JP2002281960A - 微生物を用いた六価クロムの還元方法 - Google Patents
微生物を用いた六価クロムの還元方法Info
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- JP2002281960A JP2002281960A JP2001090947A JP2001090947A JP2002281960A JP 2002281960 A JP2002281960 A JP 2002281960A JP 2001090947 A JP2001090947 A JP 2001090947A JP 2001090947 A JP2001090947 A JP 2001090947A JP 2002281960 A JP2002281960 A JP 2002281960A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物を用いて六価クロムを三価クロムに還
元する手段を提供する。 【解決手段】 六価クロムに対して高い還元能を有する
バシラス・ピュミルス GCRR8-3株。
元する手段を提供する。 【解決手段】 六価クロムに対して高い還元能を有する
バシラス・ピュミルス GCRR8-3株。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有毒な六価クロム
を無毒な三価クロムに還元する能力を持つ微生物、及び
その微生物を用いた六価クロムの還元方法に関する。
を無毒な三価クロムに還元する能力を持つ微生物、及び
その微生物を用いた六価クロムの還元方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、重金属による土壌、海洋などの汚
染が問題になっている。重金属の中でも六価クロムは人
体に対する毒性が強いため汚染による被害もより深刻な
ものになる。六価クロムを環境中から取り除く手段は既
に幾つか提案されているが、いずれも大規模な設備や多
大なエネルギーを必要とする。
染が問題になっている。重金属の中でも六価クロムは人
体に対する毒性が強いため汚染による被害もより深刻な
ものになる。六価クロムを環境中から取り除く手段は既
に幾つか提案されているが、いずれも大規模な設備や多
大なエネルギーを必要とする。
【０００３】最近、環境中から有害物質を除去する手段
として、微生物の分解能力を利用するバイオレメディエ
ーションが注目されている。バイオレメディエーション
は、大規模な設備や多大なエネルギーを必要としないの
で、コスト面などで優れている。バイオレメディエーシ
ョンにより、汚染環境中から六価クロムを取り除こうと
することは、従来から検討されてきているが、未だ実用
化には至っていない。実用化を妨げている主たる要因と
しては、微生物の六価クロム還元能力が低いことが挙げ
らている。現在までに多数の六価クロム還元菌が主とし
て土壌中から単離されてきたが、それらの六価クロム還
元能は低く、せいぜい数十μM濃度の溶液中の六価クロ
ムを還元できるにすぎない。
として、微生物の分解能力を利用するバイオレメディエ
ーションが注目されている。バイオレメディエーション
は、大規模な設備や多大なエネルギーを必要としないの
で、コスト面などで優れている。バイオレメディエーシ
ョンにより、汚染環境中から六価クロムを取り除こうと
することは、従来から検討されてきているが、未だ実用
化には至っていない。実用化を妨げている主たる要因と
しては、微生物の六価クロム還元能力が低いことが挙げ
らている。現在までに多数の六価クロム還元菌が主とし
て土壌中から単離されてきたが、それらの六価クロム還
元能は低く、せいぜい数十μM濃度の溶液中の六価クロ
ムを還元できるにすぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】微生物による六価クロ
ム処理を実用的なレベルで可能にするためには、より六
価クロム還元能の高い微生物が必要である。
ム処理を実用的なレベルで可能にするためには、より六
価クロム還元能の高い微生物が必要である。
【０００５】本発明は、このような技術的背景の下にな
されたものであり、従来の微生物よりも六価クロム還元
能の高い微生物を提供することを目的とする。
されたものであり、従来の微生物よりも六価クロム還元
能の高い微生物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、従来あまり注目さ
れていなかった海洋細菌の中に高い六価クロム還元能の
持つ微生物を見出し、この知見に基づき、本発明を完成
した。
解決するため鋭意検討を重ねた結果、従来あまり注目さ
れていなかった海洋細菌の中に高い六価クロム還元能の
持つ微生物を見出し、この知見に基づき、本発明を完成
した。
【０００７】即ち、本発明は、配列番号１に記載の塩基
配列と96％以上相同な塩基配列で表される16S rRNAを持
ち、六価クロム還元能を有するバシラス・ピュミルスに
属する微生物である。
配列と96％以上相同な塩基配列で表される16S rRNAを持
ち、六価クロム還元能を有するバシラス・ピュミルスに
属する微生物である。
【０００８】また、本発明は、上記微生物と六価クロム
とを接触させる工程を含む六価クロムの還元方法であ
る。
とを接触させる工程を含む六価クロムの還元方法であ
