JP4540211B2 - バチルス・サブチリスに属する新規微生物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は新規微生物に関し、さらに詳しくは有機性廃液および/または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解することができるバチルス・サブチリス(Bacillus Subtilis)に属する新規微生物に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、活性汚泥による有機物分解は汚泥中に生息する微生物の集団でなされており、特に分解性の高い菌に着目してこれらの菌類を積極的に有機物の分解に利用した例はない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
近年、汚泥を発生しない屎尿処理場などから排出される生物性汚泥から、プロテアーゼ活性を示すを多くの菌種が単離されており、これらの菌の利用により、廃水および有機性/生物性汚泥に含まれるタンパク質成分を分解し、汚泥の発生量を抑える効果が期待されている。
本発明の課題は、有機性廃液および/または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解することができるプロテアーゼ活性の高い性能を備えた新規微生物を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、有機性廃液および/または生物性汚泥中に含まれるタンパク質成分を効率的に分解する機能を備えた微生物を検索すべく鋭意検討を重ねた結果、所望の特性を有した新規微生物を単離し、その種まで同定するに到り、本発明を完成するに至ったものである。すなわち、本願で特許請求される新規微生物は以下のとおりである。
【0005】
(1)受託番号FERM P−18015として寄託されている新規微生物バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis) X−2。
【0007】
本発明によって取得された新規微生物バチルス・サブチリスX−2の生物学的特徴を決定するために、この微生物が有する菌学的性質、すなわちA.形態的性質、B.培地における生育状態、C.生理学的性質およびD.遺伝学的性質に関して検定を行った。その結果を以下に示す。
【0008】
A.形態的性質
(1) 細胞の形および大きさ:培地としてニュートリエントブロス(OxidCM−1)0.8%、グルコース0.8%、乾燥酵母エキス0.02%および食塩0.6%(いずれもW/V%)に寒天1.4W/V%を加えたものからなる寒天培地において32℃で培養を行った。24時間培養したところ、1.5×5μmのグラム陽性の桿菌であり、さらに室温で5日間培養を行った場合、長い連鎖上のものが多く観察された。
【0009】
(2) 運動性の有無:運動性は懸濁標本で確認することができ、周毛性の運動であった。
(3) 胞子の有無:芽胞を形成し、形は卵円形で菌体より膨脹している。
(4) グラム染色:コロニー形成の初期のサンプリングで染色性を示した。この時点での細胞は栄養細胞であり、胞子化は認められなかった。
B.培地における生育状態 (1)標準寒天培地:32℃24時間培養のコロニーの形態は乳白色のしわのあるコロニーであった。
【0010】
C.生理学的性質
(1) グラム染色性:+、(2) 硝酸塩の還元能:+、(3) 脱窒反応:+、(4) VPテスト:+、(5) インドールの生成:+、(6) デンプンの加水分解:+、(7) 大豆油分解性:+、(8) 無機窒素源の利用:+、(9) オキシダーゼ:+、(10)カタラーゼ:+、
(11)生育の範囲:温度13〜50℃
生育温度について、低温側は液体培地を用い、5〜15℃まで1℃刻みで設定し、24時間での生育を観察した。高温側は40、45、50、55℃に設定し、液体培地と斜面培地で24時間での生育を観察した。
(12)酸素に対する態度:好気性、(13)O−F試験:グルコース −+、(14)アンモニアの利用性:+、(15)NaHSの分解性:+
【0011】
D.遺伝学的性質
G+C含量は42.7モル%で、Bacillus subutilisの文献値(Holt J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed., Vol., ed. By P.H.A. Sneath, Williams$ Wilkins, Baltimore, 1986, pp.1104-1139 ) の範囲内であった。
