CN113322196B - 一株利用芳香族硝基化合物生产单细胞蛋白的甲基营养型芽孢杆菌 - Google Patents

一株利用芳香族硝基化合物生产单细胞蛋白的甲基营养型芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株利用芳香族硝基化合物生产单细胞蛋白的甲基营养型芽孢杆菌，所述菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22‑7‑6，该甲基营养型芽孢杆菌是从酒醅中筛选出的，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M 2020511。甲基营养型芽孢杆菌22‑7‑6在利用环境污染物生产单细胞蛋白方面具有广阔的应用前景。甲基营养型芽孢杆菌22‑7‑6可以降解硝基苯、硝基苯胺为唯一碳源和氮源生长，生长出的细胞经离心后获得单细胞蛋白。该方法在处理污水同时，实现单细胞蛋白的积累。

Description

一株利用芳香族硝基化合物生产单细胞蛋白的甲基营养型芽 孢杆菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株甲基营养型芽孢杆菌及其在降解芳香族硝基化合物中的应用，在处理污水中硝基化合物的同时，生产蛋白饲料。
背景技术
芳香族硝基化合物是重要的工业原料，广泛应用于火炸药、农药、杀虫剂、除草剂、染料、医药等产品的生产，芳香族硝基化合物也随之多途径地进入环境。芳香族硝基化合物被排放到土壤和水体环境中，可经皮肤、呼吸道或消化道吸收，被人体摄入后会严重危害人体健康甚至致癌，并造成不可估量的环境污染。同时，芳香族硝基化合物由于高熔点，高沸点和低蒸汽压等特点使其长时期难以被降解。因此，芳香族硝基化合物的微生物降解的研究受到了人们很大程度地关注，环境修复问题已经成为制约工业发展的重大问题之一。
目前降解芳香族硝基化合物的方法主要有物化法和生物法两大类：其中物化方法主要有挥发、水解、光氧化.焚化和吸附等，这些方法存在效率低、成本高和易产生二次污染等问题，并且并不能彻底解决污染问题，因而常作为一种预处理手段，与其他的处理方法联合使用；生物法是利用微生物或植物将芳香族硝基化合物转化为低毒或无毒物质的过程，是去除环境中芳香族硝基化合物及对受污染环境进行修复的有效途径。有着效率高,成本低的优点，近年来发展很快，引起研究者广泛关注，通过生物降解原理来处理被污染环境的生物修复技术能够筛选高效的苯环化合物降解菌。当生物法与生物强化技术和基因工程技术联用后，可有效提高芳香族硝基化合物的降解效率，具有广泛的应用前景，对于污染的防治和治理具有重要的实际意义。针对硝基芳香族化合物的生物治理，国内外研究者进行了不断的尝试，Aziz等采用酸化-好氧工艺处理硝基苯废水，可使废水中硝基苯的去除率达到95%以上，而单用好氧工艺，只能达到75%~85%的硝基苯去除率，其原因可能为酸化步骤生成了容易降解的苯胺。Fenton试剂氧化体系由过氧化氢和催化剂Fe2 +构成。Fenton试剂氧化法处理废水的原理是：在酸性溶液中、在Fe2 +催化剂作用下,H2O2能产生两种活泼的OH，从而引发和传播自由基链反应，加快有机物和还原性物质的氧化。余宗学采用Fenton试剂对间二硝基苯生产废水进行预处理，在最佳反应条件下,废水中硝基苯类化合物的转化率在89%以上，废水色度的去除率在80%以上。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6。
本发明的第二目的在于对含有芳香族硝基化合物的污水进行处理，采用微生物发酵工艺在降解芳香族硝基化合物的同时，生产菌体蛋白饲料。
本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6在降解芳香族硝基化合物，如硝基苯和硝基苯胺中的应用。
一株芳香族硝基化合物降解菌，其分类命名为：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020511，保藏日期为2020年9月18日。
所述菌株是从汤沟酒厂酒醅中筛选得到的，该菌株形态：革兰氏阳性，细胞形态为杆状，菌落形态为乳白色，透明，凸起，边缘规则。
培养温度范围为20-50 ℃，最佳30 ℃，pH范围为2.0-10.0，最佳为7.0，NaCl浓度范围为0-4.0%。
所述的甲基营养型芽孢杆菌22-7-6的培养条件为：
（1）平板培养：将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6接种于固体培养基中，在30-37℃培养12-24h，获得平板上的单菌落，所述NB固体培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7-8，溶剂为水；
（2）种子培养：从固体平板上挑取一单菌落接种至种子培养基，30-37℃，200rpm培养 8h，获得种子液，所述种子NB培养基浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH 7-8，溶剂为水。
（3）发酵培养：以1%~15%的接种量从种子培养基中吸取种子液入发酵培养基，30-37℃，200rpm培养 24-72 h，获得细胞培养液，所述发酵培养基浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH 7-8，溶剂为含硝基苯、硝基苯胺的污水。
一种微生物菌剂，所述菌剂包含甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6。
所述芳香族硝基化合物降解菌在降解芳香族硝基化合物中的应用。
所述的芳香族硝基化合物为硝基苯或者硝基苯胺。
所述芳香族硝基化合物降解菌在降解芳香族硝基化合物中的应用，包括如下步骤：