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明の微生物は、配列番号１に記載の塩
基配列と96％以上相同な塩基配列で表される16S rRNAを
持ち、六価クロム還元能を有するバシラス・ピュミルス
に（Bacillus pumilus）属するものである。このような
微生物の一例としては、バシラス・ピュミルス GCRR8-3
株を挙げることができる。この菌株の生理活性等は、実
施例２に記載されているとおりであり、また、16S rDNA
の塩基配列は配列番号１に示すとおりである。また、こ
の菌株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所
に受託番号FERM P-18271として寄託されている（寄託
日：平成13年3月22日）。
基配列と96％以上相同な塩基配列で表される16S rRNAを
持ち、六価クロム還元能を有するバシラス・ピュミルス
に（Bacillus pumilus）属するものである。このような
微生物の一例としては、バシラス・ピュミルス GCRR8-3
株を挙げることができる。この菌株の生理活性等は、実
施例２に記載されているとおりであり、また、16S rDNA
の塩基配列は配列番号１に示すとおりである。また、こ
の菌株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所
に受託番号FERM P-18271として寄託されている（寄託
日：平成13年3月22日）。
【００１１】本発明の微生物の培養は、バシラス・ピュ
ミルスに属する既知の菌株と同様の方法で行うことがで
きる。培地としては、例えば、マリンブロス培地、LB培
地などを用いることができる。培養時の温度は、25〜30
℃にするのが好ましい。
ミルスに属する既知の菌株と同様の方法で行うことがで
きる。培地としては、例えば、マリンブロス培地、LB培
地などを用いることができる。培養時の温度は、25〜30
℃にするのが好ましい。
【００１２】本発明の微生物は、六価クロムの還元に利
用することができる。六価クロムの還元方法は、本発明
の微生物を六価クロムと接触させる工程を含むものであ
れば特に限定されず、例えば、本発明の微生物を六価ク
ロムを含む溶液中で培養する方法を挙げることができ
る。この場合、六価クロムの濃度があまり高いと還元が
十分行われない場合があるので、溶液中の六価クロム濃
度は、0.1〜0.5mMとするのが好ましい。
用することができる。六価クロムの還元方法は、本発明
の微生物を六価クロムと接触させる工程を含むものであ
れば特に限定されず、例えば、本発明の微生物を六価ク
ロムを含む溶液中で培養する方法を挙げることができ
る。この場合、六価クロムの濃度があまり高いと還元が
十分行われない場合があるので、溶液中の六価クロム濃
度は、0.1〜0.5mMとするのが好ましい。
【実施例】以下実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれに限定されるものではないことは言うまでもな
い。 〔実施例１〕 六価クロム還元菌の単離 沖縄で採集した海水を10 mMの六価クロムを含む選択寒
天培地（表１）の上に直接添加し、30℃でインキュベー
トした。海水の添加から２ヶ月後、黄色の寒天培地上に
六価クロム分解菌の白色のコロニーが形成されていた。
このコロニーから六価クロム還元菌を単離し、単離した
菌株をGCRR8-3株と命名した。
明はこれに限定されるものではないことは言うまでもな
い。 〔実施例１〕 六価クロム還元菌の単離 沖縄で採集した海水を10 mMの六価クロムを含む選択寒
天培地（表１）の上に直接添加し、30℃でインキュベー
トした。海水の添加から２ヶ月後、黄色の寒天培地上に
六価クロム分解菌の白色のコロニーが形成されていた。
このコロニーから六価クロム還元菌を単離し、単離した
菌株をGCRR8-3株と命名した。
【００１３】
【表１】 〔実施例２〕 GCRR8-3株の同定 GCRR8-3株の16S rDNAをWeiburg, W. et al. (1991) J.B
acteriol.173, 697-703に記載の方法により決定した。
決定した塩基配列を配列番号１に示す。この配列をDDBJ
のデータベースで相同性検索を行ったところ、Bacillus
pumilusと99%の相同性を示した。
acteriol.173, 697-703に記載の方法により決定した。
決定した塩基配列を配列番号１に示す。この配列をDDBJ
のデータベースで相同性検索を行ったところ、Bacillus
pumilusと99%の相同性を示した。
【００１４】また、GCRR8-3株の生理活性等をBergey's
manual of systematic bacteriology vol.2に記載の方
法に基づいて調べた。この結果を以下に示す。 1. 酸化−発酵試験 酸化性、発酵性共に持つ 2.デンプン分解 デンプン分解能なし 3.リトマスミルク 色の変化及び凝固などなし 4. エスクリン分解テスト エスクリン分解能あり 5. DNase 産生試験 産生しない 6.生育可能pH範囲 5-9 7. 硝酸塩の還元性 なし 8. インドール産生性 なし 9. 色素の生産性 なし 10. 尿素分解性 なし 11. ゼラチン資化性 あり 12.Mg， Caの生育への必要性 なし 13.糖の利用試験
manual of systematic bacteriology vol.2に記載の方
