处理期间每天早、中、晚各翻土搅拌一次。

进一步地，根据处理周期和土壤的含油量，一般每隔一周至半个月补加上述无机盐培养基；初期用量较少，一般为15mL/kg左右；接近中期时，即含油量降至初始一半左右时，用量提高到25-35mL/kg；在处理中后期含油量降低至初始的30-40％时，用量提高到55mL/kg 左右。

采用上述方法对所采集的含Cr(Ⅵ)与废机油污染土壤，复配其他重金属离子模拟污染后，在35℃下进行恒温生物除油处理。处理开始后每15天检测一次含油量。如图7所示。对于初始含油为9073mg/kg，同时含有Cr(Ⅵ)783mg/kg、Cd(Ⅱ)8mg/kg、Cu(Ⅱ)60mg/kg的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液，105天后含油量降低至800mg/kg左右；对于初始含油为9007mg/kg，同时含有Cr(Ⅵ)798mg/kg、Pb(Ⅱ)60mg/kg、Cd(Ⅱ)8mg/kg的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液，105天后含油量降低至783mg/kg左右；对于初始含油为10500mg/kg，同时含有Cr(Ⅵ)581mg/kg、Cd(Ⅱ)8mg/kg的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液后，75天后含油量降低至890mg/kg左右；对于初始含油为10804 mg/kg，同时含有Cr(Ⅵ)658mg/kg、Pb(Ⅱ)60mg/kg的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液，90天后含油量降低至832mg/kg左右；对于初始含油为10000mg/kg，同时含有 Cr(Ⅵ)770mg/kg、Cu(Ⅱ)60mg/kg的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液，90天后含油量降低至650mg/kg左右；对于初始含油为10390mg/kg，同时含有Cr(Ⅵ)563mg/kg 的污染土壤，播撒8％所述热带芽孢杆菌的发酵液，75天后含油量降低至532mg/kg左右。

Claims (6)

1.热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)用于降解存在重金属污染环境中的废机油的用途，其中，所述热带芽孢杆菌的保藏编号为GDMCC No：61680。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述热带芽孢杆菌可以废机油为唯一碳源生长并降解废机油，最大降解浓度为2089mg/L。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在35℃环境中，所述热带芽孢杆菌可以在分别含有535mg/L Cr(Ⅵ)、120mg/L Cd(Ⅱ)、230mg/L Cu(Ⅱ)、200mg/L Pb(Ⅱ)的LB培养基中生长。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在无机盐培养基中，初始含油量为502mg/L，接种10％所述热带芽孢杆菌的发酵液后在35℃下培养，在10mg/L Pb(Ⅱ)、1mg/L Cd(Ⅱ)、10mg/L Cu(Ⅱ)共存时，168h后废机油降解率达到79.00％；在10mg/L Cr(Ⅵ)、1mg/L Cd(Ⅱ)、10mg/L Cu(Ⅱ)共存时，168h后废机油降解率达到74.56％；所述无机盐培养基的配方为：NH₄NO₃ 1g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.8g/L、NaCl 0.2g/L、CaCl₂ 0.05g/L、MgSO₄0.05g/L、FeSO₄ 0.05g/L、MnSO₄·H₂O 0.01g/L、Na₂MoO₄·H₂O 0.01g/L。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在无机盐培养基中初始含油量为498mg/L，接种10％所述热带芽孢杆菌的发酵液后在35℃下培养，在10mg/L Cr(Ⅵ)和1mg/L Cd(Ⅱ)共存时，120h后废机油降解率达到94.56％；在10mg/L Cu(Ⅱ)和1mg/L Cd(Ⅱ)共存时，120h后废机油降解率达到84.20％；在10mg/L Pb(Ⅱ)和10mg/L Cu(Ⅱ)共存时，144h后废机油降解率达到78.59％；所述无机盐培养基的配方为：NH₄NO₃ 1g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.8g/L、NaCl 0.2g/L、CaCl₂ 0.05g/L、MgSO₄ 0.05g/L、FeSO₄ 0.05g/L、MnSO₄·H₂O 0.01g/L、Na₂MoO₄·H₂O 0.01g/L。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，初始含油量为9007～10804mg/kg左右，共存有金属离子的土壤，播撒8％(v/m)所述热带芽孢杆菌的发酵液后，在35℃经75-105天的处理后，含油量可以控制在900mg/kg以内。

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