（1）平板培养：将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6接种于固体培养基中，在30-37℃培养12-24h，获得平板上的单菌落；
（2）种子培养：从固体平板上挑取一单菌落接种至种子培养基，30-37℃，200rpm培养 8h，获得种子液；
（3）发酵降解：以1%~15%的接种量从种子培养基中吸取种子液接入待降解的芳香族硝基化合物废水中，30-37℃，培养 24-72 h，降解芳香族硝基化合物，同时利用废水进行细胞生产，离心后生成菌体蛋白可用作蛋白饲料。
所述固体培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7-8，溶剂为水；所述种子培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH 7-8，溶剂为水。
所述废水中可以添加一定浓度的无机盐，例如可以是硝酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、七水硫酸镁等中的一种或多种，浓度为0~10 g/L。
所述芳香族硝基化合物废水中芳香族硝基化合物浓度为0.1~50 g/L。
所述菌株在降解芳香族硝基化合物的同时生产蛋白饲料。将甲基营养型芽孢杆菌22-7-6接入污水中，摇瓶培养离心后，对菌体进行干燥，得到蛋白饲料。
将种子液以1~15%的体积比接入到以污水为溶剂的培养基中，24~48 h后，培养基中未检测出硝基苯和硝基苯胺。（以污水为溶剂配置的培养基，溶质即为蛋白胨、牛肉膏和NaCl；也可以直接接种到含有硝基苯或者硝基苯胺的污水中）。所述降解处理为将甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)22-7-6的培养液，将种子液以10%的体积比接入到以污水为溶剂的培养基中，与含芳香族硝基化合物进行混合，甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)22-7-6在处理污水的同时，离心后生成菌体蛋白可用作蛋白饲料；甲基营养型芽孢杆菌能以培养基中硝基苯胺、硝基苯中的C为碳源，以硝基中的N为氮源合成自身细胞增殖所需的氨基酸和蛋白，从而实现底物的消耗利用和菌体的生长。
本发明的实验证明，本发明发现了一株甲基营养型芽孢杆菌甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6，经过研究发现甲基营养型芽孢杆菌22-7-6能够较高效率降解芳香族硝基化合物，48 h降解率100%，在处理污水的同时，离心后生成菌体蛋白可用作蛋白饲料；甲基营养型芽孢杆菌能以培养基中硝基苯胺、硝基苯中的C为碳源，以硝基中的N为氮源合成自身细胞增殖所需的氨基酸和蛋白，从而实现底物的消耗利用和菌体的生长。
有益效果：本发明提供的一株甲基营养芽孢杆菌22-7-6，是一类具有特殊降解性能的高效菌，能够高效降解硝基苯和硝基苯胺等环境污染物，以硝基芳香族化合物为唯一碳源、氮源进行生长，是用于芳香族硝基化合物染污治理的有效候选菌株。本发明的菌株作为芳香族硝基化合物降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。利用废水生产菌体蛋白，不仅节约资源，还有利于保护环境，具有极大的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1%，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3％，NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
NA培养基：是一种营养琼脂培养基，蛋白胨在NA培养基中的浓度为1％，牛肉膏在NA培养基中的浓度为0.3％，NaCl在NA培养基中的浓度为0.5％，琼脂在NA培养基中的浓度为2％，溶剂为水，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
实施例1菌株筛选
2020年8月，在超净工作台中，将采集自汤沟酒厂酒醅的样品放在无菌蒸馏水中，摇床震荡15 min左右制成细菌悬液，然后将混合物进行离心。
将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，37℃条件下培养24小时。此后菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，得到不同的单菌落，将这些单菌落在25-35℃培养24-48小时，收集单菌落然后接种到发酵培养基中。将这些菌株应用于芳香族硝基化合物降解实验。得到的一株芳香族硝基化合物降解能力强的菌株命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6。
该菌株形态：革兰氏阳性，细胞形态为杆状，菌落形态为乳白色，透明，凸起，边缘规则。
培养温度范围为20-50 ℃，最佳30 ℃，pH范围为2.0-10.0，最佳为7.0，NaCl浓度范围为0-4.0%。
实施例2 甲基营养型芽孢杆菌22-7-6细胞制备
所述的甲基营养型芽孢杆菌22-7-6细胞按如下步骤制备：
（1）平板培养：将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6接种于固体培养基中，在30-37℃培养12h，获得平板上的单菌落，所述NB固体培养基为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7-8，溶剂为水；
（2）种子培养：从固体平板上挑取一单菌落接种至种子培养基，30-37℃，200rpm培养 8h，获得种子液，所述种子NB培养基浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH 7-8，溶剂为水。