法に基づいて調べた。この結果を以下に示す。 1. 酸化−発酵試験 酸化性、発酵性共に持つ 2.デンプン分解 デンプン分解能なし 3.リトマスミルク 色の変化及び凝固などなし 4. エスクリン分解テスト エスクリン分解能あり 5. DNase 産生試験 産生しない 6.生育可能pH範囲 5-9 7. 硝酸塩の還元性 なし 8. インドール産生性 なし 9. 色素の生産性 なし 10. 尿素分解性 なし 11. ゼラチン資化性 あり 12.Mg， Caの生育への必要性 なし 13.糖の利用試験
【００１５】
【表２】 以上の生理活性等は、Bacillus pumilusのそれと一致す
る。これらの事実から、GCRR8-3株は、 Bacillus pumil
usに属するものと判断した。 〔実施例３〕 GCRR8-3株による六価クロムの還元 100 mlの三角フラスコに20mlの通常のLB液体培地（1% N
aCl、表３）を加え、GCRR8-3株を植菌し、24時間、30℃
で前培養を行った。培養した菌液を10,000rpmで15分遠
心をし、上清を取り除いた。次に、0.1 mM又は 1.0 mM
の濃度でK2CrO4を含むLB液体培地(1% NaCl)を調製し
た。このK2CrO4含有LB液体培地10 mlに対し、GCRR8-3株
の菌体を25mg/mlになるように加えた。培養は、振盪機
で振盪（100 rpm、室温）させながら行い、菌体の添加
から、15分後、30分後、60分後、90分後、120分後、240
分後、24時間後に培養液をサンプリングした。サンプリ
ングは、1.5 mlのマイクロチューブを用いて毎回500μl
ずつ行った。10,000rpmで15分遠心することによりサン
プリングした培養液から上清を取り、以下の方法により
上清中のCr6+を定量した。
る。これらの事実から、GCRR8-3株は、 Bacillus pumil
usに属するものと判断した。 〔実施例３〕 GCRR8-3株による六価クロムの還元 100 mlの三角フラスコに20mlの通常のLB液体培地（1% N
aCl、表３）を加え、GCRR8-3株を植菌し、24時間、30℃
で前培養を行った。培養した菌液を10,000rpmで15分遠
心をし、上清を取り除いた。次に、0.1 mM又は 1.0 mM
の濃度でK2CrO4を含むLB液体培地(1% NaCl)を調製し
た。このK2CrO4含有LB液体培地10 mlに対し、GCRR8-3株
の菌体を25mg/mlになるように加えた。培養は、振盪機
で振盪（100 rpm、室温）させながら行い、菌体の添加
から、15分後、30分後、60分後、90分後、120分後、240
分後、24時間後に培養液をサンプリングした。サンプリ
ングは、1.5 mlのマイクロチューブを用いて毎回500μl
ずつ行った。10,000rpmで15分遠心することによりサン
プリングした培養液から上清を取り、以下の方法により
上清中のCr6+を定量した。
【００１６】適当量のジフェニルカルバジドをアセトニ
トリル溶液に溶かし、10mMのジフェニルカルバジド溶液
を調製した後、これを0.2Nの硫酸溶液で希釈し、1mMの
ジフェニルカルバジド溶液を調製した。培養上清を1mM
のジフェニルカルバジド溶液と1:1の比で混合し、10分
間室温でインキュベートした後、分光光度計を用いて可
視540nmにおける吸光度を測定した。また、培養上清の
代わりにK2CrO4含有LB液体培地を用いてジフェニルカル
バジド溶液添加後の吸光度を測定した。これらの測定値
から、培養上清中のCr6+濃度を算出した。この結果を図
１及び図２に示す。
トリル溶液に溶かし、10mMのジフェニルカルバジド溶液
を調製した後、これを0.2Nの硫酸溶液で希釈し、1mMの
ジフェニルカルバジド溶液を調製した。培養上清を1mM
のジフェニルカルバジド溶液と1:1の比で混合し、10分
間室温でインキュベートした後、分光光度計を用いて可
視540nmにおける吸光度を測定した。また、培養上清の
代わりにK2CrO4含有LB液体培地を用いてジフェニルカル
バジド溶液添加後の吸光度を測定した。これらの測定値
から、培養上清中のCr6+濃度を算出した。この結果を図
１及び図２に示す。
【００１７】0.1 mMのCr6+を含む培地では、15分後の時
点で既にCr6+の減少が始まっており、24時間後の時点で
は溶液中のCr6+濃度は0.0052mMにまで減少していた（図
１）。1.0 mMのCr6+を含む培地では、24時間後の時点で
はCr6+濃度は殆ど減少していなかったが、48時間後の時
点ではCr6+濃度は0.92mMにまで減少していた(図２)。
点で既にCr6+の減少が始まっており、24時間後の時点で
は溶液中のCr6+濃度は0.0052mMにまで減少していた（図
１）。1.0 mMのCr6+を含む培地では、24時間後の時点で
はCr6+濃度は殆ど減少していなかったが、48時間後の時
点ではCr6+濃度は0.92mMにまで減少していた(図２)。
【００１８】Pseudomonas aeruginosanをはじめとした
数種の細菌が六価クロムを還元することは既に知られて
いたが（Y.Ishibashi, et al. (1990) Appl. Environ.
Microbiol. 56, 2268-2270）、それらの細菌は高くても
0.04mM程度の濃度の六価クロムを還元するのにすぎなか
った。これに比べ、GCRR8-3株は、0.1mMの六価クロムを