測定方法はあらかじめMgSO4 ・4〜5H2 OとMnSO4 を用いてそれぞれ1200mg/l溶液を調整し、減菌後の培地に無菌的にMg+ として4mg/l、Mn2+として1.5mg/lとなるように加え、27℃で4〜5日間胞子形成直前まで培養を行った。遠心分離して得た菌体は0.1MEDTA/0.15M NaClで洗浄し、−20℃保存した。一般的な方法に従ってDNAを抽出した。DNAの分解はDNA GC分析キット(ヤマサ醤油社製)を用いて50℃で1時間行った。G+C含量の分析はHPLC(島津製作所製LC−9AおよびSDPD−6A)を用い、270nmで検出し、カラムはAQ−312((株)ワイエシイ製、6.0×150mm)を用い、10mM H3 PO4 −10mM H2 PO4 (pH3.5±0.01)、流量1.8ml/minで溶出させた。
【0012】
遺伝学的解析方法として16SリボゾームRNAの解析を採用した。この解析は、一般に行われている方法で回収した菌のDNAを、PE Applied Biosystems 社製のキットを使用し、このプロトコールに従って16SrRNAの増幅を行った。なお、使用したプライマーは5f、338f、515f、776f、1087f、1174fおよび357r、531r、810r、1104r、1193r、1540rである。PCRの温度条件は95℃30秒、60℃30秒、72℃45秒で30cycle行った。シークエンスはABI PRISM 310を使用して解析した。得られたシークエンスデータはPE Applied Biosystems 社のMicroSeq data baseを使用してバチルス・サブチリスに対する相同性を算出した。相同性は99.84%であった。解析した塩基配列は5baseから1540baseであり、配位番号1であった。
【0013】
上記した新規微生物の諸性質はバチルス・サブチリスが所有する諸性質とよく対応したのでバチルス・サブチリスX−2(Bacillus subtilis X-2)と命名した。
なお、得られたバチルス・サブチリスX−2は、平成12年9月4日に本願出願人によって茨城県つくば市東町1丁目1番3号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にて寄託され、受託番号FERM P−18015が付与されている。本発明はこの寄託微生物自体はもちろん、前述した能力を有するその変異体および子孫をも含むものである。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明における新規微生物バチルス・サブチリスX−2は以下のようにして単離した。
採取した汚泥をブレンダーで10秒間分散した汚泥懸濁液0.1mlを減菌した0.6%食塩水で102 、104 、106 倍希釈した。各希釈液0.1mlを後述のA培地からなる寒天平面に撒き、32℃で培養した。細菌の識別はコロニーの形状、菌体の顕微鏡観察および生化学試験によった。また、平面や斜面でBacillus属菌は胞子を形成するので、コロニーが出現してから2〜5日後に各コロニー菌株の胞子形成の有無を判定した。複数の菌株がコロニー中で混じっているときはさらに希釈法で分離した。グラム陰性菌とBacillus属菌が希釈法で分離できなかったときは、下記のA培地からなる斜面で培養して生じたBacillus属菌の胞子を減菌した0.6%食塩水に懸濁し、85℃10分間加熱して分離できないグラム陰性菌を除いて単離した。
A培地組成
ニュートリエントブロル(Oxoid CM−1) 8g
グルコース 8g
NaCl 6g
乾燥酵母エキス(Difco) 0.2g
寒天 14g
DW 1000ml
【0015】
単離した3種の菌株X−1、X−2、X−10について、タンパク質分解性の試験を行った。タンパク質分解試験は、クックドミート(日水製薬社製、OcidCM−81を使用)200mgを0.5%食塩水6mlに懸濁し、32℃8日間振とう培養して残留する懸濁物質量を計測し、懸濁物質消費率を下記式により求めることにより行った。
懸濁物消費率(%)=[(A−B)/A]×100
A:加えたクックドミート懸濁物質量
B:残留した懸濁物質量
【0016】
クックドミートのタンパク質分解性試験結果を下記に示したが、菌株X−2の懸濁物質消費率が非常に高く、プロテアーゼ活性の高い菌株であることが判明した。この菌株X−2をバチルス・サブチリスX−2と命名した。バチルス・サブチリスX−2は配列番号1の16SrRNAの核酸塩基配列を有していた。
【0017】
【発明の効果】
本発明の新規微生物バチルス・サブチリスX−2によれば、プロテアーゼ活性の高い性能を備えているため、有機性廃液および/または生物性汚泥に含まれるタンパク質を分解し、汚泥の発生量を大幅に低減することができる。
【0018】
【配列表】
Claims (1)
- 受託番号FERM P−18015として寄託されている新規微生物バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis) X−2。
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