实施例3 甲基营养型芽孢杆菌22-7-6降解硝基苯
本实施例考察了甲基营养型芽孢杆菌22-7-6对不同浓度硝基苯的降解情况，主要步骤如下：
1）将甲基营养型芽孢杆菌22-7-6在富集培养基(蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，pH值为9)，温度为37℃，转速为200rpm条件下振荡培养，摇瓶培养至指数生长期。
2）按10%(V/V)的接种量分别接种到灭过菌的初始浓度为 0.1、1、10、50 g/L
的硝基苯作为唯一碳源无机盐培养基（硝酸铵 1.0 g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、磷酸氢二钠 1.5g/L、氯化钠 1.0g/L、七水硫酸镁 0.2g/L）中，在温度为37℃，转速为200rpm条件下振荡培养，摇瓶培养48小时。测定培养基中的硝基苯残留量，经过48小时培养，初始浓度硝基苯为 0.1、1、10、50 g/L 的培养基中均未检测出硝基苯。
实施例4 甲基营养型芽孢杆菌22-7-6降解硝基苯胺
本实施例考察了甲基营养型芽孢杆菌22-7-6对不同浓度硝基苯胺的降解情况，主要步骤如下：
1）将甲基营养型芽孢杆菌22-7-6在富集培养基(蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，pH值为9)，温度为37℃，转速为200rpm条件下振荡培养，摇瓶培养至指数生长期。
2）按10%(V/V)的接种量分别接种到灭过菌的初始浓度为 0.1、1、10、50 g/L 的硝基苯胺作为唯一碳源无机盐培养基（硝酸铵 1.0 g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、磷酸氢二钠1.5g/L、氯化钠 1.0g/L、七水硫酸镁 0.2g/L）中，在温度为37℃，转速为200rpm条件下振荡培养，摇瓶培养48小时。测定培养基中的硝基苯残留量，经过48小时培养，初始浓度硝基苯胺为 0.1、1、10、50 g/L 的培养基中均未检测出硝基苯胺。
实施例5 甲基营养型芽孢杆菌22-7-6降解硝基苯，生成菌体蛋白
将实施例2种子培养后的种子液接种到硝基苯的废水培养基中，硝基苯浓度为10g/L，经过48小时培养，培养液中检测不到硝基苯。底物硝基苯被100%降解，同时，培养液得到的菌体量为6.22 g/L，甲基营养型芽孢杆菌的菌体即是单细胞蛋白，其中蛋白含量占46.66%。硝基苯检测方法：高效液相色谱法。操作条件：流动相为V(乙腈):V(0.3 g/L乙酸铵+0.2 g/L乙酸)=70:30混合液，流速1 mL/min；硝基苯用紫外分析，波长为262 nm；色谱柱为Agilent C8柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)。
实施例6 甲基营养型芽孢杆菌22-7-6降解硝基苯胺，生成菌体蛋白
将实施例2种子培养后的种子液接种到硝基苯胺的废水培养基中，硝基苯胺浓度为20 g/L，经过48小时培养，培养液中检测不到硝基苯胺。底物硝基苯胺被100%降解。同时，培养液得到的菌体量为9.46 g/L，其中蛋白含量占49.77%。硝基苯胺检测方法：高效液相色谱法。操作条件：流动相为V(乙腈):V(0.3 g/L乙酸铵+0.2 g/L乙酸)=70:30混合液，流速1mL/min；苯胺用荧光分析，λex/λem=280/340 nm；色谱柱为Agilent C8柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

Claims (7)

1.一株芳香族硝基化合物降解菌，其分类命名为：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2020511，保藏日期为2020年10月3日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6。
3.权利要求1所述芳香族硝基化合物降解菌在降解硝基苯或者硝基苯胺中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株在降解硝基苯或者硝基苯胺的同时生产蛋白饲料。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）平板培养：将甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)22-7-6接种于固体培养基中，在30-37℃培养12-24h，获得平板上的单菌落；
（2）种子培养：从固体平板上挑取一单菌落接种至种子培养基，30-37℃，200rpm培养8h，获得种子液；
（3）发酵降解：以1%~15%的接种量从种子培养基中吸取种子液接入待降解的硝基苯或者硝基苯胺废水中，30-37℃，培养 24-72 h，降解硝基苯或者硝基苯胺，同时利用废水进行细胞生产，离心后生成菌体蛋白可用作蛋白饲料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述固体培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，pH 7-8，溶剂为水；所述种子培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH 7-8，溶剂为水。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述硝基苯或者硝基苯胺废水中硝基苯或者硝基苯胺的浓度为0.1~50 g/L。
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