ほぼ完全に還元していることから、既存の細菌に比べ約
2.5倍の還元能力を持つと考えられる。
数種の細菌が六価クロムを還元することは既に知られて
いたが（Y.Ishibashi, et al. (1990) Appl. Environ.
Microbiol. 56, 2268-2270）、それらの細菌は高くても
0.04mM程度の濃度の六価クロムを還元するのにすぎなか
った。これに比べ、GCRR8-3株は、0.1mMの六価クロムを
ほぼ完全に還元していることから、既存の細菌に比べ約
2.5倍の還元能力を持つと考えられる。
【００１９】
【表３】 〔実施例４〕 培地中の塩濃度の六価クロム還元に対す
る影響 培地中の塩濃度が六価クロムの還元にどのような影響を
与えるかを調べるために、LB液体培地のNaCl濃度を0%と
3%に調整し、実施例３と同様に培養上清中に残存するCr
6+の濃度を調べた。この結果を図３及び図４に示す。
る影響 培地中の塩濃度が六価クロムの還元にどのような影響を
与えるかを調べるために、LB液体培地のNaCl濃度を0%と
3%に調整し、実施例３と同様に培養上清中に残存するCr
6+の濃度を調べた。この結果を図３及び図４に示す。
【００２０】図３は培養開始時のCr6+濃度を0.02 mMと
した場合であり、図４は培養開始時のCr6+濃度を0.05mM
とした場合である。図中のLB、LB0、LB3はそれぞれ通常
のLB培地、NaClを含まないLB培地、3%NaClを含むLB培地
を示す。
した場合であり、図４は培養開始時のCr6+濃度を0.05mM
とした場合である。図中のLB、LB0、LB3はそれぞれ通常
のLB培地、NaClを含まないLB培地、3%NaClを含むLB培地
を示す。
【００２１】いずれの培養条件においても18時間後に溶
液中のCr6+濃度が大幅に減少し、0.001mM以下になって
いた。従って、塩濃度は、溶液中のCr6+の減少に対し、
殆ど影響を与えないと考えられる。
液中のCr6+濃度が大幅に減少し、0.001mM以下になって
いた。従って、塩濃度は、溶液中のCr6+の減少に対し、
殆ど影響を与えないと考えられる。
【００２２】
【発明の効果】本発明は、バシラス・ピュミルスに属す
る新規な微生物を提供する。この微生物は、有毒な六価
クロムを無毒な三価クロムに還元する能力を持つ。従っ
て、この微生物を汚染環境中に存在する六価クロムと接
触させることにより、環境中の六価クロムを無毒化する
ことが可能になる。
る新規な微生物を提供する。この微生物は、有毒な六価
クロムを無毒な三価クロムに還元する能力を持つ。従っ
て、この微生物を汚染環境中に存在する六価クロムと接
触させることにより、環境中の六価クロムを無毒化する
ことが可能になる。
【００２３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO., LTD. <120> BISEIBUTSU WO MOCHIITA ROKKAKUROMU NO KANGENHOUHOU <130> P01-001 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1437 <212> DNA <213> Bacillus pumilus <400> 1 cggacagaag gagcttgctc ccggatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 60 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccgggt agttccttga 120 accgcatggt tcaaggatga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg 180 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 240 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 300 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 360 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgcaa gagtaactgc ttgcaccttg 420 acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480 tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg 540 atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag 600 aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 660 gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt 780 ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca 840 agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 960 gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1080 gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1140 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggctgcga 1200 gaccgcaagg tttagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact 1260 cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1320 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg 1380 aggtaacctt tatggagcca gccgccgaag gtggggcaga tgattggggt gaagtcg 1437
【図１】GCRR8-3株の培養時間と残存Cr6+との関係を示
す図（Cr6+濃度0.1mM）。
す図（Cr6+濃度0.1mM）。
【図２】GCRR8-3株の培養時間と残存Cr6+との関係を示
す図（Cr6+濃度1mM）。
す図（Cr6+濃度1mM）。
【図３】種々のNaCl濃度におけるGCRR8-3株の培養時間
と残存Cr6+との関係を示す図（Cr6+濃度0.02mM）。
と残存Cr6+との関係を示す図（Cr6+濃度0.02mM）。
【図４】種々のNaCl濃度におけるGCRR8-3株の培養時間
と残存Cr6+との関係を示す図（Cr6+濃度0.05mM）。
と残存Cr6+との関係を示す図（Cr6+濃度0.05mM）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１に記載の塩基配列と96％以上
相同な塩基配列で表される16S rRNAを持ち、六価クロム
還元能を有するバシラス・ピュミルスに属する微生物。 - 【請求項２】 バシラス・ピュミルスに属する微生物
が、バシラス・ピュミルス GCRR8-3株である請求項１記
載の微生物。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の微生物と六価クロ
ムとを接触させる工程を含む六価クロムの還元方法。 - 【請求項４】 微生物と六価クロムとを接触させる工程
が、請求項１又は２記載の微生物を六価クロムを含む溶
液中で培養することである請求項３記載の六価クロムの
還元方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001090947A JP2002281960A (ja) | 2001-03-27 | 2001-03-27 | 微生物を用いた六価クロムの還元方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001090947A JP2002281960A (ja) | 2001-03-27 | 2001-03-27 | 微生物を用いた六価クロムの還元方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002281960A true JP2002281960A (ja) | 2002-10-02 |
Family
ID=18945659
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001090947A Pending JP2002281960A (ja) | 2001-03-27 | 2001-03-27 | 微生物を用いた六価クロムの還元方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002281960A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112159786A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-01 | 河北科技大学 | 一种Cr(Ⅵ)还原菌株C6及其培养条件和应用 |
| CN113481128A (zh) * | 2021-08-01 | 2021-10-08 | 重庆工商大学 | 一株热带芽孢杆菌及其在还原Cr(VI)中的应用 |
| CN115404178A (zh) * | 2021-05-28 | 2022-11-29 | 四川大学 | 一株赖氨酸芽孢杆菌在六价铬还原中的应用 |
-
2001
- 2001-03-27 JP JP2001090947A patent/JP2002281960A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN112159786A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-01 | 河北科技大学 | 一种Cr(Ⅵ)还原菌株C6及其培养条件和应用 |
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| CN113481128A (zh) * | 2021-08-01 | 2021-10-08 | 重庆工商大学 | 一株热带芽孢杆菌及其在还原Cr(VI)中的应用 |
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